高效液相色譜法測定水果中的滅螨醌和羥基滅螨醌*

曾銘，蔣小良，喻零春，蘇淑壇

(1.花都出入境檢驗檢疫局，廣州 510800； 2.江門出入境檢驗檢疫局，廣東江門 529000)

高效液相色譜法測定水果中的滅螨醌和羥基滅螨醌*

曾銘1，蔣小良2，喻零春1，蘇淑壇2

(1.花都出入境檢驗檢疫局，廣州 510800； 2.江門出入境檢驗檢疫局，廣東江門 529000)

建立了水果可農(nóng)藥滅螨醌和代謝產(chǎn)物羥基滅螨醌的高效液相色譜測定方法。樣品經(jīng)過正己烷-乙酸乙酯(體積比為1∶1)提取后，過石墨化碳氨基復(fù)合小柱凈化，然后用高效液相色譜-熒光檢測器法進行檢測。結(jié)果表明，滅螨醌和羥基滅螨醌的質(zhì)量濃度在0.01～5.0 mg／L范圍內(nèi)與色譜峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9。滅螨醌和羥基滅螨醌的檢出限均為0.01 mg／kg。樣品加標回收率為88.5%～102.3%，測定結(jié)果的相對標準偏差不大于于3.35%(n=5)。該方法靈敏度和準確度高，可滿足水果可滅螨醌和羥基滅螨醌含量的測定要求。

滅螨醌；羥基滅螨醌；高效液相色譜；水果

滅螨醌是一種合成觸殺性殺螨劑農(nóng)藥，是用來控制虱類、螨類和其它無脊椎動物的殺蟲劑，它的代謝產(chǎn)物為羥基滅螨醌。滅螨醌無內(nèi)吸活性，廣泛用于梨、桃、柑橘、葡萄、黃瓜等防治螨類危害，具有高效、低毒、廣譜和生物降解性等特性，在國際上得到廣泛使用。按照我國農(nóng)藥毒性分級標準，滅螨醌屬于低毒農(nóng)藥，對大鼠LD50為5 000 mg／kg［1］。歐盟、日本、加拿大及美國等國家地區(qū)對水果中滅螨醌殘留量都有嚴格的限量標準，最大殘留量(MRLs)為滅螨醌及其羥基滅螨醌的混合殘留總量。歐盟［2］規(guī)定蘋果和梨中滅螨醌MRLs為0.1 mg／kg，橙子為0.4 mg／kg；美國規(guī)定葡萄中滅螨醌的MRLs為1.6 mg／kg；日本“肯定列表”中梨和蘋果中滅螨醌的MRLs分別為2 mg／kg和1 mg／kg。由于羥基滅螨醌仍然保留了與滅螨醌基本相同的萘醌結(jié)構(gòu)，被同樣認為對血液凝固會產(chǎn)生影響，因此對植物及動物性食品中的滅螨醌進行風險評估及殘留檢測時，除了滅螨醌，還應(yīng)包括羥基滅螨醌［3］。

蔬菜水果中的農(nóng)藥殘留是國內(nèi)外研究熱點［4-6］，檢測方法主要有高效液相色譜法［7-8］、高效液相色譜-質(zhì)譜法［9-10］及氣相色譜-質(zhì)譜法［11-13］。國外對滅螨醌檢測的相關(guān)研究很少，主要集中在水果和蔬菜中的殘留檢測［14-15］，我國至今沒有相關(guān)文獻報道，也未曾制定國家標準和行業(yè)標準。筆者以正己烷-乙酸乙酯為溶劑，經(jīng)萃取、濃縮、凈化后，用高效液相色譜法定量測定水果中滅螨醌及羥基滅螨醌的殘留量。本方法可促進我國水果中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)水平的提高，推動標準檢測方法的建立。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1200型，帶二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司；

紫外可見分光光度計：2450型，日本島津公司；

高速組織搗碎機：BILONJJ-2型，江蘇金壇市億通電子有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-210型，瑞士步琦公司；

