菠蘿濃縮物為糖源的Amadori焦甜香型煙用香料制備

鞏 丹， 周志磊，3， 孟祥勇，3， 毛 健*，3

菠蘿濃縮物為糖源的Amadori焦甜香型煙用香料制備

鞏 丹1，2， 周志磊1，2，3， 孟祥勇1，2，3， 毛 健*1，2，3

（1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興312000）

為了探討水果糖源體系下Amadori香料在卷煙加香方面的應(yīng)用，作者利用菠蘿濃縮物作為糖源與不同氨基酸在有利于Amadori化合物合成的條件下反應(yīng)，通過感官評吸選出了加香效果最好的菠蘿濃縮物-脯基酸Amadori香料（Pine-Pro），制備了焦甜香型且具有典型果香的混合型煙用香料。同時用高效液相色譜和在線裂解GC-MS分析了葡萄糖-脯基酸模型體系下脯氨酸-Amadori單體（Fru-Pro）在反應(yīng)過程中的變化規(guī)律及不同溫度下的熱裂解產(chǎn)物。結(jié)果表明：0~ 2 h Fru-Pro生成量與葡萄糖消耗量相當(dāng)，8~24 h Fru-Pro合成速度逐漸降低但大于分解速度，24 h后其分解速度大于合成速度；整個過程中葡萄糖是限制反應(yīng)物，與葡萄糖相比，脯氨酸的含量降低相對較緩。實驗表明：Fru-Pro的裂解產(chǎn)物中含有多個有吡咯類、吡啶類、吡喃酮類、呋喃酮類、環(huán)戊烯酮、吡嗪類等成分，其中的許多成分具有焦甜香，可能是復(fù)合香料燃燒產(chǎn)生焦甜香的主要貢獻成分。

Amadori化合物；焦甜香；熱裂解；菠蘿濃縮物

煙用香精香料是卷煙生產(chǎn)中不可缺少的添加劑，其配方是煙草企業(yè)的核心技術(shù)之一，其應(yīng)用更是與卷煙品牌的樹立及卷煙風(fēng)格的形成發(fā)展休戚相關(guān)[1]?！敖固鹣恪笔菨庀阈蜔熑~的典型香韻之一，也是高端卷煙主原料津巴布韋煙葉突出的風(fēng)格特征。皖南煙葉與進口優(yōu)質(zhì)津巴布韋煙葉具有較大的相似性[2-3]，但香味和性能仍有差距。如何突出這得天獨厚的“焦甜香”風(fēng)格并改善產(chǎn)品質(zhì)量，對煙草公司來說非常重要。日本學(xué)者通過煙氣、煙葉烘焙揮發(fā)物分析，認為焦甜香氣較重要的成分是環(huán)戊烯酮、呋喃酮和吡喃酮等3大類。張啟東等[4]分析了主流煙氣粒相物水溶性組分中烤甜香成分，也得到了相同的結(jié)論。而這些成分同時也是部分Amadori化合物的裂解產(chǎn)物[5]。

Amadori化合物是 Maillard反應(yīng)初級階段產(chǎn)物，Maillard反應(yīng)產(chǎn)物能產(chǎn)生與煙草相協(xié)調(diào)的香味，可以有效改善低次煙草的品質(zhì)，減少木質(zhì)雜氣，增加煙香，提高抽吸口感[6]，到目前為止，已有大量人工合成的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物作為香料被應(yīng)用到卷煙產(chǎn)品中。但是大部分產(chǎn)物具有較強揮發(fā)性，易加工損失，嚴重影響了卷煙產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，而開發(fā)非揮發(fā)性香料前體可以有效避免上述缺陷[7]。Amadori化合物是不揮發(fā)致香前體物，是安全的天然香料，也是一種減害和能夠提高喉部舒適度的重要香料[8]。研究表明，其在加工過程中不易損失，尤其是能夠產(chǎn)生焦甜香的Amadori化合物[9]。

