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    多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵條件研究

    2017-03-23 03:51:41朱海霞馬永強(qiáng)魏有海郭青云
    關(guān)鍵詞:孢量氮源固態(tài)

    朱海霞,馬永強(qiáng),魏有海,郭青云

    (青海省農(nóng)林科學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016)

    多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵條件研究

    朱海霞,馬永強(qiáng),魏有海,郭青云

    (青海省農(nóng)林科學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016)

    選用高效除草活性的生防菌株多孢木霉(Trichodermapolysporum)HZ-31菌株為對(duì)象,研究該菌株最適碳源、氮源、固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選、固-液發(fā)酵條件的優(yōu)化。結(jié)果表明:HZ-31最適碳、氮源為小麥粉,最適氮源為(NH4)2SO4,在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)6.17×108mL-1,最適碳氮源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)到4.45×109mL-1。HZ-31最佳產(chǎn)孢的固態(tài)基質(zhì)為麥稈糠,適宜的接種量是體積分?jǐn)?shù)為40%。正交優(yōu)化培養(yǎng)試驗(yàn)條件得出該菌最適培養(yǎng)基質(zhì)含水量為37%,最適溫度為23 ℃,發(fā)酵最適時(shí)間為8 d。

    多孢木霉HZ-31;固態(tài)發(fā)酵基質(zhì);固-液發(fā)酵條件

    菌株HZ-31分離于自然感病的大刺兒菜,由青海省農(nóng)科院植保所有害生物綜合防治實(shí)驗(yàn)室提供保存。前期研究結(jié)果顯示,該菌株在PDA平板上培養(yǎng)7 d后,表面產(chǎn)生致密的白色分生孢子,分生孢子梗排列成半球形或墊狀的皰狀物,分生孢子梗有隔膜,通常高度分枝,以2~4個(gè)輪生,直角,分生孢子長(zhǎng)橢圓形或球形,光滑,結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果,判斷菌株HZ-31為多孢木霉(Trichodermapolysporum)。離體條件下測(cè)定其對(duì)禾本科雜草野燕麥種子萌發(fā)的影響,結(jié)果表明經(jīng)該菌發(fā)酵濾液處理后,野燕麥種子發(fā)芽率為0,菌株對(duì)種子萌發(fā)抑制率達(dá)100%;噴施于盆栽野燕麥葉片后可導(dǎo)致葉片發(fā)黃枯萎甚至整株枯死,接種5 d后對(duì)野燕麥的發(fā)病率和病情指數(shù)分別達(dá)到90.0%和82.0。同時(shí),該菌株對(duì)藜、豬殃殃等農(nóng)田闊葉雜草亦表現(xiàn)出不同程度的除草活性,且對(duì)青海省主栽作物小麥(TriticumaestivumL.)、蠶豆(ViciafabaL.)、豌豆(PisumsativumL.)安全性評(píng)價(jià)結(jié)果表現(xiàn)為安全[1]。生防菌株HZ-31具有開發(fā)成為小麥、蠶豆、豌豆田真菌除草劑的潛力。

    碳氮源、基質(zhì)含水量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等因素是發(fā)酵過程中重要的檢測(cè)和控制參數(shù),可直接影響到菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成[2]。對(duì)菌株HZ-31的發(fā)酵生產(chǎn)工藝來說,明確各因素與菌株發(fā)酵生產(chǎn)之間的關(guān)系,將為該菌的規(guī)?;a(chǎn)和劑型研究提供理論依據(jù)。因此,本研究運(yùn)用單因素法確定生防菌株最適碳、氮源和固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),正交試驗(yàn)開展最佳基質(zhì)組合篩選和菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn),明確固液發(fā)酵條件與菌株發(fā)酵生產(chǎn)之間的關(guān)系,為該菌的大規(guī)模生產(chǎn)提供必要的工藝參數(shù),控制并改進(jìn)發(fā)酵工藝條件,使其大量繁殖,為實(shí)現(xiàn)生物菌劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及進(jìn)一步的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    HZ-31多孢木霉(Trichodermapolysporum)分離于自然感病的大刺兒菜,由青海省農(nóng)科院植保所有害生物綜合防治實(shí)驗(yàn)室提供保存。

