白蛋白導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞NLRP3炎性體激活的機(jī)制分析

丁麗紅，呂林莉，王德光，郝 麗

蛋白尿是許多腎小球疾病的共同臨床表現(xiàn)，也是導(dǎo)致腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化及慢性腎功能衰竭的一種重要致病因素[1]。已有研究表明蛋白尿可以直接或間接損傷腎小管上皮細(xì)胞，介導(dǎo)間質(zhì)慢性炎癥的發(fā)生。本組之前體內(nèi)[2]和體外[3]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尿中白蛋白可以通過(guò)激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的NLRP3炎性體，活化Caspase 1，釋放IL-1β和IL-18引起腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)，但是白蛋白激活NLRP3炎性體的機(jī)制尚不明確。NLRP3炎性體是目前研究最為深入的炎性體，各種體內(nèi)外的刺激因素可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流、溶酶體膜破裂后組織蛋白酶B(Cathepsin B)釋放和活性氧(ROS)產(chǎn)生這三種模式激活NLRP3炎性體[4]。本實(shí)驗(yàn)擬觀察不同蛋白尿水平的膜性腎病患者腎組織中Cathepsin B的表達(dá)，并用高濃度的BSA體外刺激HK-2細(xì)胞，再分別用高濃度KCl、Cathepsin B的抑制劑CA 074 Me以及ROS的抑制劑二苯基氯化碘(diphenyliodonium chloride, DPI)作用于HK-2細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)促炎因子IL-1β和IL-18生成的情況，探討白蛋白激活NLRP3炎性體的可能途徑和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床資料選擇30例經(jīng)臨床和腎穿刺活檢確診為原發(fā)性膜性腎病的患者，排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙肝相關(guān)性腎炎、腫瘤等繼發(fā)性膜性腎病[5]。根據(jù)不同水平的24 h尿蛋白定量分為三組，其中低蛋白尿組(<1 g/24 h)、中蛋白尿組(1～3.5 g/24 h)和高蛋白尿組(>3.5 g/24 h)各10例。所選30例患者在腎穿刺活檢前均未接受激素和(或)免疫抑制劑治療。

1.2HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)和干預(yù)于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，每3天更換新鮮含5%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液1次。干預(yù)前將HK-2細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)至部分融合或全部融合時(shí)，用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液洗2次后，去血清培養(yǎng)24 h，再給予20 mg/mL的BSA培養(yǎng)24 h。

1.3細(xì)胞藥物干預(yù)HK-2細(xì)胞按0.5×106/mL種植于6孔板，細(xì)胞融合80%時(shí)加入不同的干預(yù)藥，分別為：對(duì)照組、BSA干預(yù)組、高濃度KCl干預(yù)組、高濃度NaCl干預(yù)組、CA 074 Me干預(yù)組、DPI干預(yù)組和二甲基亞砜組(DMSO組)(溶劑對(duì)照)。加入KCl、NaCl和CA 074 Me時(shí)，同時(shí)加入BSA共同培養(yǎng)24 h，而DPI先單獨(dú)干預(yù)HK-2細(xì)胞2 h后，再加入BSA共同刺激24 h。

1.4Westernblot將6孔板中細(xì)胞去除培養(yǎng)基，加入裂解液，離心取上清液檢測(cè)蛋白濃度。取等量組織蛋白樣本變性后凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h，加入以封閉液稀釋的Cathepsin B(1 ∶1 000，美國(guó)Santa Cruz公司)，IL-1β(1 ∶1 000，美國(guó)Santa Cruz公司)和IL-18(1 ∶1 000，美國(guó)Santa Cruz公司)一抗，4 ℃過(guò)夜，洗膜，加入TBST稀釋的二抗 (1 ∶5 000)，室溫孵育2 h，洗膜，ECL(美國(guó)GE Healthcare)化學(xué)發(fā)光法曝光。以β-actin(1 ∶1 000，美國(guó)Santa Cruz公司)作為內(nèi)參照。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR6孔板細(xì)胞每孔加入Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA，取樣品對(duì)總RNA進(jìn)行純度、濃度及完整性的測(cè)定。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。10 μL反應(yīng)體系，條件為37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。以雙蒸水代替cDNA模板作為陰性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)所用引物由南京金斯瑞公司設(shè)計(jì)及合成，引物序列為：IL-1β上游5′-CCATGCAATTTGTGTCTTCC-3′，下游5′-ACAACAGGAAA GTCCAGGCT-3′，長(zhǎng)度135 bp。IL-18上游5′-AGCTT GCTGAGCCCTTTG-3′，下游5′-TGTGTAGACTGCAG CAGGTG-3′，長(zhǎng)度131 bp。GADPH上游5′-TGGT ATCGTGGAAGGACTCA-3′，下游5′-CCAGTAGAGGC AGGGATGAT-3′，長(zhǎng)度132 bp。