然而，目前對Amadori化合物的研究和應(yīng)用都集中于單糖和氨基酸單一反應(yīng)模型，用水果濃縮物復(fù)雜體系與氨基酸制備Amadori化合物并用于卷煙增香的研究還不足。水果濃縮物中含有多種可參與Maillard反應(yīng)的還原糖，而且水果本身具有的果香、甜香，可以豐富卷煙香氣，尤其可以增加卷煙的頂香，從而增加消費者的抽吸欲望[10]。此外，當(dāng)加入量適宜時，水果濃縮物與煙香自然協(xié)調(diào)，具有增加卷煙香氣質(zhì)香氣量、掩蓋雜氣、改善余味的作用，是安全天然的煙用香料[11]。菠蘿是多年生熱帶水果，具有濃郁香甜風(fēng)味，菠蘿汁是煙草中較常用的香料之一。

因此，作者選用菠蘿濃縮物作為Maillard反應(yīng)糖源，分別與不同氨基酸反應(yīng)，在Amadori合成條件基礎(chǔ)上，開發(fā)焦甜香型且具有典型果香的新型煙用香精，并進一步研究與菠蘿濃縮物最為匹配的氨基酸Amadori產(chǎn)物的性質(zhì)，旨在為煙用香料的生產(chǎn)提供一定思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

空白卷煙（煙絲重0.6 g）：安徽中煙工業(yè)有限公司技術(shù)中心提供；新鮮優(yōu)質(zhì)海南菠蘿：無錫朝陽集團提供；無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、丙二酸、無水乙醇、無水甲醇、脯氨酸、纈氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、酪氨酸：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；Fru-Pro：實驗室自制，已進行質(zhì)譜及核磁鑒定。

1.2 實驗儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀、示差折光檢測器、XBridge BEH Amide XP色譜柱 （4.6×250 mm，5 μm粒徑）：沃特世公司產(chǎn)品；CDS Pyroprobe 5000 Series熱裂解儀：北京博賽德科技有限公司產(chǎn)品；Agilent 6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；CIS4程序升溫進樣器及C506控制器：德國Gerstel公司產(chǎn)品；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.3 水果濃縮物制備

挑選成熟度、大小相近的優(yōu)質(zhì)菠蘿，去皮、榨汁，8層紗布過濾，濾渣用2倍體積70%乙醇超聲浸提1 h，8層紗布過濾，合并濾液，之后60℃、0.095 MPa下真空濃縮，得到固形物質(zhì)量分數(shù)為70%的菠蘿濃縮物，于-80℃冰箱備用。

1.4 糖類成分測定

采用高效液相色譜（HPLC）測定菠蘿濃縮物糖類成分及含量，參照陸新華等[12]方法并加以改進。每個樣品做3個平行，取平均值。

1.5 Amadori香料的制備

取 5 g菠蘿濃縮物 （含還原糖 1.064 g，5.9 mmol），0.5 g葡萄糖與0.564 g果糖的混合物（含還原糖1.064 g，葡萄糖/果糖質(zhì)量比與菠蘿濃縮物中葡萄糖/果糖質(zhì)量比相當(dāng)），分別與5.9 mmol脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、酪氨酸共12種氨基酸，于50 mL無水乙醇中80℃下回流反應(yīng)30 min，向反應(yīng)液中加入0.21 mmol丙二酸，繼續(xù)反應(yīng)6 h。反應(yīng)液趁熱過濾掉多余氨基酸，立即轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，放入-80℃冰箱備用。

1.6 感官評吸方法

評吸小組7人均為專業(yè)評吸人員。將所有實驗樣品分別用體積分數(shù)75%乙醇溶液配制成質(zhì)量分數(shù)為353 μg/kg的樣品溶液，用加香機向空白卷煙中均添加10 μL，制作成相同濃度的對照卷煙和測試卷煙，于（22±1）℃、相對濕度（60±2）%環(huán)境下平衡48 h后評吸。

樣品評吸參照國標(biāo)GB5606.4-2005[13]的方法，采用定量打分制進行評價，打分內(nèi)容為品質(zhì)特征和風(fēng)格特征。其中，品質(zhì)特征為9分制，風(fēng)格特征為5分制，分值越高代表該屬性越強，品質(zhì)特征的總分作為評價香料的主要指標(biāo)，而風(fēng)格特征作為輔助指標(biāo)。

