不結球白菜活性物質(zhì)的提取工藝及其抗氧化性

馬景蕃++寇宗娟++劉喜明++鐘麗娟++吳程

摘要：利用超聲波法提取不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）中抗氧化活性物質(zhì)，以抗氧化活性為指標，采用響應面法研究超聲功率、超聲時間、料液比、乙醇體積分數(shù)對產(chǎn)物抗氧化活性的影響。結果表明，在超聲功率317 W、超聲時間60 min、料液比1∶20（m∶V）、乙醇體積分數(shù)70%的條件下，產(chǎn)物抗氧化活性即Trolox濃度為59 076.4 μmol/L。產(chǎn)物對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子都具有清除作用，其IC50值分別為0.45、1.03、0.59 mg/mL。

關鍵詞：不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）；超聲波提??；抗氧化

中圖分類號：S634.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0526-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.034

Optimization of Extraction of Bioactive Components from Non-heading Chinese Cabbage and Its Antioxidant Activity

MA Jing-fan1， KOU Zong-juan1， LIU Xi-ming2， ZHONG Li-juan1， WU Cheng1

（1.School of Life Sciences， Longyan University， Longyan 364012， Fujian，China；2.School of Art Design， Longyan University，

Longyan 364012， Fujian，China）

Abstract： Antioxidant substances was extracted from non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp. chinensis Makino） in supersonic method. Regard the antioxidant activity as an index， the effects of supersonic power， supersonic time， solid-liquid ratio and ethanol concentration on the antioxidant activity were studied by the response surface analysis. The results showed that under the conditions of 317 W supersonic power， 60 min supersonic time， 1∶20（m∶V） solid-liquid ratio and 70% ethanol concentration，the concentration of Trolox was 59 076.4 μmol/L. Products had scavenging action to DPPH radical， hydroxyl radical， and superoxide anion. IC50 were 0.45 mg/mL， 1.03 mg/mL， and 0.59 mg/mL， respectively.

Key words： non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）； supersonic extraction； antioxidant activity

不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）是長江中下游地區(qū)主栽蔬菜品種之一[1]，中醫(yī)認為不結球白菜微寒味甘，有養(yǎng)胃生津、除煩解渴、利尿通便、清熱解毒的功效[2]。民間素有用帶根不結球白菜120 g，加生姜、蔥白各10 g，煨湯防治感冒與咳嗽[3]。近20多年來，國內(nèi)外學者從不結球白菜中分離得到一系列復雜的化學成分，其中相當一部分具有生理活性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，不結球白菜提取物抗氧化的效果好，尤以未完全成熟，葉形舒展的嫩株抗氧化效果尤佳[5]。在防癌食品排行榜中，不結球白菜排在大蒜后面，名列第二[6]。最新研究還發(fā)現(xiàn)，不結球白菜提取物能提升血液中雌激素代謝物-2羥雌酮的水平，對預防乳腺癌有益[7]。這說明不結球白菜不但可作為一種食品，同時又具有保健作用和藥用價值。

響應面分析法（Response Surface Method，RSM）是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法[8]。以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，確定各因素及其交互作用對各指標的影響，精確地表述因素和響應值之間的關系，越來越多地應用于各種生物化工處理過程。本研究采用RSM法優(yōu)化了不結球白菜活性物質(zhì)的提取工藝，并對其抗氧化活性進行了評價，為不結球白菜的綜合利用及產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

不結球白菜蘇州青由龍巖學院生物技術課題組提供。采收后，用聚乙烯膜真空包裝，迅速用液氮冷凍，真空冷凍干燥后粉碎過100目篩。

1.2 方法

1.2.1 DPPH自由基清除 稱取12.012 mg的Trolox標準品，用去離子水定容至200 mL。利用超聲波將Trolox標準品充分溶解，得到濃度為240 μmol/L的Trolox標準品溶液，加入去離子水稀釋后分別得到濃度為40、80、120、160、200 μmol/L 的Trolox標準品溶液。將質(zhì)量為10 mg的 DPPH用甲醇定容至100 mL，將其稀釋后得到濃度為20 mg/L的DPPH甲醇溶液。吸取10 μL的Trolox水溶液，加入990 μL的DPPH甲醇溶液，定容至4 mL，混合均勻，暗處避光反應30 min，在517 nm處測定吸光度。根據(jù)試驗結果，使用EXCEL軟件的線性擬合功能繪制DPPH自由基清除Trolox的標準曲線，并得到線性回歸方程[9]。

