食用菌提取物對胰島素抵抗細(xì)胞體外糖代謝的影響

張 超， 汪雯翰， 楊 焱*， 顏夢秋， 馮 娜， 張勁松

食用菌提取物對胰島素抵抗細(xì)胞體外糖代謝的影響

張 超1，2， 汪雯翰1， 楊 焱*1， 顏夢秋1， 馮 娜1， 張勁松1

（1.農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室/國家食用菌工程技術(shù)研究中心/上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海201306）

以高胰島素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞和地塞米松誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞兩種胰島素抵抗細(xì)胞模型，分別對9種食用菌（桑黃、靈芝、香菇、杏鮑菇、雞腿菇、灰樹花、猴頭、姬松茸和蛹蟲草）醇提物、桑黃和靈芝的4種有機溶劑（正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚）萃取物的體外降糖活性進行了研究。HepG2模型研究結(jié)果表明，9種食用菌醇提物中靈芝和桑黃醇提物促進細(xì)胞葡萄糖消耗效果最好，并且兩者高濃度組的葡萄糖消耗量均好于陽性對照組；桑黃3種有機溶劑萃取相（正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相）和靈芝4種有機溶劑萃取相促進細(xì)胞葡萄糖消耗效果較好，均好于陽性對照組。3T3-L1細(xì)胞模型結(jié)果表明，9種食用菌醇提物中靈芝和桑黃醇提物的促進葡萄糖消耗效果最好，均好于陽性對照組；靈芝及桑黃4種有機溶劑萃取相中，乙酸乙酯萃取相的葡萄糖消耗效果較好。

桑黃；靈芝；HepG2細(xì)胞；3T3-L1脂肪細(xì)胞；胰島素抵抗

II型糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，胰島素抵抗是其特征病癥之一。胰島素抵抗是指各種原因使胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，機體代償性的分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥。II型糖尿病發(fā)病率在所有糖尿病患者中接近90%。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，2025年全球糖尿病患者將達到3億，其中1.2億患者在中國、印度和日本等亞洲國家。糖尿病給患者自身、家庭和國家造成沉重的負(fù)擔(dān)，據(jù)統(tǒng)計，我國每年治療 2型糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)療總成本為20 860億元 ，占中國醫(yī)療衛(wèi)生總費用的43.8%[1]。

HepG2細(xì)胞為人的肝胚胎瘤細(xì)胞，表型與肝細(xì)胞極其相似，高濃度的胰島素可導(dǎo)致細(xì)胞表面的胰島素受體數(shù)目呈下降趨勢，與體內(nèi)胰島素水平及刺激持續(xù)時間呈正相關(guān)[2]，因而通過高胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞可建立胰島素抵抗模型。脂肪細(xì)胞的增殖與分化亦是導(dǎo)致人類肥胖、心血管疾病和Ⅱ型糖尿病等發(fā)生的主要原因，通過地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞可建立另一種胰島素抵抗模型。以上兩種胰島素抵抗模型現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于糖和脂肪代謝相關(guān)的實驗研究[3]。

當(dāng)前臨床應(yīng)用的II型糖尿病藥物主要有胰島素、胰島素類似物、磺酞脈類、雙肌類、和噬哇烷二酮（TDZ）類等，其中胰島素類藥物往往使病人產(chǎn)生依賴或拮抗，而其他藥物則具有作用慢、活性低等缺點，并常常會導(dǎo)致糖尿病患者出現(xiàn)低血糖、貧血、肥胖和耐藥性等副作用，然而天然降血糖產(chǎn)物能夠有效避免以上不良反應(yīng)。

大量研究表明多種食用菌如靈芝、桑黃、北蟲草和香菇等降血糖效果明顯[4]，作用溫和，能夠預(yù)防和治療糖尿病，是無明顯毒副作用的優(yōu)良天然降糖資源，但在相關(guān)的國內(nèi)外研究中對食用菌醇提物及其天然產(chǎn)物單體化合物的降糖作用的報道并不多見，尚未明確其降血糖作用的主要有效成分及其降糖機理。因此，作者通過HepG2和3T3-L1兩種胰島素抵抗細(xì)胞模型追蹤桑黃、靈芝和猴頭等9種食用菌提取物，及桑黃和靈芝有機溶劑萃取相對胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量的影響，篩選具有降糖活性的食用菌源性的有效部位和成分，為探討食用菌降血糖機理和相關(guān)功能食品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞和HepG2細(xì)胞 （人類肝癌細(xì)胞株）：購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）：美國Sigma公司產(chǎn)品；葡萄糖臨床檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；精蛋白生物合成人胰島素注射液：諾和諾德醫(yī)用注射產(chǎn)品。胰蛋白酶、含酚紅和無酚紅的Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培養(yǎng)基、含酚紅和無酚紅RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清 （FBS）和胰酶：GIBCO公司產(chǎn)品。