1.7 Fru-Pro合成過程中主要物質(zhì)變化情況監(jiān)測

采用高效液相色譜（HPLC）測定葡萄糖與脯氨酸反應(yīng)過程中主要物質(zhì)含量動態(tài)變化。

以7.2 g葡萄糖與4.6 g脯氨酸為反應(yīng)物制備Fru-Pro反應(yīng)液，方法同1.5，于不同時間取樣，取樣前用冷水快速冷卻終止反應(yīng)并搖勻，取樣量均為1 mL，樣品用氮吹儀除去乙醇后用1 mL超純水溶解，過0.22 μm水系濾膜，直接進樣。

混合標(biāo)準溶液的配制：分別精密稱取葡萄糖、脯氨酸、Fru-Pro標(biāo)品500、600、2 000 mg置于 10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，作為儲備液。準確吸取適量各儲備液混合，超純水定容至10 mL容量瓶中，配制成不同濃度梯度的混合標(biāo)準溶液。

液相色譜條件：流動相為V（超純水）∶V（乙腈）= 15∶85；柱溫35℃；流量1 mL/min；進樣體積5 μL。

樣品含量計算：通過與標(biāo)樣比對保留時間對目標(biāo)物進行定性，并通過外標(biāo)法建立標(biāo)準曲線進行定量。每個樣品做3個平行，取平均值。數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 19.0進行處理和分析。

1.8 不同溫度下Fru-Pro熱裂解研究

熱裂解方法和條件參照Fru-Phe熱裂解的研究條件。

應(yīng)用NIST05質(zhì)譜譜庫 （Agilent Technologies Inc.）進行檢索定性，采用面積歸一化法計算產(chǎn)物相對含量，結(jié)果取兩次測定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿濃縮物糖類組成分析

所得菠蘿濃縮物中含葡萄糖147.98 mg/g，果糖157.71 mg/g，蔗糖290.74 mg/g，葡萄糖與果糖質(zhì)量比為1：1.06。感官評吸時，選用質(zhì)量比為m（葡萄糖）∶m（果糖）=1∶1的混合糖體系作為對比糖源。

2.2 菠蘿濃縮物-氨基酸最佳加香效果篩選情況

先用混合糖體系與12種氨基酸反應(yīng)制備Amadori香料，卷煙加香結(jié)果如表1所示。

由表1可以明顯看出，在同樣5 μg/kg添加量下，單獨添加混合糖的空白卷煙，只有甜香味、煙氣濃度和烘烤香有微弱的增加，而加入反應(yīng)混合物的空白卷煙，品質(zhì)特征和風(fēng)格特征均得到較大程度的改善。其中，8種氨基酸與還原糖反應(yīng)所得混合物燃燒后能產(chǎn)生焦甜香，分別是：Leu、Ile、Val、Thr、Lys、Gly、Pro、Tyr。另外4種非焦甜香反應(yīng)混合物，GFGlu燃燒后主要表現(xiàn)出烘烤香和酸的吃味，GF-Ser主要表現(xiàn)出正甜香，GF-Asp主要表現(xiàn)出果香，GFAla則主要表現(xiàn)出果香和花香。此外，在這8種能產(chǎn)生焦甜香的混合物中，GF-Thr能顯著提高空白卷煙的品質(zhì)特征，其次是Ile和Val，而GF-Tyr則效果甚微，并且抽吸時有苦味感，這可能是由于Tyr與還原糖反應(yīng)生成了更多的Tyr特有產(chǎn)物，例如酚類和芳香烴類物質(zhì)。酚類物質(zhì)在卷煙抽吸時可以直接進入煙氣，從而對煙氣香味產(chǎn)生直接影響，有些具有特殊香氣，有些單酚物質(zhì)，如苯酚、對甲基苯酚等則含有藥味、澀味，含量適當(dāng)時會對卷煙吃味有積極影響，而含量過高會有明顯的抽吸苦味；從改善空白卷煙香氣特征上來說，GF-Pro效果較好，除了明顯的焦甜香外，還能產(chǎn)生淡淡的烘烤香、干玫瑰花香和果香。

表1 混合糖體系下Amadori香料卷煙加香評分結(jié)果Table 1 Sensory evaluation of amadori spice with reducing sugar mixture as the sugar source

