高效液相色譜-熒光檢測法同時(shí)分析沼液中4種喹諾酮類抗生素

林曉旭何世妍葉永盛陳偉雪

(1廣東省測試分析研究所（中國廣州分析測試中心）,廣東 廣州 510070)

(2廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司,廣東 廣州 510130)

高效液相色譜-熒光檢測法同時(shí)分析沼液中4種喹諾酮類抗生素

林曉旭1何世妍2葉永盛1陳偉雪1

(1廣東省測試分析研究所（中國廣州分析測試中心）,廣東 廣州 510070)

(2廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司,廣東 廣州 510130)

檢測沼液中的喹諾酮抗生素，可以避免抗生物污染問題。本文主要采用高效液相色譜-熒光檢測法分析沼液中4種喹諾酮抗生素藥物的含量。檢測發(fā)現(xiàn)，沼液中喹諾酮含量最高可達(dá)478μg/L，說明沼液抗生素污染已經(jīng)成為重點(diǎn)問題，需要加強(qiáng)關(guān)注和治理。

沼液；喹諾酮類抗生素；高效液相色譜；熒光檢測法

動(dòng)物由于難以吸收大部分抗生素，導(dǎo)致藥物以代謝的形式流入到環(huán)境中，對(duì)環(huán)境及生物的成長造成了巨大的影響。喹諾酮類抗生素具有抗菌、結(jié)構(gòu)簡單以及低毒性等特點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于禽畜的飼養(yǎng)中[1]。但是在目前的研究中，動(dòng)物糞便中的喹諾酮抗生素殘留研究較多，而對(duì)沼液中的藥物鮮有研究，因此，探究沼液中的喹諾酮抗生素具有重要的價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法探究

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀；色譜柱（250*4.6mm，Shim-Pack，VPODS）；真空泵；十二孔固相萃取裝置；超聲波清洗儀；固相萃取柱；抽濾裝置；玻璃纖維微膜（0.7μm）[2]

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星以及恩諾沙星；四丁基溴化銨；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸、檸檬酸、鹽酸等。

1.3 配置實(shí)驗(yàn)溶液

緩沖液：配置0.1、0.2和0.4mol/L濃度的Na2EDTA、檸檬酸以及Na2HPO4混合溶液。之后配置McIIvaine緩沖液，采用0.1mol/L濃度的檸檬酸以及Na2HPO4混合。將兩種緩沖液混合，制作成Na2EDTA-McIIvaine緩沖液，PH為4.0.

1.4 樣本收集

取3個(gè)地區(qū)的沼液，在室溫下保存，運(yùn)用濾紙過濾懸浮物，之后通過玻璃纖維過濾，取50ml，加入鹽酸調(diào)節(jié)PH到4.0，以1ml/min速率通過固相萃取柱，之后用甲醇洗脫至離心管，40℃下蒸發(fā)后用2ml超純水復(fù)溶，再過濾后存儲(chǔ)待測。

1.5 色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

色譜柱溫度為30℃，流動(dòng)相為10.1mol/L，熒光檢測波長為280nm，發(fā)射波長設(shè)置為450nm。

標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成0.002、0.005、0.1、0.2、1、2和5mg/L溶液。

回收率（%）=（抗生素濃度-對(duì)照濃度）/加標(biāo)劑量*100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇提取劑

經(jīng)過綜合分析，發(fā)現(xiàn)使用Na2EDTA可以降低雜質(zhì)，且成本較低。

2.2 色譜分離條件

實(shí)驗(yàn)波長為280nm，發(fā)射波長為450nm，探究PH為2.0-4.0的分離效果。研究發(fā)現(xiàn)，PH=2.5-3.0時(shí)，可以較好的確定基線分離，出峰時(shí)間為25min左右。

在流速的確定方面，本次研究選擇了0.6、0.8以及1.0ml/ min三個(gè)流速，經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)1.0ml/min為最佳流速。

2.3 回收率

在樣品中分別添加0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0mg/L溶液，每個(gè)樣本取三份樣品進(jìn)行試驗(yàn)，探究樣品回收率及偏差水平，發(fā)現(xiàn)4種喹諾酮抗生素的回收率在81.2%-104.6%之間，標(biāo)準(zhǔn)差＜10%，說明試驗(yàn)成功。

2.4 實(shí)際檢測成果

利用上述試驗(yàn)對(duì)收集的樣本進(jìn)行喹諾酮抗生素檢測，檢驗(yàn)成果說明豬糞發(fā)酵的沼液中，喹諾酮抗生素含量約為478μg/L；牛糞發(fā)酵的沼液中，喹諾酮抗生素含量約為182.6μg/L；雞糞發(fā)酵的沼液中，喹諾酮抗生素含量約為201.2μg/L；其可能是與獸藥以及動(dòng)物的消化系統(tǒng)相關(guān)，導(dǎo)致研究結(jié)果存在差異。另外，環(huán)丙沙星的濃度為7-18μg/L，恩諾沙星為62-161μg/L；諾氟沙星為59-201μg/L；標(biāo)準(zhǔn)差＜10%。其可能是由于諾氟沙星的水溶性較好，容易排出，因此在沼液中的含量相對(duì)較高。具體檢測數(shù)值如表1所示。

表1 沼液中4種喹諾酮抗生素含量表

3 結(jié)語

采用固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測方式，可以較好的探究沼液中喹諾酮抗生素藥物的類型，檢測范圍可以達(dá)到0.004-0.01μg/ml，準(zhǔn)確性較高，采用該方式對(duì)以雞糞、牛糞和豬糞發(fā)酵的沼液中發(fā)現(xiàn)，諾氟沙星在豬糞發(fā)酵中最高，恩諾沙星在牛糞發(fā)酵沼液中最高，氧氟沙星在雞糞發(fā)酵沼液中最高。

[1]王橋軍，亦如瀚，莫測輝.固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定水中喹諾酮類抗生素[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，12:7272-7274.

[2]戴曉虎，薛勇剛，劉華杰，等.基于固相萃取及高效液相色譜-熒光檢測分析的污泥中氟喹諾酮類抗生素研究方法的開發(fā)[J].環(huán)境科學(xué)，2016，04:1553-1561.