自噬相關蛋白ATG4B抑制劑的虛擬篩選及體外活性測定

伏園園，吳一諾，喻 秀，郭 訥，張仁偉，劉 翠，鄭雪萍，戴 琪，劉培慶，李 民

(中山大學藥學院，新藥成藥性評估與評價國家地方聯合工程實驗室，廣東 廣州 510006)

自噬相關蛋白ATG4B抑制劑的虛擬篩選及體外活性測定

伏園園，吳一諾，喻 秀，郭 訥，張仁偉，劉 翠，鄭雪萍，戴 琪，劉培慶，李 民

(中山大學藥學院，新藥成藥性評估與評價國家地方聯合工程實驗室，廣東 廣州 510006)

目的 通過計算機虛擬篩選和體外活性測定，篩選自噬相關蛋白ATG4B的特異性小分子抑制劑。方法 基于ATG4B蛋白的晶體結構(PDB ID:2CY7)找出合適的對接口袋；用分子對接方法對SPECS數據庫20萬化合物進行虛擬篩選并確定候選化合物；用熒光共振能量轉移方法(FRET)檢測候選化合物對ATG4B的體外抑制活性并對其特異性進行驗證。結果 確定受體蛋白2CY7的site 5為最適的對接口袋；分子對接后經綜合分析選擇并購買30個代表性化合物做進一步活性測定?；钚詼y定結果顯示，AG-690/10400046能有效抑制ATG4B蛋白的活性，而對半胱氨酸蛋白酶家族的另一成員caspase-3無酶切抑制作用。結論 建立了一種ATG4B蛋白抑制劑的虛擬篩選方法。篩選得到的化合物AG-690/10400046具有明顯的體外抑制活性，為后續(xù)ATG4B抑制劑的生理功能研究奠定基礎。

ATG4B；抑制劑；分子對接；虛擬篩選；自噬；活性口袋5

細胞自噬是真核細胞所特有的對細胞內受損的細胞器及長壽命蛋白通過溶酶體途徑進行降解的細胞生物學過程[1]。自噬對于維持細胞穩(wěn)態(tài)、調節(jié)細胞物質能量代謝具有重要意義[2]。細胞自噬是一個動態(tài)變化的過程，可大致分為以下幾個階段：誘導與成核、延伸、自噬體的成熟、自噬體與溶酶體的融合及其內容物的降解[3]。在這一過程中，有多種自噬相關基因(autophagy-related genes, ATG)的參與，其中兩條泛素樣通路ATG12-ATG5-ATG16 和ATG8-PE(phosphatidylethanolamine)在自噬體的延伸和成熟過程中起著重要的作用，而ATG12-ATG5-ATG16復合物作為E3樣酶有助于ATG8與PE的結合[4]。ATG8必須經過一個蛋白水解過程暴露C末端的甘氨酸才能錨定在自噬泡膜上。ATG4作為C54家族的一種半胱氨酸蛋白酶，在ATG8連接系統(tǒng)中起了非常關鍵的作用。ATG4可以剪切ATG8的C端精氨酸，使其暴露出C端的甘氨酸殘基，以便與PE共價連接形成ATG8-PE錨定在自噬泡膜上。接下來ATG4還能去脂化ATG8-PE，以便使自噬體與溶酶體融合[5]。因此，通過調控ATG4介導的ATG8-PE的去脂化過程能調控整個自噬的過程。