桑黃 （Phellinus baumii）和靈芝（Ganoderma lucidum）子實體由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所栽培獲得，菌種保存于中國微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心，標(biāo)本存放于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所加工技術(shù)與發(fā)酵工程研究室；香菇（Lentinula edodes）；刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii）、柱狀田頭菇 （Coprinus comatus）、灰樹花（Grifola frondosa）、猴頭菌 （Hericium erinaceus）、姬松茸（Agaricus blazei Murrill） 和 蛹 蟲 草 （Cordycepsmilitaris）子實體：上海百信生物科技有限公司提供。

DJ-10A中藥粉碎機：上海隆拓儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；BC-R2001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Heto PL-3000冷凍干燥機：賽默飛世爾科技（中國）產(chǎn)品；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀：美國BIO2TEK公司產(chǎn)品；Delta series生物安全柜：美國LABCONCO公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 活性樣品制備 桑黃、靈芝、香菇、杏鮑菇、雞腿菇、灰樹花、猴頭、姬松茸和蛹蟲草等9種食用菌子實體醇提物：參照文獻[5]制備獲得；桑黃及靈芝子實體4種有機溶劑萃取相的制備：將桑黃和靈芝醇提物分別旋蒸干后溶于體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液，再將懸濁液依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取24 h。每種有機溶劑萃取2次。各萃取液分別合并之后超低溫濃縮至干燥。

1.2.2 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立方法HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后用含 10%滅活 FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入25 mL培養(yǎng)瓶中，在37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁長滿后，傾去培養(yǎng)基，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化，每3天按1∶3比例傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，用含10%FBS的RPM I 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個/mL，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞單層貼壁后，加入含有胰島素濃度為1 500 IU/L的培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育36 h后，棄去培養(yǎng)基，用0.01 mol/L PBS洗滌1次，再加入RPM I 1640培養(yǎng)基37℃孵育20 m in。重復(fù)上述過程1次，最后用0.01 mol/L PBS洗滌后，換上無血清無酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基。

按照下列體系加樣后孵育24 h：

陰性對照組：0.01 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/孔；樣品組：0.01 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/孔+1 μL樣品/孔；陽性對照組：0.01 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/孔+1 μL 300 mmol/ L二甲雙胍/孔；孵育結(jié)束后，利用葡萄糖試劑盒進行葡萄糖消耗量的測定：取50 μL R1、50 μL R2、10 μL樣液于酶標(biāo)板，37℃孵育20 min，在波長505 nm條件下測定吸光值。

1.2.3 3T3-L1胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立方法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞置于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)方法與1.2.1中一致。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2× 104個/mL，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L IBMX，0.25 μmol/L地塞米松，286 IU/L的胰島素液，10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；吸去培養(yǎng)基，再加入含286 IU/L胰島素液的培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h；隨后以10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2 d換培養(yǎng)液1次，誘導(dǎo)分化6～10 d。90%以上3T3-L1細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型，即出現(xiàn)脂滴可用于試驗[6]。加入含終濃度為1 μmol/L地塞米松的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。棄去培養(yǎng)基，用0.01 mol/L PBS洗滌1次，再用無酚紅DMEM培養(yǎng)基37℃孵育20 m in。重復(fù)上述過程1次，最后用0.01 mol/L PBS洗滌后，換上無血清無酚紅DMEM培養(yǎng)基。

按照下列體系加樣后孵育24 h：陰性對照組：0.01 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/孔；樣品組：0.01 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/孔+1 μL樣品/孔；陽性對照組：0.01 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/孔+1 μL 300 mmol/L二甲雙胍/孔；孵育結(jié)束后，參照1.2.1方法進行葡萄糖消耗量的計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 HepG2胰島素抵抗模型