氮吹儀：21011V001 R200型，瑞士步琦公司；

電子天平：TB215D型，美國丹佛公司；

超純水系統(tǒng)：Synery UV型，美國Millipore公司；

滅螨醌：純度不小于99.9%，德國Supelco公司；

羥基滅螨醌：純度不小于99.9%，德國Supelco公司；

正己烷、乙酸乙酯：HPLC級，德國Merck 公司；

乙腈：HPLC級，美國Mallinckroat Baker公司；

SPE柱：Cleanert PestiCarb／NH2，500 mg／6 mL，博納艾杰爾科技有限公司；

實驗室用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm，10 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：25℃；流動相：乙腈-0.1%磷酸(體積比為90∶10)，流量為1.0 mL／min，等度洗脫；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：250 nm；進樣體積：20 μL；采用色譜峰的保留時間定性，峰面積外標法定量。

1.3 實驗方法

切取水果樣品中可食部分并搗碎，混勻，準確稱取約10 g樣品(精確至0.01 g)于100 mL離心管中，加入20 mL正己烷-乙酸乙酯混合液(體積比為1∶1，下同)，用高速組織搗碎機在12 000 r／min轉(zhuǎn)速下均漿提取1 min，加入4 g無水硫酸鈉，再均漿提取1 min，在4 000 r／min轉(zhuǎn)速離心5 mim，取上清液10 mL(相對于樣品5 g)加入50 mL梨形瓶中，在40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至微干，加入2 mL正己烷-乙酸乙酯，超聲30 s充分溶解。

加樣前先用5 mL正己烷-乙酸乙酯混合液預(yù)淋洗SPE柱，然后從上述梨形瓶中取2 mL溶解好的果蔬樣品提取液轉(zhuǎn)移至凈化柱中，再用3 mL正己烷-乙酸乙酯混合液洗滌梨形瓶并轉(zhuǎn)移入萃取柱，流量為2 mL／min，收集全部流出液，于水浴40℃下氮氣吹干。用流動相溶解并定容至1 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，濾液作為待測樣液。按1.2色譜條件進行測定。

1.4 標準儲備溶液的配制

分別精密稱取滅螨醌和羥基滅螨醌各25 mg(精確至0.1 mg)，用正己烷溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中，配制成滅螨醌和羥基滅螨醌含量均為1 000 mg／L標準儲備液，置于4℃冰箱中儲藏，待用。臨用前各取1 mL滅螨醌和羥基滅螨醌標準儲備液，用流動相定容到25 mL棕色容量瓶中，得到40 mg／L的滅螨醌和羥基滅螨醌混合標準溶液。使用時用流動相逐級稀釋至所需濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 滅螨醌和羥基滅螨醌的穩(wěn)定性

根據(jù)加拿大衛(wèi)生部的評估報告(ERC2007-10)，在pH 4的溶液中，滅螨醌74天后開始水解；pH 1.2時，滅螨醌19天后開始水解；pH 9時，滅螨醌76 min后發(fā)生水解。表明滅螨醌在弱酸性條件下相對穩(wěn)定。同時，滅螨醌見光轉(zhuǎn)化，在土壤中5.3天轉(zhuǎn)化，在水溶液中則14 min開始轉(zhuǎn)化。對滅螨醌及羥基滅螨醌標準工作溶液的穩(wěn)定性做進一步研究，發(fā)現(xiàn)在避光條件下兩者均較為穩(wěn)定，所以實驗過程中需要避光。

2.2 檢測波長的確定

取滅螨醌和羥基滅螨醌標準混合溶液，用紫外分光光度計進行波長全掃描分析，掃描波長范圍為200～400 nm，掃描結(jié)果見圖1。由圖1可知，滅螨醌和羥基滅螨醌在掃描波長范圍內(nèi)均有2個較大的吸收峰，其中最大吸收波長為250 nm，所以實驗選擇250 nm為檢測波長。

圖1 滅螨醌和羥基滅螨醌的紫外光譜圖

2.3 流動相的選擇

在等度洗脫條件下，試驗考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙腈- 0.1%磷酸和甲醇- 0.1%磷酸作為流動相對滅螨醌和羥基滅螨醌的洗脫情況。試驗結(jié)果表明，當流動相為乙腈- 0.1%磷酸溶液(體積比為90∶10)時，分離效果最佳，圖2為混合標準溶液的色譜圖。由圖2可見，滅螨醌和羥基滅螨醌在20 min內(nèi)可以實現(xiàn)很好的分離，且色譜峰形尖銳，有良好的對稱性。

