莠去津高效降解菌的分離與鑒定

呂惠萍

（菏澤學(xué)院化學(xué)化工系，山東 菏澤 274015）

莠去津高效降解菌的分離與鑒定

呂惠萍

（菏澤學(xué)院化學(xué)化工系，山東 菏澤 274015）

筆者從長(zhǎng)期使用莠去津的農(nóng)田和果園的土壤中分離到3株莠去津降解菌，編號(hào)為AT-2、AT-3、AT-4。通過生理生化指標(biāo)和形態(tài)分析，對(duì)AT-2以及本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的3株降解菌HB-1、HB-7、HW-4進(jìn)行初步鑒定，分別為土壤桿菌屬、布魯氏菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬。測(cè)定這4株菌的降解率，反應(yīng)條件為：底物莠去津濃度為100mg·L-1，反應(yīng)體系5mL，5%的接菌量，恒溫30℃，180r·min-1，培養(yǎng)24h，其降解效率分別為34.2%、37.3%、43%和40%，但在3d后，4株菌的降解率可達(dá)到90%左右。

莠去津；降解菌 ；降解率

莠去津（Atrazine）又名阿特拉津，化學(xué)名稱為2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪，是一種選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型苗前、苗后除草劑。但由于其殘留期長(zhǎng)(4~57周)，形成了對(duì)土壤、水體等的污染。2002年Nature上報(bào)道了莠去津在低于EPA飲用水標(biāo)準(zhǔn)的暴露劑量下,導(dǎo)致了非洲爪蛙性別的改變，使其以內(nèi)分泌干擾物（EDC）的“身份”再次引起人們的關(guān)注[1-3]。

環(huán)境中莠去津的降解代謝可分為生物過程和非生物過程，其中生物降解代謝是去除莠去津污染的主要途徑。20世紀(jì)60年代以來(lái)，許多國(guó)家均致力于尋找莠去津的高效降解微生物的研究，截止到目前，分離到的降解莠去津的微生物主要包括細(xì)菌、真菌[4]、藻類[5]等。降解莠去津的細(xì)菌主要有諾卡氏菌（N ocardia）[6]、紅球菌（Rhodococcus）[7-9]等。由于莠去津?qū)Νh(huán)境的污染具有全球性[10]，因而從環(huán)境中富集分離莠去津高效降解微生物，仍是今后莠去津生物修復(fù)研究的一個(gè)主要方向[11]。目前通過基因工程對(duì)細(xì)菌進(jìn)行遺傳修飾以滿足生物修復(fù)工程的需要[12-14]是主要研究?jī)?nèi)容。本項(xiàng)目從受莠去津污染嚴(yán)重的河流、土壤中篩選莠去津高效降解菌，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的菌株，采用菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察法和生理生化指標(biāo)法來(lái)確定其種類，并對(duì)所篩選的高效降解菌進(jìn)行降解性能的初步研究，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得降解菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等進(jìn)行鑒定[15]。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基、試劑與儀器

1.1.1 液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基

酵母浸膏1g，蔗糖3g，磷酸氫二鉀1.6g，磷酸二氫鉀0.4g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.1g，2mL微量元素溶液，104mg·L-1莠去津母液10mL，去離子水1000mL；固體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基按20%加入瓊脂。

1.1.2 土樣和水樣

菏澤牡丹區(qū)、陜西省榆林市、濰坊壽光等地有莠去津殘留的玉米地和果園內(nèi)。

1.1.3 微量元素的制備

在蒸餾水中溶解ZnCl20.25g、MnSO4·H2O 1.0g、Na2MoO4·2H2O 0.25g、H3BO40.2g、FeSO4·7H2O 1.0g、CuCl2·2H20 0.25g、NH4NO3O.1g、NiSO4·6H2O 0.1g、Co(NO3)2·6H2O 0.25g，定容至1000mL。

1.1.4 儀器

生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、全自動(dòng)立式滅菌鍋、試管、玻璃平板、三角瓶、相機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、可調(diào)式微量加樣器、冰箱、漩渦振蕩器、氣相色譜等儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莠去津降解細(xì)菌的分離篩選

采用直接分離法分離篩選，實(shí)驗(yàn)步驟：

1）取土樣10g放入6個(gè)盛有90mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩搖勻，使土樣與水充分混合，然后制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀釋度的土壤溶液。

2）將其中的10-1、10-4、10-6這3個(gè)稀釋度的土壤溶液均勻涂布到含莠去津的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，出現(xiàn)菌落后再逐次提高莠去津的濃度進(jìn)行馴化，以獲得菌株的純培養(yǎng)，并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)法

葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)；吲哚試驗(yàn)；V-P試驗(yàn)；甲基紅（MR）試驗(yàn)；檸檬酸鹽利用；淀粉水解實(shí)驗(yàn)；油脂水解試驗(yàn)；石蕊牛乳試驗(yàn)。

1.2.3 降解菌的鑒定

采用稀釋平板法進(jìn)行菌落特征的培養(yǎng)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。用革蘭氏及芽孢染色對(duì)菌株的個(gè)體形態(tài)進(jìn)行觀察。通過葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、油脂水解試驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅（MR）試驗(yàn)等對(duì)菌株的生理生化特征進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定。

1.2.4 分離菌株莠去津降解能力的測(cè)定

從固體培養(yǎng)基上取單菌落接入含100mg·L-1莠去津與無(wú)機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基內(nèi)，在30℃、200r·min-1恒溫振蕩器培養(yǎng)24h后，8000r·min-1離心收集菌體，重懸于0.9%的生理鹽水，按6%接種量轉(zhuǎn)入含100mg·L-1莠去津的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,培養(yǎng)一定時(shí)間后，用重蒸的三氯甲烷提取，最后用氣相色譜測(cè)定莠去津的殘留量。

計(jì)算降解率的公式如下：

式中：X為莠去津的生物降解率，%；CX為接菌處理培養(yǎng)液中莠去津濃度，mg·L-1；Cck為未接菌對(duì)照培養(yǎng)液中莠去津的濃度，mg·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 莠去津降解菌株的富集分離

從來(lái)源不同的土樣和水樣中分離篩選出3株細(xì)菌，可以將莠去津作為氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，編號(hào)為AT-2、AT-3、AT-4后保存。

2.2 菌株的鑒定

降解菌株HB-1、HB-7、HW-4、AT-2的初步鑒定結(jié)果見表1。

表1 莠去津高效降解菌的生理生化特性的測(cè)定

依照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》鑒定降解菌的種類見表2。

表2 降解菌在微生物分類系統(tǒng)中的種類

2.3 莠去津菌株降解性能

莠去津降解菌株的降解能力見表3。由表3可以看出降解菌在24h對(duì)莠去津的降解率在40%左右，但降解菌在3~4d左右就可以將莠去津基本降解除去。綜合來(lái)看，這些菌株是很有應(yīng)用前景的高效降解菌。

表3 菌株24h對(duì)莠去津的降解率

莠去津的紅外譜圖如圖1所示。

圖1 莠去津的紅外譜圖

3 結(jié)論

1）從有莠去津殘留的土壤或受阿特拉津污染嚴(yán)重的活性污泥中所分離出的菌株，均可以利用阿特拉津生長(zhǎng)且具有較高的降解能力,說明長(zhǎng)期受莠去津污染的土壤對(duì)降解菌起到了天然富集的作用,因此從受污染的土壤中能夠分離出高效降解阿特拉津的菌株。

2）根據(jù)菌株HB-1、HB-7、HW-4、AT-2菌株的形態(tài)及生理生化特征，初步鑒定為：HB-1菌株為布魯氏菌屬, HB-7菌株為葡萄球菌屬，HW-4菌株為假單胞菌屬，AT-2菌株為土壤桿菌屬。

3）采用氣相色譜對(duì)所分離菌株的降解能力進(jìn)行了測(cè)定，其24h降解效率在40%左右。由此可以看出，以上分離出來(lái)的菌株有非常廣泛的應(yīng)用前景。

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Isolation and Identification of Atrazine High Efficient Degradation Bacteria

LYU Huiping
(Department of Chemical Engineering, Heze College, Heze 274015, China)

3 atrazine degradation bacterium strains were isolated from the farmland and orchard soil of long-term use of atrazine, and marked as AT-2, AT-3 and AT-4. AT-2 and 3 strains of this laboratory existing degradation bacteria HB-1, HB-7 and HW-4, were preliminary identif ed by physiological and biochemical indexes and morphological analysis, and they were soil bacillus genus brucella, staphylococcus, pseudomonas, respectively. Bacteria degradation rate of the four strains was determined. The reaction conditions were: the substrate concentration of atrazine was 100 mg/L, reaction system 5 mL, 5% of inoculation quantity, constant temperature 30℃, 180r/min, cultivate 24h, the degradation eff ciency were 34.2%, 37.3%, 43% and 34.2%, respectively. After 3d, degradation rate of 4 isolates could reach about 90%.

atrazine; degradation bacteria; degradation rate

TQ 457.2

A

1671-9905(2017)02-0022-03

呂惠萍(1985-)，女，菏澤學(xué)院化學(xué)化工系助理實(shí)驗(yàn)師。研究方向：應(yīng)用化學(xué)

2016-12-13