2.1.1 9種食用菌提取物對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 9種食用菌提取物對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的研究結(jié)果如圖1所示，桑黃和靈芝醇提物高濃度組促進葡萄糖消耗效果好于陽性對照組；其他7種食用菌（香菇、杏鮑菇、雞腿菇、灰樹花、猴頭、姬松茸和蛹蟲草）的醇提物高濃度組也呈現(xiàn)一定的促進葡萄糖消耗作用，與陰性對照相比有顯著性差異；北蟲草醇提物高濃度組葡萄糖消耗量與陽性對照組接近。

2.1.2 靈芝及桑黃4種有機萃取相對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 基于2.1.1的實驗結(jié)果，進一步跟蹤桑黃和靈芝的4種有機溶劑萃取相促葡萄糖消耗作用，研究結(jié)果如圖2和圖3所示。靈芝4種萃取相組葡萄糖消耗量顯著高于陽性對照。桑黃石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相各濃度組葡萄糖消耗效果均高于陽性對照，并呈濃度梯度依賴性，氯仿萃取相效果較弱。

圖1 9種食用菌醇提物對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.1 Effect of nine species edible fungi on glucose consumption in insulin-resistant HepG2 cells

圖2 4種靈芝萃取相對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.2 Effect of four phase G.Lucidum extractson glucose consumption in insulin-resistant HepG2 cells

圖3 4種桑黃萃取相對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.3 Effect of four phase P.baumii extracts on glucoseconsumption in insulin-resistant HepG2 cells

2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型

2.2.1 9種食用菌醇提物對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 9種食用菌醇提物對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的實驗結(jié)果如圖4所示，在9種食用菌醇提取物中，靈芝和桑黃醇提物促3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗效果最好，高濃度靈芝醇提物和桑黃醇提物的葡萄糖消耗量均好于陽性對照組。

圖4 9種食用菌提取物對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.4 Effect of nine species edible fungi on glucose consumption in insulin -resistant 3T3 -L1 adipocyte cells

2.2.2 靈芝和桑黃4種有機萃取相對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 2.2.1的實驗結(jié)果表明靈芝和桑黃在九種食用菌醇提物中促葡萄糖消耗效果是最佳的，因此進一步利用此模型跟蹤桑黃和靈芝的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4種萃取相的促3T3-L1葡萄糖消耗作用。實驗結(jié)果如圖5和圖6所示，靈芝和桑黃的乙酸乙酯萃取相效果均好于其他有機溶劑萃取相，高濃度乙酸乙酯萃取相的葡萄糖消耗量顯著高于陽性對照組，并呈現(xiàn)濃度梯度依賴性。

圖5 4種靈芝萃取相對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.5 Effect of four phase P.baumii extracts on glucose consumption in insulin-resistant 3T3-L1 adipocyte cells

圖6 4種桑黃萃取相對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.6 Effect of four G.Lucidum extracts on glucose consumption in insulin-resistant 3T3-L1 adipocyte cells

3 結(jié)語

脂肪、肝臟和肌肉是胰島素抵抗的主要靶器官，因而肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨骼肌源性的細(xì)胞株常被用來建立胰島素抵抗模型7。肝臟是人體的物質(zhì)代謝中心，并且相比其他內(nèi)臟器官其胰島素受體分布十分密集，因而是影響胰島素促進葡萄糖攝取的主要靶器官；HepG2細(xì)胞株是一種人分化肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞株，其生化特性及生物合成能力與人正常肝細(xì)胞極為相似，因此HepG2胰島素抵抗模型能夠較為準(zhǔn)確模擬體內(nèi)胰島素抵抗的發(fā)生過程，是一種可靠的胰島素抵抗模型。脂肪組織是人體重要的能量儲存器和內(nèi)分泌器官，但脂肪組織過多積累會導(dǎo)致大量脂肪酸溢出，并異位沉積，從而引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗；有研究表明，脂肪組織是胰島素抵抗的始發(fā)部位，脂肪細(xì)胞合成和分泌瘦素、抵抗素、腫瘤壞死因子、白介素、促分裂原活化蛋白激酶等多種活性物質(zhì)，這些因子在胰島素抵抗發(fā)生過程中具有重要作用。3T3-L1前脂肪細(xì)胞是從17-19天齡小鼠胚胎Swiss 3T3細(xì)胞中分離獲得的前體細(xì)胞，具有單一分化潛能，適當(dāng)條件下可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。