1.2.2 提取不結球白菜抗氧化活性物質(zhì)的單因素試驗

1）料液比。準確稱取5.0 g不結球白菜粉，在乙醇體積分數(shù)70%，功率 400 W，提取時間40 min的條件下，分別考察1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30及1∶35（m∶V，下同）的料液比對不結球白菜抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。

2）超聲時間。準確稱取5.0 g不結球白菜粉，乙醇體積分數(shù)70%，功率400 W，料液比1∶20，考察30、40、50、60、70、80 min的不同超聲時間對不結球白菜抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。

3）乙醇體積分數(shù)。準確稱取5.0 g不結球白菜粉，功率400 W，料液比1∶20，超聲時間60 min，考察40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇對不結球白菜抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。

4）超聲波功率。準確稱取5.0 g不結球白菜粉，乙醇體積分數(shù)70%，超聲時間60 min，料液比1∶20，考察100、200、300、400、500、600 W的超聲功率對不結球白菜抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D），利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken功能，以Trolox濃度為響應值，采用四因素三水平的響應面法優(yōu)化不結球白菜抗氧化活性物質(zhì)的提取條件，各因素和水平設計見表1。

1.2.4 不結球白菜活性物質(zhì)的抗氧化性 DPPH自由基清除率的測定采用DPPH 95%乙醇體系法[10]；羥自由基清除率的測定采用二價鐵離子測定法[11]；超氧陰離子自由基清除率的測定采用光照核黃素測定法[12]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

回歸方程為Y=-0.000 5X+0.701，R2=0.998 3，表明Trolox濃度在0～1 000 μmol/L范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

由圖1a可知，當料液比從1∶10到1∶20變化時，Trolox濃度顯著增大（P<0.05），這時隨著有機溶劑的量逐漸增多，促使越來越多的不結球白菜活性成分溶于其中[13]，但當料液比從1∶20到1∶35時， Trolox濃度變化不明顯（P>0.05），這可能是因為當有機溶劑增加到一定程度時，不結球白菜中的活性物質(zhì)大多已經(jīng)溶解出來，再繼續(xù)增加有機溶劑的含量對提取影響不大[14]，故料液比采用1∶20。

由圖1b可知，當超聲時間從30 min到60 min時，Trolox濃度呈顯著上升趨勢（P<0.05），說明隨著超聲時間的延長，超聲波作用對不結球白菜細胞壁的效果增強，使其破碎更為徹底，其中的活性成分更容易被有機溶劑溶出。但當超聲時間從60 min延長到80 min時，Trolox濃度上升幅度減小，且相鄰兩處理間差異不顯著（P>0.05），這可能是不結球白菜活性成分的溶出已達到飽和。因此，超聲波的最佳提取時間控制在60 min為宜。

從圖1c可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的逐漸增加，Trolox濃度呈顯著增加的趨勢（P<0.05），當乙醇體積分數(shù)為70%時，Trolox濃度最大；這說明較高體積分數(shù)的乙醇有利于不結球白菜活性成分的溶出。但當乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大時，Trolox濃度呈下降趨勢（P>0.05），這說明不結球白菜活性成分的溶出隨著乙醇體積分數(shù)的增加沒有明顯的正相關關系。因此，可以得出最佳乙醇體積分數(shù)為70%。

從圖1d可以看出，當超聲功率從100 W增加到300 W的過程中，Trolox濃度顯著增大（P<0.05），當超聲功率達到300 W時，Trolox濃度達到最大值，但當超聲功率從300 W繼續(xù)增加到600 W時，Trolox濃度反而有所下降，可能是由于當超聲功率增大到一定程度時，其對不結球白菜細胞壁的破碎程度達到最大，再繼續(xù)增強超聲功率就不會對Trolox濃度造成太大影響。因此，可以得出最佳超聲功率為300 W。

2.3 響應面法優(yōu)化不結球白菜活性物質(zhì)提取工藝

2.3.1 響應面試驗結果 以單因素試驗結果為基礎，利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化不結球白菜活性物質(zhì)的提取工藝，其設計方案及結果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸分析[15]，得到Trolox濃度（Y）對因素A、B、C及D相應的二次方程模型：Y= 58 722.24 + 4 002.42A - 70.84B - 613.13C + 779.54D-203.45AB + 859.65AC - 573.10AD - 628.58BC-397.45 BD+388.23CD - 5 834.77A2 - 3 024.73B2 - 2 423.97C2 - 3 292.86D2。同時對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，其結果見表3。