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.2.1 最適碳、氮源的確定 以PDA培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行碳氮源單因素試驗(yàn),用等質(zhì)量的玉米粉(C1)、小麥粉(C2)、蔗糖(C3)、葡萄糖(C4)作為碳源。氮源KNO3(N1)、大豆粉(N2)、酵母膏(N3)、(NH4)2SO4(N4)為氮源,按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的添加量,將各碳氮源添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,配制成不同的碳氮源培養(yǎng)基[2-4],取經(jīng)活化直徑8 mm的菌餅作為接種體接入皿中。以不添加碳氮源的基質(zhì)作為對(duì)照,每處理重復(fù)3個(gè)。血球計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量,同時(shí)用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)內(nèi)測(cè)孢子懸浮液OD吸光值,確定篩選效果[5]。

    1.2.2 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)篩選 選用菜籽餅、麥稈糠、羊糞、麥麩、珍珠巖和蛭石作為基質(zhì)[4-5]。將不同基質(zhì)500 g高溫滅菌后放入白塑料盤中,接種菌液后20 ℃室內(nèi)培養(yǎng),觀察記錄菌落生長(zhǎng)狀況;用分光光度計(jì)測(cè)其OD吸光值,確定產(chǎn)孢量高的底物基質(zhì)。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

    1.2.3 最適接菌量的確定 以菜籽餅作為底物,混合營養(yǎng)物質(zhì)加入150 mL三角瓶,每個(gè)處理加入無菌水20 mL,接基質(zhì)體積分?jǐn)?shù)的10%、20%、40%、60%、80%、100%比例將孢子懸浮液接入培養(yǎng)基中充分混勻培養(yǎng),用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)確定產(chǎn)孢量最高的接菌量。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)。

    1.2.4 培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)孢量影響 稱25 g菜籽餅基質(zhì)裝入150 mL三角瓶,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)混勻,按基質(zhì)體積百分比分別加 10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%蒸餾水[6],培養(yǎng)基滅菌后接種對(duì)應(yīng)的菌株,在恒溫培養(yǎng)箱25 ℃培養(yǎng)菌落,觀察菌絲生長(zhǎng)狀況,第7天測(cè)孢子懸浮液的OD值,結(jié)合菌絲生長(zhǎng)狀況,得出適合該菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基含水量范圍。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)。

    1.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響 稱取25 g菜籽餅作為基質(zhì)裝入150 mL三角瓶,加入各菌對(duì)應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 II營養(yǎng)物質(zhì)混勻,按基質(zhì)體積百分比加水40 mL,滅菌接入相應(yīng)的菌種后,分別在恒溫箱中以15、20、25、30、35 ℃恒溫培養(yǎng),7 d后測(cè)孢子懸浮液的OD值,結(jié)合菌絲生長(zhǎng)狀況,得出適合該菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)溫度范圍[3]。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

    1.2.6 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì) 通過單因素試驗(yàn)篩選出培養(yǎng)基含水量和培養(yǎng)溫度,再結(jié)合培養(yǎng)時(shí)間這3個(gè)量作為因素,分別取5個(gè)水平,采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì),在三角瓶中進(jìn)行正交試驗(yàn),確定3株菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件[7]。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)。HZ-31培養(yǎng)條件二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)變量水平及編碼見表1。

    表1 HZ-31培養(yǎng)條件二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)變量水平及編碼Table 1 Table of orthogonal test of culture conditions of HZ-31

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    所有數(shù)據(jù)均采用DPS 6.50進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HZ-31菌株碳氮源篩選

    用血球計(jì)數(shù)法和分光光度計(jì)法測(cè)產(chǎn)孢量及其OD值。對(duì)HZ-31在不同碳氮源培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量進(jìn)行計(jì)數(shù)并對(duì)菌懸液的OD值進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表2。由表2可以看出,HZ-31在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量為6.17×108mL-1;在C2培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高(3.03×109mL-1),孢子懸浮液的OD值與其他碳源之間存在極顯著性差異;在N4培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高達(dá)7.53×108mL-1,且其OD值與其他氮源OD值之間存在極顯著性差異;將C2和N4結(jié)合制成最佳培養(yǎng)基,產(chǎn)孢量達(dá)到4.45×109mL-1,最適碳氮源培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量和OD值與其他單一碳氮源之間存在顯著性差異。

