Bruton酪氨酸蛋白激酶在創(chuàng)傷性休克誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)中研究與思考

劉欣偉， 柳云恩， 王 宇

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 骨科 全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷救治中心，遼寧 沈陽 110016

·骨科專題·

Bruton酪氨酸蛋白激酶在創(chuàng)傷性休克誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)中研究與思考

劉欣偉， 柳云恩， 王 宇

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 骨科 全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷救治中心，遼寧 沈陽 110016

Bruton酪氨酸蛋白激酶； 創(chuàng)傷性休克； 全身炎癥反應(yīng)綜合癥； 多器官功能障礙綜合征； 膿毒癥

Bruton′s tyrosine kinase; Traumatic shock; Systemic inflammatory response syndrome; Multiple organ dysfuction syndrome; Pyohemia

Bruton酪氨酸蛋白激酶(Bruton tyrosine kinase，Btk)是非受體酪氨酸蛋白激酶Tec家族成員之一，是Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號(hào)通路的一個(gè)重要信號(hào)分子，但其在體內(nèi)炎癥反應(yīng)中的作用仍知之甚少。由于TLRs信號(hào)通路在創(chuàng)傷后全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障礙綜合征的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。Btk信號(hào)可能通過激活下游促炎性信號(hào)通路，參與創(chuàng)傷后全身炎癥反應(yīng)和重要臟器損傷的發(fā)病過程。本研究對(duì)目前該領(lǐng)域的文獻(xiàn)進(jìn)行回顧、分析并進(jìn)行了思考，通過復(fù)制小鼠創(chuàng)傷性休克模型，觀察Btk激酶在各臟器中的表達(dá)及活化，并以腹腔巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，采用慢病毒載體RNA干擾方法研究Btk在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的MAPK和NF-κB活化及細(xì)胞因子表達(dá)中的作用；采用過繼巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究Btk在創(chuàng)性休克誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)和肺損傷中的作用和機(jī)制，這也許是一種可行的研究思路。本研究旨在加深對(duì)Btk的認(rèn)識(shí)，與國內(nèi)外先進(jìn)理念接軌，從而為創(chuàng)傷后SIRS的防治提供新的思路。

創(chuàng)傷是重要的全球性公共衛(wèi)生問題，在美國及西方國家，創(chuàng)傷是1～44歲人群死亡的首位原因，在我國，創(chuàng)傷也是當(dāng)今青壯年人群的第一位死亡原因[1]。低血容量循環(huán)衰竭是導(dǎo)致創(chuàng)傷患者傷后即刻死亡和早期死亡的的主要原因，而其誘發(fā)的SIRS、膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)則是創(chuàng)傷患者晚期死亡最重要的原因。創(chuàng)傷性休克的防治一直是創(chuàng)傷急救領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)，其中，圍繞SIRS開展的創(chuàng)傷性休克的研究工作在世界各國廣泛地進(jìn)行。失控的SIRS被認(rèn)為是導(dǎo)致膿毒癥和MODS的主要致病機(jī)制，而SIRS與過量的炎性介質(zhì)產(chǎn)生有關(guān)。然而，到目前為止，針對(duì)細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)的抗炎治療在SIRS、膿毒癥及MODS患者中進(jìn)行的所有臨床研究均失敗了。研究炎性介質(zhì)過度釋放的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并對(duì)關(guān)鍵信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，對(duì)于阻斷創(chuàng)傷性休克失控性炎癥反應(yīng)可能較針對(duì)某一單個(gè)炎癥介質(zhì)更為有效。

TLRs是一類病原分子識(shí)別受體家族，其不僅能識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，其某些成員，尤其是TLR4也可識(shí)別無菌性損傷后釋放的眾多內(nèi)源性分子即損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)。外源脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或內(nèi)源性配體與TLR4結(jié)合后，活化MyD88和TRIF兩條信號(hào)途徑，前者活化NF-κB和MAPK信號(hào)通路，后者活化NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3信號(hào)通路。TLR4通過這些信號(hào)途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、趨化因子等，從而產(chǎn)生強(qiáng)有力的炎癥和免疫反應(yīng)。通過調(diào)控TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)節(jié)炎性免疫反應(yīng)，干預(yù)膿毒癥的發(fā)展。近年來，有研究表明，TLR4及其信號(hào)通路介導(dǎo)的天然免疫在創(chuàng)傷后局部和全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)態(tài)過程中具有重要作用[2]。在失血性休克、股骨骨折、創(chuàng)傷性休克等動(dòng)物模型中，TLR4在局部炎癥反應(yīng)、遠(yuǎn)隔臟器損傷、全身炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。TLR4在膿毒癥病理生理過程中的重要作用提示，針對(duì)TLR4可能形成抗炎治療靶點(diǎn)。然而，近年來的臨床研究結(jié)果表明，應(yīng)用TLR4特異性拮抗劑TAK-242(Ⅲ期臨床試驗(yàn))和E5564(Ⅱ期臨床試驗(yàn))并不能從細(xì)胞因子水平降低嚴(yán)重膿毒癥患者的病死率[3-4]。進(jìn)一步探索參與創(chuàng)傷性休克后SIRS發(fā)生的新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，對(duì)膿毒癥和MODS的防治及提高創(chuàng)傷患者的存活率均具有重要意義。