靈芝和桑黃是民間較為常見的兩種藥用真菌，具有增強免疫力、抗癌和抗氧化等藥效學(xué)活性。作者前期動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑黃乙酸乙酯萃取相具有良好的降糖活性，而進一步提示靈芝和桑黃有機溶劑萃取相能明顯促進HepG2和3T3-L1細(xì)胞葡萄糖消耗量上升，但具體為哪一種或幾種有效物質(zhì)還有待后續(xù)深入研究。

[1]FAN Yinglan，DU Jialin，LI Xianhua，et al.Detriment and protection of diabetes mellitus[J].J PRA TRAD CHIN INTER MED，2012，26（6）：56-58.（in Chinese）

[2]WILLIAMS J F，OLEFSKY J M.Defecetive insulin receptor function in down-regulated HepG2 cell[J].Endocrino，1990，127（4）：1706-1717.

[3]SOARESA F，GUICHARDANTM，COZZONE D，et al.Effects of oxidative stress on adiponectin secretion and lactate p roduction in 3T3-L1 adipocytes[J].Free Radic Biol Med，2005，38（7）：882-889.

[4]LU Fei，LI Bo，SUO Xiaomin，et al.Research advances in hypoglycemic activity of edible fungi[J].Food Res Dev，2010，31（2）：189-193.（in Chinese）

[5]WANG Wenhan，ZHANG Jingsong，YANG Yan，et al.A comparative study on antioxidant and anti-aging activities of ten edible /medicinal fungi[J].Nat Prod Res Dev，2013，25（8）：1027-1032.（in Chinese）

[6]ANIL K L，MARITA A R.Troglitazone prevents and reverses dexamethasone induced insulin resistance on glycogen synthesis in 3T3 adipocyte[J].Br J Pharmacol，2000，130：351-358.

[7]CAO Li，MAO Caiping，GU Zhenlun.The influence of puerarin on glucose consumption of high insulin rats hepatic cells[J].Chin J Hemorh，2007，17（2）：215-216，232.（in Chinese）

Effect of Different Edible Fungi on the Bioactivity of Anti-Insulin Resistance in Insulin Resistant Cells

ZHANG Chao1，2， WANG Wenhan1， YANG Yan*1， YAN Mengqiu1， FEN Na1， ZHANG Jingsong1
（1.Key Laborator of Edible Fungi Resources and Utilization/National Engineering Research Center of Edible Fungi/Institute of Edible Fungi,Shanghao Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；2.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The effect of nine different edible fungi ethanolic extracts（Phellinus baumii，Ganoderma lucidum，Cordyceps militaris，Agaricus blazei，Coprinus comatus，Lentinula edodes，Grifola frondosa，Hericium erinaceus and Pleurotus eryngii）on glucose consumption was investigated in two models of insulin-resistant cells （high concentration insulin-induced HepG2 and dexamethasone-induced 3T3-L1）.The glucose consumption of alcoholic extracts from the edible mushroom using four different organic solution （petroleum ether，chloroform，ethyl acetate and n-butanol phase）from G. Lucidum or P.Baumii was detected in the two cell models.The cell glucose consumption wasgreatly enhanced by the ethanolic extracts from G.Lucidum or P.baumii in HepG2 model.A better result of glucose consumption was achieved for the two groups with high-concentration compared with the positive control.The cell glucose consumption was also effectively promoted by P.baummi extracted by petroleum ether，ethyl acetate or n-butanol，and similar improvement was observed in G. Lucidum extracted with four types of organic solvents.The glucose consumption increased by ethanolic extracts from G.Lucidum and P.baumii in the study of 3T3-L1 adipocyte cell model.The extracts from P.baummi and G.Lucidum by ethyl acetate facilitated the glucose consumption.

Ganoderma Lucidum，Phellinus Baumii，HepG2 cell，3T3-L1 adipocyte cells，insulinresistant

Q 53

A

1673—1689（2017）01—0022—05

2015-03-14

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD36B05）。

*通信作者：楊 焱（1970—），女，貴州石阡人，工學(xué)博士，研究員，主要從事藥用真菌研究。E-mail:yangyan@saas.sh.cn

張 超，汪雯翰，楊 焱，等.食用菌提取物對胰島素抵抗細(xì)胞體外糖代謝的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（01）：22-26.