    結(jié)合菌落形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)情況、產(chǎn)孢量和OD值,最終篩選結(jié)果:HZ-31最適碳源為小麥粉;最適氮源為(NH4)2SO4。

    2.2 HZ-31菌株固態(tài)基質(zhì)篩選

    在不同的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中加入適量的無菌水,用小噴壺將過濾的菌種發(fā)酵液均勻噴灑在基質(zhì)上拌勻,用保鮮膜封口,25 ℃培養(yǎng)。觀察菌落生長(zhǎng)情況,使用分光光度計(jì)法測(cè)定過濾孢子懸浮液OD值,確定不同基質(zhì)的產(chǎn)孢量。結(jié)果分析可知,HZ-31在麥稈糠上生長(zhǎng)較好,菌落較大,菌絲生長(zhǎng)旺盛。為進(jìn)一步驗(yàn)證該菌在米糠中生長(zhǎng)優(yōu)于其他條件,設(shè)計(jì)試驗(yàn)見表3。

    表2 HZ-31在不同碳氮源培養(yǎng)基的產(chǎn)孢數(shù)量及菌懸液OD值Table 2 Spore production quantity and OD of HZ-31 on culture medium of different carbon and nitrogen sources

    注:不同大寫字母表示在0.01 水平上差異顯著,不同小寫字母表示在 0.05水平上差異顯著,下表同。

    Note:Different uppercase letters in column indicate very significant difference(P<0.01), the different lowercase letters in column indicate significant difference(P<0.05),the same as below.

    結(jié)合前面孢子懸浮液孢子濃度和分光光度值存在正比關(guān)系,由表3可以看出:HZ-31生長(zhǎng)較好的固態(tài)基質(zhì)為麥稈糠>珍珠巖>麥麩>羊糞>菜籽餅>蛭石;麥稈糠和其他基質(zhì)之間存在極顯著性差異,羊糞和珍珠巖、菜籽餅、蛭石之間存在顯著性差異,菜籽餅和蛭石之間也存在極顯著性差異。HZ-31最適產(chǎn)孢的固態(tài)基質(zhì)為麥稈糠(圖1,圖2)。

    2.3 HZ-31菌株發(fā)酵最適接菌量

    由表4可以看出,HZ-31在接種量約為體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí),產(chǎn)孢子量達(dá)到108,過高或過低的接種量均導(dǎo)致產(chǎn)孢量下降,菌落長(zhǎng)勢(shì)不好。由此得知,HZ-31的最適接種量約為體積分?jǐn)?shù)為40%。接種量過低,基質(zhì)中孢子含量太少,菌體生長(zhǎng)菌落少,不能鋪滿基質(zhì),容易導(dǎo)致污染,且會(huì)延長(zhǎng)其生長(zhǎng)時(shí)間,培養(yǎng)基容易被雜菌污染;而接種量過多則會(huì)造成固體基質(zhì)含水量過多,含水量多容易引起細(xì)菌污染,且對(duì)于好氧菌來說,基質(zhì)透氣性變差,這樣會(huì)阻礙菌體在固體發(fā)酵基質(zhì)中的生長(zhǎng)。

    表3 菌株在不同固態(tài)基質(zhì)的孢子液吸光值差異顯著性分析Table 3 Analysis of significant difference on spore liquid absorbance value in different solid substrates

    圖1 不同底物基質(zhì)的篩選過程Fig.1 Selection of different solid substrates

    接種量Inoculationdose10%20%40%60%80%100%產(chǎn)孢量/(g/mL)Sporeproduction1.31×1061.53×1072.14×1083.27×1071.84×1064.38×105