Btk是胞漿非受體酪氨酸蛋白激酶Tec家族成員之一，是B淋巴細(xì)胞發(fā)育所必需的物質(zhì)。Btk突變可致人X連鎖無丙種球蛋白血癥，患者體內(nèi)缺乏抗體和成熟的外周B淋巴細(xì)胞[5]。Btk是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Tec激酶家族成員，該家族成員還包括Tec、Itk、Bmx及Txk，其結(jié)構(gòu)與Src激酶家族類似，由PH結(jié)構(gòu)域、Tec同源區(qū)、SH3、SH2及激酶結(jié)構(gòu)域組成，其N端缺乏疏水性跨膜結(jié)構(gòu)，而C端缺乏負(fù)性調(diào)節(jié)區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)，Btk是TLR4及TLR2、6、7、8、9等信號(hào)傳遞中的關(guān)鍵信號(hào)分子[6-7]。當(dāng)LPS等TLRs配體作用于細(xì)胞時(shí)，Btk由胞漿迅速移位至胞膜并發(fā)生酪氨酸磷酸化而具有激酶活性，活化的Btk可磷酸化多個(gè)接頭蛋白，如MyD88、Mal/TIRAP、IRAK-1及TRIF，并與這些接頭分子相互作用形成復(fù)合體，復(fù)合體進(jìn)一步募集下游信號(hào)分子TRAF6。在泛素連接酶UEVIA和UBCl3的催化作用下，TRAF6發(fā)生一系列的泛素化反應(yīng)，支架蛋白TAB2和TABl介導(dǎo)TRAF6向下傳導(dǎo)信號(hào)[8-10]。通過上述機(jī)制，Btk可增強(qiáng)TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并最終激活NF-κB和MAPKs信號(hào)通路，繼而啟動(dòng)炎性基因表達(dá)[11]。有研究表明，Btk基因突變或缺失的單核/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)LPS刺激不敏感，TNF-κ、IL-1κ和iNOS表達(dá)明顯下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Btk對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控作用主要是通過NF-κB和p38激酶介導(dǎo)的[12-16]。

雖然體外研究證實(shí)，Btk在LPS/TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要地位，但體內(nèi)研究卻顯示內(nèi)毒素血癥時(shí)，Btk基因缺陷小鼠病死率不僅沒有預(yù)期下降，反而明顯增加，同時(shí)伴有IL-10合成減少，IL-6水平升高[17-18]。造成體外與體內(nèi)研究結(jié)果截然相反的原因，筆者推測(cè)可能主要是由于Btk(-)小鼠體內(nèi)缺乏LPS天然IgM抗體，從而導(dǎo)致LPS清除障礙，LPS作用被持續(xù)放大[17]；其次可能是由于Btk(-)小鼠缺乏B淋巴細(xì)胞，從而導(dǎo)致IL-10產(chǎn)生不足，間接導(dǎo)致IL-6水平升高，造成炎癥失控。有研究發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞TLR4信號(hào)通路活化后可產(chǎn)生大量IL-10，從而抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在天然免疫中發(fā)揮重要的調(diào)理作用[19]；另外，也可能是由于Btk基因和Tec家族其他成員基因之間具有明顯的冗余和代償功能[20]，導(dǎo)致Btk(-)小鼠無法顯示表現(xiàn)型，從而掩蓋了Btk的真實(shí)作用。Btk(-)基因敲除小鼠的這些先天性內(nèi)在缺陷，可能是導(dǎo)致當(dāng)前未見文獻(xiàn)報(bào)道利用Btk(-)小鼠進(jìn)行膿毒癥研究的原因。目前，關(guān)于Btk信號(hào)通路與炎癥關(guān)系的研究仍多限于體外觀察，在體內(nèi)炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用仍知之甚少。