已有文獻報道，ATG4B在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用。ATG4B被認為是一個致癌基因，能促進結腸癌細胞的生長且獨立于其自噬調節(jié)作用[6]。除此之外，在慢性髓細胞性白血病及骨肉瘤細胞中，ATG4B也被看作致癌基因[7-8]。另外使用ATG4B的小分子抑制劑NSC185058能抑制骨肉瘤細胞的生長[8]。不僅如此，ATG4B在博來霉素誘導的心肌纖維化過程中起了重要作用。由此我們可以看出，ATG4B可能是疾病治療中的潛在靶點，抑制ATG4B可以作為疾病治療的手段。但目前關于ATG4B小分子抑制劑的研究還少見報道，抑制劑效價偏低，缺少系統(tǒng)的虛擬篩選方法。本實驗將建立了一種計算機虛擬篩選ATG4B抑制劑的方法，結合體外活性驗證，篩選出特異性ATG4B小分子抑制劑。這些研究為ATG4B抑制劑的虛擬篩選奠定基礎，也為進一步研究抑制劑在抗腫瘤等疾病治療中的作用提供了研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料 虛擬篩選的軟件Discovery Studio Client 2.5(Accelrys,San Diego, CA)；分子三維結構顯示軟件PyMoL(DeLano Scientific, Palo Alto, CA)；ATG4B 的晶體結構來自PDB 數據庫(Protein DataBank)；化合物數據庫來自SPECS(http://www.specs.net)；篩選到的30個小分子化合物購自美國SPECS數據庫；NEM、考馬斯亮藍R250購自上海生工生物工程有限公司；IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)購自美國Merck；星形孢菌素購自美國LC Laboratories；caspase-3底物肽Ac-DEVE-AFC購自中肽生化有限公司；Z-VAD-FMK購自美國Selleck公司；細胞培養(yǎng)所用DMEM培養(yǎng)基和類胎牛血清購自美國Gibco公司；表達ATG4B及其酶切底物蛋白FRET-GATE-16的質粒為本實驗室前期構建并保存[9]；HELA細胞由本實驗室保存[10]。

1.2 數據庫準備 考慮到化合物的結構多樣性及來源可獲得性，本研究選擇含有200 000個小分子的SPECS數據庫作為原始數據庫。首先利用MOE.2010.軟件，對數據庫中的小分子進行初篩。在MOE.2010.中，每個化合物將被生成250個構象，經過Lipinski類藥五原則方法篩選，以下小分子將被篩除：分子質量>600，LogP<-4，LogP>8，氫鍵供體和受體之和>12，柔性鍵>7，單鍵鏈長>6，手性中心>4，自由的手性中心>3和過渡金屬>8等。通過該方法，每一個化合物都能得出一組物理和生物性質的相關數據，以對數據庫中的小分子進行類藥性評價。篩選得到的小分子組成數據庫A，所有數據庫A中的小分子都將用于之后的分子對接篩選。

1.3 蛋白活性口袋的準備 我們選擇PDB代碼為2CY7的晶體作為分子對接的受體結構。在受體蛋白結構的準備過程中，刪除受體結構中的水分子，添加氫原子同時將電離殘基在中性pH條件下質子化，將電場設置為CHARMm。準備好受體結構后，開始進行分子對接。

1.4 分子對接篩選 我們使用Accelrys Discovery Studio Client 2.5軟件里的LigandFit板塊來進行分子對接。準備工作就緒后，將數據庫A中的所有分子對接到蛋白口袋中，每個小分子設置50種對接構象，通過Consence Score對化合物進行打分，產生排名前500的化合物，然后考慮較好的對接打分值以及符合的結合模式(主要與蛋白口袋中關鍵氨基酸殘基CYS74、ASP278及HIS280的作用模式)。從而篩選出30個化合物進行購買并用于接下來的生物活性測試。

1.5 重組蛋白的表達純化 將重組質粒FRET-GATE-16和ATG4B分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)CodonPlus和BL21(DE3)PLYSs中。LB平板挑取單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min-1過夜培養(yǎng)，1 ∶100進行擴增培養(yǎng)，當OD600達到0.6～0.8時加入0.5 mmol·L-1的IPTG進行誘導，16℃，16 h培養(yǎng)后收菌。離心收集菌體，加入濕菌重量5～10倍的結合緩沖液(含5 mmol·L-1的咪唑)稀釋菌體后超聲破碎菌體。離心收集上清，使用鎳NTA填料進行純化，加入菌液上清使目的蛋白掛柱，之后分別用20 mmol·L-1和50 mmol·L-1的咪唑緩沖液進行梯度洗脫，最后用200 mmol·L-1的咪唑洗脫并收集洗脫液。將收集到的洗脫液過脫鹽柱后濃縮并于-80℃冰箱保存。