    2.4 HZ-31菌株培養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗(yàn)

    固態(tài)基質(zhì)含水量對(duì)產(chǎn)孢量影響的試驗(yàn)結(jié)果表明,HZ-31菌株在培養(yǎng)基含水量60%~100%,菌落長(zhǎng)勢(shì)較好。

    該菌的生長(zhǎng)溫度范圍均在20~35 ℃。為下一步的正交試驗(yàn)提供最低和最高溫度標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)時(shí)間范圍為3~14 d,14 d后生長(zhǎng)基本處于很緩慢的狀態(tài)。

    通過單因素試驗(yàn)篩選出培養(yǎng)基含水量和培養(yǎng)溫度后結(jié)合培養(yǎng)時(shí)間作為3個(gè)因素,分別取5個(gè)水平,在150 mL三角瓶中加入適合的基質(zhì)進(jìn)行正交試驗(yàn),確定該菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

    在DPS 6.50數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析軟件上進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析,利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立二次回歸模型并對(duì)其進(jìn)行方差分析,進(jìn)而通過數(shù)據(jù)優(yōu)化程序?qū)ζ涔虘B(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化。

    利用DPS 6.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果(表5)進(jìn)行分析,得到HZ-31菌株的培養(yǎng)基含水量(X1)、培養(yǎng)溫度(X2)、培養(yǎng)時(shí)間(X3)與菌株產(chǎn)孢量(Y)的數(shù)學(xué)模型回歸方程為:

    Y=8.829 54-1.434 51X1-1.228 82X2-0.018 97X3-0.408 61X12-0.267 19X22-0.779 84X32-0.062 50X1X+20.587 50X1X3+0.412 50X2X3

    從回歸方程可看出,培養(yǎng)基含水量(X1)均系數(shù)較大,對(duì)HZ-31產(chǎn)孢量Y值的影響較大,起主要效應(yīng)作用;培養(yǎng)時(shí)間(X3)系數(shù)最小對(duì)產(chǎn)孢量Y值的影響最??;3因素的頻率分布95%分布區(qū)間均在一定范圍內(nèi)呈正態(tài)分布;分析X1X2、X1X3和X2X3的互作效應(yīng)可忽略不計(jì)。

    根據(jù)DPS上的處理結(jié)果得固態(tài)發(fā)酵的最適培養(yǎng)條件,HZ-31最適培養(yǎng)基質(zhì)含水量為37%;最適培養(yǎng)溫度為23 ℃;最佳培養(yǎng)時(shí)間為8 d。

    3 討 論

    從青海省獨(dú)特的氣候生態(tài)條件下篩選出具有強(qiáng)除草活性的生防菌株HZ-31,前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)禾本科及幾種闊葉雜草具有較強(qiáng)致病性,本研究采用單因素法篩選出合適的碳氮源、適宜的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)及最適接種量,同時(shí)運(yùn)用正交試驗(yàn)開展菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn),確定該菌株各項(xiàng)技術(shù)工藝參數(shù)指標(biāo),旨在獲得一株發(fā)酵時(shí)間適中、產(chǎn)孢量高的優(yōu)良菌種,為該菌株的規(guī)模化生產(chǎn)發(fā)展提供依據(jù)。

    研究表明,碳氮源、發(fā)酵時(shí)間、接種量、培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)菌株HZ-31分生孢子的生產(chǎn)均有明顯的影響。HZ-31最適碳源為小麥粉,最適氮源為(NH4)2SO4,在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)到6.17×108mL-1時(shí),最適碳源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)到3.03×109mL,最適氮源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)到7.53×108mL-1。小麥粉和(NH4)2SO4分別作為補(bǔ)充碳氮源,優(yōu)化了固態(tài)培養(yǎng)基,促進(jìn)了菌株的產(chǎn)孢量。固態(tài)發(fā)酵需要有合適的接種量,而發(fā)酵液接種量的多少與菌株的生長(zhǎng)周期有關(guān)。本研究中HZ-31最適宜的接種量是體積分?jǐn)?shù)為40%。如果接種量過大,菌體生長(zhǎng)過快,就會(huì)造成溶解氧不足或者營養(yǎng)成分的過度消耗,不利于發(fā)酵產(chǎn)物的累積。如果接種量過小,則會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)周期,產(chǎn)孢量減少,雜菌污染的可能性也更大。另外,通過正交試驗(yàn)篩選出該菌株最適培養(yǎng)基質(zhì)含水量均為37%,最適培養(yǎng)溫度為23 ℃,最佳培養(yǎng)時(shí)間為8 d。對(duì)于菌株HZ-31的發(fā)酵生產(chǎn)工藝來說,明確各因素與菌株發(fā)酵生產(chǎn)之間的關(guān)系, 將為該菌的規(guī)?;a(chǎn)和劑型研究提供理論依據(jù)。