與其他炎性信號(hào)分子如TLR4、NF-κB、MAPKs及細(xì)胞因子等廣泛分布表達(dá)于體內(nèi)各種不同類型細(xì)胞不同，Btk的細(xì)胞表達(dá)譜較窄，僅限于髓系細(xì)胞，包括B淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞，但不表達(dá)于T淋巴細(xì)胞[21]。Btk基因缺失的單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞與野生型比較，在體外并未表現(xiàn)出增殖抑制和凋亡易感性增加[22]。這些提示，抑制Btk信號(hào)對(duì)機(jī)體免疫功能的不利影響可能遠(yuǎn)低于抑制其他信號(hào)分子的影響。鑒于Btk信號(hào)在啟動(dòng)細(xì)胞免疫炎性反應(yīng)的重要性及其在炎性細(xì)胞中的特異性表達(dá)，Btk很可能是創(chuàng)傷性休克時(shí)SIRS、膿毒癥及MODS的理想干預(yù)靶點(diǎn)。

膿毒癥所致的MODS中，肺是最早發(fā)生衰竭的器官，表現(xiàn)為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)。ALI以炎性介質(zhì)過度分泌、炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞廣泛損傷為病理特征，臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫、難治性低氧血癥及非心源性肺水腫，是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要原因。肺泡巨噬細(xì)胞是肺固有的巨噬細(xì)胞，約占肺巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%，與肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞及其他臟器固有的巨噬細(xì)胞，如肝Kupffer細(xì)胞不同，其處于肺泡腔內(nèi)，肺泡壁將其與循環(huán)系統(tǒng)隔離出來。肺泡巨噬細(xì)胞活化可分泌大量炎性介質(zhì)，并啟動(dòng)循環(huán)單核/巨噬細(xì)胞及多性核中性白細(xì)胞向肺內(nèi)浸潤(rùn)。肺泡巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和加劇過程中發(fā)揮了重要作用，是參與ALI發(fā)生的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。由于炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，Btk作為眾多炎性介質(zhì)合成與釋放的重要上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能在創(chuàng)傷后肺泡巨噬細(xì)胞活化及ALI的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

筆者認(rèn)為，為了尋找更高效、具有特異性的抗炎靶點(diǎn)以防治失控性SIRS，可以研究Btk信號(hào)通路在創(chuàng)傷性休克時(shí)全身炎癥反應(yīng)及急性肺損傷發(fā)病中的作用和機(jī)制。通過建立小鼠創(chuàng)傷性休克模型，觀察Btk激酶在各臟器中的表達(dá)及活化情況，并采用Btk特異性抑制劑LFM-A13進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)，以探討其在全身炎癥和臟器損傷中的作用，這將是一個(gè)較好的研究切入點(diǎn)。

另外，由于單核/巨噬細(xì)胞是參與創(chuàng)傷膿毒癥時(shí)全身炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，肺固有的肺泡巨噬細(xì)胞也在膿毒癥ALI發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，為闡明Btk信號(hào)分子作用機(jī)制，也以分離培養(yǎng)的腹腔巨噬細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，采用慢病毒載體RNA干擾方法研究Btk在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的MAPK和NF-κB活化及細(xì)胞因子表達(dá)中的作用。為了進(jìn)一步明確Btk在創(chuàng)傷性休克誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)及急性肺損傷中的特異性作用和機(jī)制，有必要采用分子生物學(xué)手段阻斷體內(nèi)Btk活化，但由于Btk表達(dá)局限于炎性細(xì)胞，而炎性細(xì)胞在活體內(nèi)尚無法像上皮細(xì)胞一樣進(jìn)行轉(zhuǎn)染，為此可以將體外轉(zhuǎn)染了RNA干擾慢病毒載體的腹腔巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞分別進(jìn)行全身的過繼細(xì)胞免疫治療實(shí)驗(yàn)，以達(dá)到高效特異性阻斷體內(nèi)巨噬細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞Btk活化的目的。

通過結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，采用RNA干擾、慢病毒載體轉(zhuǎn)染、Western blotting，EMSA、real time PCR等手段，深入研究Btk信號(hào)通路在創(chuàng)傷性休克時(shí)全身炎癥反應(yīng)及急性肺損傷中的作用及分子機(jī)制，這將有助于闡明嚴(yán)重創(chuàng)傷后失控性炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，為創(chuàng)傷后膿毒癥和多臟器功能衰竭的防治提供新的思路和線索。

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國家自然科學(xué)基金(81401586)

劉欣偉(1979-)，男，黑龍江哈爾濱人，副主任醫(yī)師，博士

王 宇，E-mail：deformitya@126.com

2095-5561(2017)03-0145-03 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.03.05

2016-12-22