圖2 滅螨醌和羥基滅螨醌混合標準溶液色譜圖

2.4 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

分別移取適量滅螨醌和羥基滅螨醌標準儲備溶液，用流動相逐級稀釋，配制成含0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，5.0 mg／L滅螨醌和羥基滅螨醌混合標準溶液。在1.2色譜條件下，分別取樣20μL進行分析，以標準溶液的色譜峰面積y對質(zhì)量濃度c進行線性回歸，以3倍信噪比計算檢出限。滅螨醌和羥基滅螨醌的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表1。由表1可知，滅螨醌和羥基滅螨醌的質(zhì)量濃度在0.01～5.0 mg／L范圍內(nèi)與色譜峰面積均線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，兩者的檢出限均為0.01 mg／kg。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 精密度試驗

稱取蘋果樣品10.00 g，分別加入一定量的滅螨醌和羥基滅螨醌混合標準溶液，按1.3實驗方法進行分析，每個濃度樣品平行測定5次，測定結(jié)果見表2。由表2可知，滅螨醌和羥基滅螨醌測定結(jié)果的相對標準偏差為2.03%～3.35%，說明該方法具有良好的精密度。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.6 加標回收試驗

稱取蘋果樣品10.00 g，分別加入一定量的滅螨醌和羥基滅螨醌混合標準溶液，按1.3實驗方法進行分析，結(jié)果見表3，加標樣品色譜圖見圖3。從表3中數(shù)據(jù)可以看出，各組分的回收率在88.5%～102.3%之間，說明該方法具有較高的準確度。

表3 滅螨醌及羥基滅螨醌加標回收率測試結(jié)果

圖3 加標樣品色譜圖

2.7 樣品測定

按照1.3實驗方法對水果市場采購的梨、蘋果、香蕉等樣品進行檢測。結(jié)果表明，梨、蘋果、香蕉等樣品中均未檢出滅螨醌及其代謝物羥基滅螨醌。

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜-熒光檢測器法檢測水果中滅螨醌及其代謝物羥基滅螨醌含量的分析方法。滅螨醌及羥基滅螨醌的檢出限均為0.01 mg／kg，加標回收率在88.5%～102.3%之間，相對標準偏差為2.03%～3.35%。該方法簡便、快速，重現(xiàn)性好、準確度高，能夠滿足水果中滅螨醌及其代謝物羥基滅螨醌殘留檢測的要求。

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國產(chǎn)食品安全檢測設(shè)備發(fā)展空間大

目前，中國食品安全檢測儀器市場規(guī)模超過百億元，且增長速度有逐漸提高的趨勢。雖然進口儀器搶占了國內(nèi)市場先機，但國產(chǎn)儀器仍有巨大的發(fā)展空間。如何提高技術(shù)，將食品檢測儀器做小做精、走進尋常百姓家是企業(yè)需要思考的問題。

隨著科技的發(fā)展，影響食品安全的因素不斷增多，需要檢測的項目不斷增加，其要求也越來越高，這對于檢測技術(shù)和儀器、儀表都提出了更高的要求。在當前食品安全各項檢測指標中，農(nóng)藥殘留、獸藥等參數(shù)的檢測受到關(guān)注，所使用的檢測儀器涉及質(zhì)譜儀、色譜儀、分光光度計等高端檢測儀器，在這些領(lǐng)域普遍以外資產(chǎn)品為主導(dǎo)。

目前國內(nèi)一些較發(fā)達的城市農(nóng)貿(mào)市場都建設(shè)了食品安全快速檢測站，但仍未形成全國普及的局面。許多基層食品質(zhì)檢單位面臨著檢驗設(shè)備不足、檢測手段落后等問題。原因是目前進口檢測儀器占據(jù)了我國主要市場。

外資企業(yè)實力雄厚，檢測產(chǎn)品較為成熟穩(wěn)定，但價格昂貴且維護維修費用高，這對于國內(nèi)設(shè)備采購方來說負擔較大，不利于國內(nèi)機構(gòu)檢測水平的提升。要想徹底改變目前國內(nèi)食品安全現(xiàn)狀，提升檢測儀器儀表企業(yè)的自主研發(fā)能力是解決問題的關(guān)鍵。

我國科學檢測儀器產(chǎn)業(yè)起步較晚，在產(chǎn)業(yè)發(fā)展前期被國外知名品牌搶先占領(lǐng)市場，如美國安捷倫、賽默飛世爾科技、沃特世、日本島津等企業(yè)早已入駐我國市場，對國內(nèi)食品安全檢測儀器市場形成巨大的沖擊。而國內(nèi)企業(yè)仍處于初級發(fā)展階段，普遍存在規(guī)模小、人才分散、技術(shù)分散、資源分散等特點。由于缺乏核心技術(shù)，產(chǎn)品質(zhì)量差、穩(wěn)定性低，難以形成大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。