1.6免疫組化法免疫組化采用SP法。將腎組織石蠟塊連續(xù)3～4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)微波修復(fù)后，采用免疫組化(SP試劑盒，福州邁新公司)檢測(cè)Cathepsin B(1 ∶100，美國(guó)Santa Cruz公司)的表達(dá)。PBS緩沖液作為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，用Image-pro plus 6.0軟件分析，以累計(jì)吸光度(A值)表示Cathepsin B陽(yáng)性表達(dá)的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1CathepsinB在不同蛋白尿水平的膜性腎病患者腎組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，Cathepsin B陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)，且低蛋白尿組膜性腎病患者腎小管上皮細(xì)胞中僅有少量表達(dá)，而高蛋白尿組腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著增強(qiáng)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 不同蛋白尿水平的膜性腎病患者腎組織中Cathepsin B的表達(dá)

與低蛋白尿組相比，*P<0.05；與中蛋白尿組相比，#P<0.05

2.2BSA刺激HK-2細(xì)胞后CathepsinB蛋白的表達(dá)在體外實(shí)驗(yàn)中，用20 mg/mL濃度的BSA刺激HK-2細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)HK-2細(xì)胞中Cathepsin B蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，BSA刺激后的HK-2細(xì)胞中，Cathepsin B蛋白明顯高于對(duì)照組(圖2)。

圖2 Western blot法檢測(cè)BSA刺激HK-2細(xì)胞后Cathepsin B蛋白的表達(dá)

Control: 對(duì)照組；AO: 白蛋白負(fù)荷組

2.3高濃度鉀離子對(duì)BSA刺激的HK-2細(xì)胞中IL-1β和IL-18表達(dá)的影響為了驗(yàn)證鉀離子外流是否為白蛋白激活NLRP3炎性體的途徑，實(shí)驗(yàn)用20 mg/mL濃度的BSA刺激HK-2細(xì)胞，同時(shí)加入高濃度的KCl(150 mmol/L)、NaCl(150 mmol/L)共同刺激HK-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AO組、高濃度KCl組和NaCl組均可使IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平顯著升高(P<0.05)，但高濃度KCl組與AO組及高濃度NaCl組相比，高濃度KCl并未影響IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA的表達(dá)水平，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3 高濃度鉀離子對(duì)BSA刺激的HK-2細(xì)胞中IL-1β、IL-18蛋白(A)和mRNA(B)表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.4CathepsinB的抑制劑CA074Me對(duì)BSA刺激的HK-2細(xì)胞中IL-1β和IL-18表達(dá)的影響為了驗(yàn)證Cathepsin B釋放是否為白蛋白激活NLRP3炎性體的途徑，用20 mg/mL濃度的BSA體外刺激HK-2細(xì)胞時(shí)，同時(shí)加入CA 074 Me(10 μmol/L)和DMSO共同作用于HK-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AO組及DMSO組IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平顯著升高(P<0.05)；但與AO組相比，DMSO組IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA水平無(wú)明顯變化，而CA 074 Me組的Cathepsin B釋放被抑制后，IL-1β和IL-18的蛋白和mRNA的水平明顯降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 CA 074 Me對(duì)BSA刺激的HK-2細(xì)胞中IL-1β、IL-18蛋白(A)和mRNA(B)表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與AO組相比，#P<0.05

2.5ROS的抑制劑DPI對(duì)BSA刺激的HK-2細(xì)胞中IL-1β和IL-18表達(dá)的影響為了驗(yàn)證ROS生成增多是否為白蛋白激活NLRP3炎性體的途徑，實(shí)驗(yàn)先用DPI(10 μmol/L)和DMSO作用于HK-2細(xì)胞2 h后，再加入20 mg/mL濃度的BSA刺激HK-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AO組及DMSO組IL-1β、IL-18的蛋白和mRNA水平顯著升高(P<0.05)，但與AO組相比，DMSO組IL-1β、IL-18的蛋白和mRNA水平無(wú)明顯變化，而DPI組的ROS生成被抑制后，IL-1β、IL-18的蛋白和mRNA的水平明顯降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與AO組相比，#P<0.05

3 討論

研究表明，NLRP3炎性體可以被多種外源性病原相關(guān)分子模式(PAMPs)如細(xì)菌、病毒和真菌等，及內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，如胞外ATP、UA等通過(guò)不同的途徑激活，但其激活機(jī)制尚不清楚[6]。目前的研究大多數(shù)認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流、溶酶體膜破裂導(dǎo)致其內(nèi)的Cathepsin B釋放和ROS產(chǎn)生這三種模式[7]是NLRP3炎性體激活的主要方式，并且對(duì)這三種模式的研究較多。

鉀離子外流相關(guān)活化通路：研究認(rèn)為，上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞受損或者應(yīng)激時(shí)ATP釋放到胞外，胞外ATP或穿孔素可激活細(xì)胞膜上P2X7受體離子門控通道及pannexin-1通道開放，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，鉀離子外流，刺激物可以通過(guò)該微孔直接活化NLRP3炎性體[8]。另外，能通過(guò)介導(dǎo)該微孔結(jié)構(gòu)活化的微生物毒素酶類(如尼日利亞菌素、氣單胞菌溶素)均可由此激活NLRP3炎性體。還有研究表明，一些不能被細(xì)胞吞噬的晶體物質(zhì)(如MSU)和某些毒素介導(dǎo)的微孔結(jié)構(gòu)活化也能引起鉀離子外流，最終導(dǎo)致NLRP3炎性體的活化。