篩選出與還原糖反應(yīng)能產(chǎn)生焦甜香的8種氨基酸之后，在保證還原糖含量相同的條件下，將菠蘿濃縮物與上述8種氨基酸反應(yīng)所得反應(yīng)物加入空白卷煙，感官評吸結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，單獨添加菠蘿濃縮物能增加卷煙吃味的甜感和酸感，同時其天然果香能改善空白卷煙的風(fēng)格特征尤其是香氣風(fēng)格，這可能與菠蘿濃縮物的揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)，菠蘿濃縮物揮發(fā)性成分檢測結(jié)果表明，菠蘿濃縮物中酯類和酮類較多，并且主要是呋喃酮和吡喃酮，這些都是煙氣中的重要呈香物質(zhì)。但單獨添加菠蘿濃縮物并沒有使煙氣的刺激感得到改善。

與菠蘿濃縮物反應(yīng)后，反應(yīng)物加香效果最好的氨基酸是Pro，其次是Thr和Val，該順序與表1結(jié)果略有不同。對比表1、2不難發(fā)現(xiàn)，混合糖體系的脯氨酸-Amadori香料抽吸時雖然香氣豐富且焦甜香濃郁但對煙氣的刺激性和雜氣沒有太大改善；而菠蘿濃縮物體系的脯氨酸-Amadori香料焦甜香強度較低但在降干掩雜方面有很好效果，這可能一方面是因為菠蘿中含有較多的蔗糖，抽吸時增加了口腔甜感，利于降低口腔和喉部干燥感，另一方面對于混合糖體系，脯氨酸-Amadori香料抽吸時焦甜香太過濃郁，對喉鼻的刺激性增強，反而整體香氣不夠協(xié)調(diào)。可見，在菠蘿濃縮物的作用下，脯氨酸-Amadori香料抽吸香氣得到了補充和修飾，增強了加香效果。這也從側(cè)面很好的說明了水果糖源可以使Amadori香料與卷煙煙香更協(xié)調(diào)。

表2 菠蘿濃縮物為糖源的Amadori香料卷煙加香評分結(jié)果Table 2 Sensory evaluation of Amadori spice with pineapple concentrates as the sugar source

2.3 不同溫度下Fru-Pro的熱裂解研究

為了證明在卷煙抽吸過程中Fru-Pro的確對焦甜香有一定貢獻，作者在葡萄糖-脯氨酸簡單模型體系下制備了Fru-Pro，并對其做了不同溫度下的熱裂解實驗，初步定性結(jié)果如表3所示。

Fru-Pro裂解產(chǎn)物中焦甜香的主要貢獻者環(huán)戊烯酮類、呋喃類、吡喃類、吡啶類、吡嗪類在各個溫度下均有產(chǎn)生，并且不同溫度下它們的種類和含量變化很大。550℃下最多，相對峰面積為11.04%，650℃下次之，為10.49%。其中吡啶類物質(zhì)含量與溫度呈很好的正相關(guān)性，450℃下吡嗪類、環(huán)酮類、吡喃酮類含量較高，而350℃下呋喃酮類含量較高。相當(dāng)部分裂解產(chǎn)物在不同裂解溫度下有重現(xiàn)性，如3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、DDMP、2，5-二甲基-4-（1-吡咯烷基）-3（2H）-呋喃酮、2-乙?；拎?、甲基吡啶、甲基吡嗪等。從結(jié)構(gòu)上說，F(xiàn)ru-Pro既有己糖殘基又有Pro殘基，因此形成了很多具有結(jié)構(gòu)特征的產(chǎn)物，如來自于己糖脫水的呋喃酮、吡喃酮、甲基環(huán)戊烯醇酮，來自Pro殘基的吡咯烷、二氮雜如吡嗪類。呋喃酮如菠蘿酮、2，5-二甲基-4-（1-吡咯烷基）-3（2H）-呋喃酮，其中菠蘿酮主要在較低溫度（350℃）下產(chǎn)生，而2，5-二甲基-4-（1-吡咯烷基）-3（2H）-呋喃酮則幾乎存在于各個裂解點產(chǎn)物中。吡喃酮典型如DDMP，在各個裂解點均有產(chǎn)生。