    表5 正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 5 Scheme and results of design experiment of quadratic orthogonal rotation

    生防菌的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的選取一般都是價(jià)格低廉、容易獲得的農(nóng)副產(chǎn)品下腳料,既節(jié)約了生產(chǎn)成本,又符合現(xiàn)代可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略[8]。本研究中篩選出的生防菌株HZ-31最適產(chǎn)孢固態(tài)基質(zhì)麥稈糠,更適用于大批量生產(chǎn),方便菌劑儲(chǔ)存和運(yùn)輸。除了以上生防菌劑固態(tài)發(fā)酵的影響因素之外,適宜的助劑在很大程度上也影響制劑的生物活性和穩(wěn)定性,因此,下一步有必要對(duì)該菌的載體助劑進(jìn)行篩選,為該菌株劑型的制備提供基礎(chǔ)。

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    LI G X,ZHOU X D,GUO Y ZH.Substrate screening and components optimization of solid state fermentation byVerticilliumlecanii[J].PlantProtection,2003,29 (1):28-30(in Chinese with English abstract).

    (責(zé)任編輯:史亞歌 Responsible editor:SHI Yage)

    Study on Culture Conditions ofTrichodermapolysporumHZ-31

    ZHU Haixia, MA Yongqiang,WEI Youhai and GUO Qingyun

    (Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining, Ministry of Agriculture of P.R.China/Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province,Xining 810016,China)

    The potential bioherbicide strainsTrichodermapolysporumHZ-31 can cause high virulence to weeds, we selectedTrichodermapolysporumHZ-31 as potential strain to study the optimum carbon, nitrogen sources, optimum solid substrate, optimization of culture conditions.The results showed that the optimal carbon is wheat flour,the optimum nitrogen is (NH4)2SO4for HZ-31,the number of spore production on optimum carbon and nitrogen culture medium was 4.45×109mL-1, and was 6.17 ×108mL-1on PDA . The optimum substrate was wheat bran,the optimum inoculum was 40% volume fraction,the orthogonal test showed that the optimum initial moisture content of HZ-31 was 37%, the optimal temperature was 23 ℃ and the optimal cultural time was 8 d.

    TrichodermapolysporumHZ-31;Soild substrate;Soild-liquid culture conditions

    ZHU Haixia,female, associate research fellow.Research area:biological control of weeds. E-mail:zhuhaixia0101@163.com

    GUO Qingyun, female, research fellow. Research area:integrated management of farmland weeds. E-mail:guoqingyunqh@163.com

    2015-07-22

    2015-08-27

    國家自然科學(xué)基金(31560518);青海省農(nóng)科院“高原特色作物生物技術(shù)育種”團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新能力提升專項(xiàng)(2014- NKY-206)。

    朱海霞,女,副研究員,主要從事雜草生物防治研究。E-mail:zhuhaixia0101@163.com

    郭青云,女,研究員,主要從事農(nóng)田雜草綜合治理研究。E-mail:guoqingyunqh@163.com

    日期:2016-12-20

    S451.1

    A

    1004-1389(2017)01-0132-05

    網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161220.1645.032.html

    Received 2015-07-22 Returned 2015-08-27

    Foundation item National Natural Science Foundation of China(No.31560518);Special Fund for Innovation Promotion of Research Team in “Biotechnology Breeding for Special Crops in Tibet and Qinghai Plateau” ,Qinghai Academy of Agricultural and Forest Sciences (No.2014- NKY-206).

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