Cathepsin B活化通路：細(xì)胞吞噬某些微粒樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)或晶體類后，如MSU[9]、二氧化硅、石棉等，可導(dǎo)致溶酶體損傷甚至破裂，溶酶體破裂后可釋放Cathepsin B至胞質(zhì)內(nèi)，Cathepsin B通過(guò)某些方式激活NLRP3炎性體。研究表明，抑制溶酶體的破裂或減少Cathepsin B的釋放可以阻斷NLRP3炎性體的激活。其他類型的激活劑是否如晶體類或微粒樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)一樣，通過(guò)影響溶酶體及Cathepsin B激活NLRP3炎性體，目前還不明確。

ROS介導(dǎo)的活化通路：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道可以發(fā)現(xiàn)，目前已知的多種NLRP3炎性體活化信號(hào)均能通過(guò)促進(jìn)ROS生成而激活NLRP3炎性體，而且應(yīng)用ROS清除劑或抑制劑后可以明顯抑制NLRP3炎性體的活化。Zhou等[10]研究發(fā)現(xiàn)線粒體來(lái)源的ROS是引起NLRP3炎性體激活的關(guān)鍵信號(hào)，提示NLRP3炎性體激活與線粒體的功能密切相關(guān)。Tsehopp等[11]研究證實(shí)，使用ROS的抑制劑可以阻斷NLRP3炎性體的激活，進(jìn)而明顯抑制IL-1β的生成，而且他認(rèn)為在上述三種激活模式中，起最關(guān)鍵作用的是ROS的生產(chǎn)增多。本組前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)高濃度的白蛋白長(zhǎng)期刺激可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體的功能受損，引起ROS的生成增多，最終導(dǎo)致NLRP3炎性體的激活[12]。

在本組實(shí)驗(yàn)中，用高濃度KCl的目的是用較高的細(xì)胞外鉀離子濃度抑制HK-2細(xì)胞的鉀離子外流，為了排除高濃度導(dǎo)致的高滲狀態(tài)對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生的影響，用同樣濃度的NaCl作為濃度對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制鉀離子外流后并沒有引起B(yǎng)SA刺激的HK-2細(xì)胞中IL-1β和IL-18表達(dá)減少。用CA 074 Me的目的是抑制溶酶體破裂而釋放的Cathepsin B，用DPI的目的是抑制ROS的產(chǎn)生，用DMSO作為溶劑對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA 074 Me以及DPI分別抑制Cathepsin B的釋放和ROS的生成后，均可引起IL-1β和IL-18的表達(dá)明顯減少，這表明白蛋白引起的腎小管上皮細(xì)胞NLRP3炎性體的激活可能與鉀離子外流無(wú)關(guān)，而與Cathepsin B的釋放和ROS的生成有關(guān)。

眾所周知，尿中的蛋白成分經(jīng)過(guò)腎小球過(guò)濾進(jìn)入腎小管后，可以被腎小管重吸收，已有研究表明，絕大部分腎小管腔內(nèi)的蛋白是與近端腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣上的Cubilin和Megalin受體蛋白結(jié)合后，再被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體內(nèi)進(jìn)行分解、利用[13]，所以健康人每日尿中蛋白質(zhì)的含量小于150 mg。但當(dāng)進(jìn)入近端腎小管內(nèi)的蛋白量超出其重吸收能力時(shí)，尿中就會(huì)出現(xiàn)較多的蛋白，從而形成蛋白尿。因此，我們推測(cè)當(dāng)大量尿蛋白進(jìn)入小管腔時(shí)，腎小管重吸收蛋白系統(tǒng)的負(fù)荷也會(huì)明顯增加，一方面重吸收的蛋白使上皮細(xì)胞的溶酶體活性增加，導(dǎo)致溶酶體破裂后，其內(nèi)的Cathepsin B釋放入胞質(zhì)內(nèi)，從而激活NLRP3炎性體；另一方面小管上皮細(xì)胞對(duì)蛋白的重吸收和處理需要消耗的能量也增加，除了導(dǎo)致小管細(xì)胞缺氧損傷外，生成的ROS也增多，最終激活NLRP3炎性體。此外，大量的蛋白尿滯留在小管腔內(nèi)還可以形成蛋白管型，堵塞管腔，使小管上皮細(xì)胞缺氧加重，最終導(dǎo)致小管萎縮及纖維化。上述這些因素可能是大量白蛋白長(zhǎng)期作用，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性體激活，并造成小管間質(zhì)炎癥及纖維化的機(jī)制。

綜上所述，白蛋白可能是通過(guò)腎小管上皮細(xì)胞中Cathepsin B釋放和ROS生成增多這兩條途徑激活NLRP3炎性體，這為研究蛋白尿?qū)е履I小管間質(zhì)炎癥和纖維化的機(jī)制提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為延緩慢性腎臟病發(fā)生、發(fā)展及治療提供新方向。

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