2.4 Fru-Pro合成反應(yīng)動態(tài)變化

為了得到Fru-Pro的生成規(guī)律，在葡萄糖-脯氨酸簡單模型體系下，檢測不同時間反應(yīng)液中葡萄糖、脯氨酸及Fru-Pro的含量變化，以為其制備提供依據(jù)。如圖1，0~24 h內(nèi)，隨反應(yīng)時間延長，葡萄糖和Pro的含量不斷降低，而Fru-Pro含量不斷升高。0~ 2 h內(nèi)，F(xiàn)ru-Pro含量迅速增加，且其生成量與葡萄糖的消耗量基本相當(dāng)，隨著反應(yīng)繼續(xù)進行，葡萄糖的消耗量超過了Fru-Pro的生成量，直到24 h Fru-Pro合成速度一直大于分解速度，但8 h后含量增長緩慢。24 h后，F(xiàn)ru-Pro的含量開始下降，葡萄糖和Pro的含量也依然在緩慢減少，說明此階段Fru-Pro的分解速度開始大于其合成速度，反應(yīng)更多地向Maillard高級反應(yīng)方向進行。在整個過程中，葡萄糖的消耗量明顯高于Pro消耗量，說明在Amadori化合物合成過程中，葡萄糖是限量反應(yīng)物。

表3 Fru-Pro熱裂解產(chǎn)物中焦甜香相關(guān)成分初步定性結(jié)果Table 3 Preliminary Qualitative Results of Related Caramel like Components in Fru-Pro Thermal Cracking Products

圖1 Fru-Pro合成反應(yīng)動態(tài)變化Fig.1 Changes of Substances Contents in the Fru-Pro Synthesis Process

3 結(jié)語

作者在合成Amadori化合物條件的基礎(chǔ)上，選用菠蘿濃縮物作為反應(yīng)糖源，通過感官評吸和儀器檢測手段篩選與菠蘿糖源匹配的氨基酸，進而開發(fā)出性質(zhì)穩(wěn)定的焦甜香型且具有果香的新型Maillard煙用香料，并且在最佳匹配組合的基礎(chǔ)之上，進一步探究了相應(yīng)Amadori化合物的性質(zhì)及對焦甜香的貢獻。

對菠蘿濃縮物進行了氨基酸的匹配篩選，而且只對Fru-Pro的性質(zhì)進行了研究，后續(xù)研究中一方面可以進一步優(yōu)化其生產(chǎn)工藝以及添加量，為企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)，另一方面，可以開發(fā)其它水果糖源，以豐富產(chǎn)品種類及多樣性。

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Preparation of Cigarette Spices with Caramel Flavor Using Pineapple Concentrates as Sugar Sources

GONG Dan1，2， ZHOU Zhilei1，2，3， MENG Xiangyong1，2，3， MAO Jian*1，2，3
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine，Shaoxing 312000，China）

The study aimed to use Amadori compounds with fruit concentrates as sugar sources for cigarette flavoring.Under the reaction conditions for the synthesis of Amadori compounds，pineapple concentrates reacted with different amino acids to form pineapple and caramel-like flavors.Products were added into cigarettes and the sensory evaluation found that the perfume，F(xiàn)ru-Pro，produced by pineapple concentrate with proline，was the best.Then under the glucose-proline model system thesynthesis of Fru-Pro was conducted and monitored by HPLC and its pyrolysis products were analyzed by GC/MS.Results showed that the formation of Fru-Pro corresponded approximately to the consumption of glucose during 0～2 h，the synthesis rate gradually decreased but was always higher than the decomposition rate during 8～24 h，and after 24 h，the decomposition became faster than the synthesis.For the whole process，glucose was the limiting reactant.The main pyrolysis products included pyrroles，pyridines，pyrans，furans，cyclopentenone and pyrazines and many of them were caramel-like compounds.

Amadori compounds，caramel like aroma，pyrolysis，pineapple concentrates

TS 264.3

A

1673—1689（2017）01—0105—07

2015-01-15

*通信作者：毛 ?。?970—），男，安徽碭山人，工學(xué)博士，教授，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：biomao@263.net

鞏 丹，周志磊，孟祥勇，等.菠蘿濃縮物為糖源的Amadori焦甜香型煙用香料制備[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（01）：105-111.