從表3中可以看出，回歸模型達到極顯著水平（P<0.01），說明模型預測值和實際值非常吻合，模型可靠。失擬項P>0.05，說明未知因素對試驗結果影響較小?；貧w方程相關系數(shù)R2=0.990 0，顯示響應值的變化99.00%來源于超聲功率（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、和乙醇體積分數(shù)（D）4個變量。因此，回歸方程具有較高的擬合度和可信度，說明回歸方程與實際情況吻合較好，可用以推測真實試驗的提取效果。其中，一次項A、C、D及二次項A2、B2、C2、D2對Trolox濃度的影響極顯著。對回歸方程中一次項系數(shù)的絕對值進行比較，可判斷因子影響的主次性，結合方差分析結果，確定對Trolox濃度的影響從大到小的順序依次為超聲功率、乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間。

2.3.2 各因子交互作用對Trolox濃度的影響 在其他因素為零的水平上，利用軟件選擇超聲功率、乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間4個變量中的2個交互因素對Trolox濃度的影響進行分析，回歸優(yōu)化得到相應的響應面及等高線圖，其中顯著交互項的響應曲面見圖2。由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，Trolox濃度隨超聲功率和料液比的增大而增大，在交互作用等高線中，等高線沿A軸方向變化相對密集，說明超聲功率對響應值峰值的影響大于料液比，這與回歸分析結果相同。

2.3.3 最佳提取工藝及驗證 結合回歸模型的數(shù)學分析結果，不結球白菜活性物質(zhì)的最佳提取工藝為超聲功率316.73 W、超聲時間59.89 min、料液比 1∶19.71、乙醇體積分數(shù)70.43%，此條件下Trolox濃度的預測值為59 444.7 μmol/L?？紤]到實際操作的便利，將不結球白菜活性物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)調(diào)整為超聲功率317 W、超聲時間60 min、料液比 1∶20、乙醇體積分數(shù)70%，此條件下Trolox濃度的理論值為59 445.1 μmol/L。以最佳提取工藝條件，重復3次試驗，得到Trolox濃度值為59 076.4 μmol/L。兩者相比，相對誤差約為0.62%，說明響應面法優(yōu)化結果可靠。

2.4 不結球白菜提取物的抗氧化活性測定

2.4.1 提取物對DPPH自由基清除率的測定 根據(jù)響應面法最佳提取工藝制備不結球白菜的活性提取物，稱取提取物干燥粉末，用去離子水分別配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液，測定DPPH自由基清除率，結果見圖3。由圖3可知，隨著不結球白菜提取物濃度的增大，對DPPH自由基的清除率也逐漸增大，當提取物的濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基清除率達到91%，IC50為0.45 mg/mL。

2.4.2 提取物對羥自由基清除率的測定 稱取最佳提取工藝下制備的不結球白菜活性提取物干燥粉末，用去離子水分別配成1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL的溶液，測定其對羥自由基的清除率，結果見圖4。由圖4可知，隨著不結球白菜提取物濃度的增大，對羥自由基的清除率也隨之增大，當提取物的濃度為1.8 mg/mL時，羥自由基清除率達到了77%，IC50值為1.03 mg/mL。

2.4.3 提取物對超氧陰離子清除率的測定 稱取最佳提取工藝下制備的不結球白菜活性提取物干燥粉末，用水分別配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液，測定提取物對超氧陰離子的清除率，結果見圖5。由圖5可知，隨著提取物濃度的增大，對超氧陰離子的清除率也逐漸增大，當不結球白菜提取物的濃度為1.0 mg/mL時，超氧陰離子清除率為76%，IC50值為0.59 mg/mL。

3 小結

在單因素試驗的基礎上，用響應面法優(yōu)化不結球白菜活性物質(zhì)的超聲波提取條件。結果表明，超聲功率、料液比和乙醇體積分數(shù)對Trolox濃度的影響顯著，超聲功率與料液比交互作用對Trolox濃度影響顯著。對Trolox濃度的影響從大到小的順序依次為超聲功率、乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間。優(yōu)化后不結球白菜活性物質(zhì)的最佳提取工藝為超聲功率317 W、超聲時間60 min、料液比1∶20、乙醇體積分數(shù)70%，此條件下Trolox濃度值為59 076.4 μmol/L，與預測值的相對誤差為0.62%。

自由基是機體氧化反應中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，能夠損害機體的細胞和組織，甚至引起衰老效應或者慢性疾病，本試驗對最佳提取工藝下制備的不結球白菜活性提取物進行了抗氧化研究，其對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子都表現(xiàn)出較好的清除能力，IC50值分別為0.45、1.03、0.59 mg/mL。在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著活性提取物濃度的增加，其清除自由基的活性增大。本研究為不結球白菜在醫(yī)藥和保健等方面的深入研究和應用提供參考和依據(jù)，而對于不結球白菜抗氧化活性成分的分離純化還有待進一步研究。

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