隨著我國對食品安全監(jiān)管力度的加大，各級政府對于儀器設(shè)備、科研經(jīng)費的投入也在增加。2015年，國家食藥監(jiān)總局印發(fā)《關(guān)于加強食品藥品檢驗檢測體系建設(shè)的指導(dǎo)意見》，提出落實改革任務(wù)、強化硬件保障、加強人才隊伍培養(yǎng)、完善制度體系、提升檢驗檢測科研能力、推動檢驗檢測信息共享6項重點任務(wù)。如果國產(chǎn)檢測儀器能夠形成技術(shù)突破，以其相對強大的性價比優(yōu)勢，能夠滿足市場對低成本設(shè)備的需求。

(可國分析計量網(wǎng))

農(nóng)業(yè)部制定千項農(nóng)殘標準 農(nóng)產(chǎn)品追溯平臺試運行

農(nóng)業(yè)部通報，2016年全國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全保持穩(wěn)中向好態(tài)勢，專項整治成效明顯。今年農(nóng)業(yè)部將加強農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全全程監(jiān)管，新制定千項農(nóng)殘標準，農(nóng)產(chǎn)品追溯平臺試運行。

農(nóng)業(yè)部數(shù)據(jù)顯示，2016年全國主要農(nóng)產(chǎn)品例行監(jiān)測總體合格率為97.5%，同比上升0.4個百分點，全年沒有發(fā)生重大農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全事件，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全保持穩(wěn)中向好態(tài)勢。農(nóng)業(yè)部副部長陳曉華舉例，在專項整治方面，農(nóng)業(yè)部門部署開展了禁限用農(nóng)藥、獸用抗菌藥，生豬屠宰，農(nóng)資打假等7個專項治理行動，切實解決面上存在的突出問題；加快農(nóng)獸藥殘留標準制修訂步伐，新制定農(nóng)獸藥殘留限量標準1 310項、農(nóng)業(yè)國家行業(yè)標準307項。

安全是老百姓對農(nóng)產(chǎn)品對基本也是最持久的要求。陳曉華說，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全首先是產(chǎn)出來的，生產(chǎn)方式要跟上，標準也要跟上。加強產(chǎn)地環(huán)境治理，集中力量解決土壤重金屬污染等突出問題。推廣清潔生產(chǎn)技術(shù)，推進化肥農(nóng)藥零增長行動，以果菜茶三大園藝作物為重點開展有機肥替代化肥試點。抓緊完善標準體系，標準不是越多越好，預(yù)估需要10 000項，到2020年左右，基本和國際接軌。

（ 央廣網(wǎng)）

Determination of Acequinocyl and Hydroxyacequinocyl in Fruits by High Performance Liquid Chromatography

Zeng Ming1, Jiang Xiaoliang2, Yu Lingchun1, Su Shutan2
(1. Huadu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510800, China；2. Jiangmen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Jiangmen 529000, China)

An analytical method for determination of acequinocyl and hydroxyacequinocyl in fruits was established by high performance liquid chromatography (HPLC) method. Sample was treated with hexane and ethyl acetate solution (Volume ratio was 1∶1) extraction, and a Cleanert PestiCarb／NH2SPE column was used for the purification. Then quantitative analysis was conducted by HPLC-DAD. The results showed that the mass concentration of acequinocyl and hydroxyacequinocyl behaved linearly with the area of chromatographic peak in the range of 0.01-5.0 mg／L with the correlation coefficient of 0.999 9. The detection limit of acequinocyl and hydroxyacequinocyl was 0.01 mg／kg. The recovery varied from 88.5% to 102.3%, and the relative standard deviations of determination results were not more than 3.35%(n=5). The method is accurate and sensitive, and could satisfy the demand of the analysis of acequinocyl and hydroxyacequinocyl in fruits.

acequinocyl; hydroxyacequinocyl; high performance liquid chromatography; fruit

O657.7

:A

:1008-6145(2017)02-0044-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2017.02.012

*江門市科技計劃項目(2016030100320007398)

聯(lián)系人：蔣小良；E-mail： liang96@yeah.net

2017-01-12