1.6 FRET方法檢測ATG4B活性 384孔黑板中加入終濃度為100 μmol·L-1的指定化合物與0.75 mg·L-1的ATG4B在Tris緩沖液中37℃共孵育30 min，之后加入50 mg·L-1的FRET-GATE-16，反應總體系為50 μL，反應時間為30 min。該體系的中含有0.1% DMSO終濃度。527/477 nm的RFUs比值在反應30 min時測定。ATG4B相對酶切活性的計算公式為：抑制率/%=(RFUmax-RFUX)/(RFUmax-RFUmin)×100%，其中RFUmax指沒發(fā)生酶切反應時的527/477 nm的比值，RFUmin指酶切反應進行到最徹底的527/477 nm的比值，RFUX指在特定化合物處理條件下的527/477 nm的比值。

1.7 SDS-PAGE方法檢測ATG4B活性 將3 ng的ATG4B單獨或與指定濃度的化合物在緩沖液中37℃共孵育30 min，之后加入4 μg的底物蛋白FRET-GATE-16，反應總體系為20 μL，反應時間為30 min。用5X上樣緩沖液終止反應，將蛋白變性，采用SDS-PAGE進行電泳，電泳結束后用考馬斯亮藍染色方法對條帶進行著色，之后脫色進行分析。

1.8 caspase-3活性測定 HELA細胞于含有10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。用星形孢菌素(1 μmol·L-1, 5 h)來誘導 HELA細胞凋亡，對照組細胞不做任何處理，在同樣的條件下培養(yǎng)。非變性提取細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測細胞蛋白含量，上樣量為10 μg。384孔黑板中加入終濃度為100 μmol·L-1的指定化合物與10 μg的細胞裂解液在Tris緩沖液中37℃共孵育30 min，之后加入終濃度為25 μmol·L-1的熒光底物Ac-DEVE-AFC，反應總體系為50 μL，立即檢測熒光值，測定時間為60 min，反應溫度為37℃。分別于激發(fā)光400 nm和發(fā)射光505 nm處檢測熒光AFC的動力學曲線。

2 結果

2.1 計算機虛擬篩選ATG4B抑制劑 ATG4B的晶體結構已經被解析出來(PDB ID:2CY7)。因ATG4B晶體結構中不含有與受體蛋白共結晶的小分子配體，我們使用Accelrys Discovery Studio Client 2.5軟件里的Find sites模塊對受體中可能存在的口袋位置進行尋找并找到10個可能的口袋位置。因site 5口袋在ATG4B的N末端尾巴部分(1～20位氨基酸殘基)與調節(jié)環(huán)(259～262位氨基酸殘基)之間的凹槽處，且site 5口袋包含ASP278和HIS280這兩個非常重要的氨基酸殘基，因此我們選擇site 5為本次對接工作的口袋位置。Site 5口袋的位置如Fig 1A～B所示。Site 5口袋包含的氨基酸殘基如下：THR10、LEU11、ALA14、ASN261、SER262、HIS264、TYR276、ASP278、HIS280和CYS306。將數據庫A(含有149,214個小分子)與site 5進行對接，通過Consence Score給出打分，并對排名前500的化合物通過骨架進行分類，結合化合物與受體的結合模式，從中挑選并購買了30個有代表性的化合物進行生物活性測試。

Fig 1 The structure and active pocket site 5 of ATG4B

A：Surface presentation of the active pocket site 5 of ATG4B. The regulatory loop was colored marine, the N-terminal tail was colored slate, and the site 5 was colored red； B：Surface model of site 5. Atom coloring was the same as in(A)

2.2 FRET方法檢測候選化合物對ATG4B的體外抑制活性 為保證該體系的可靠性和穩(wěn)定性，用考馬斯亮藍染色的方法對純化出來的兩種蛋白的純度及活性進行了驗證。FRET-GATE-16(4 μg)與合適量的ATG4B(3 ng)在37℃共孵育0 min或30 min。如Fig 2A所示，全長的FRET-GATE-16(0 min)的純度(>90%)可以用于接下來的實驗，而30 min時全長的FRET-GATE-16(0 min)幾乎可以完全被3 ng的ATG4B酶切為CFP-GATE-16和CFP兩部分，說明ATG4B的活性良好。我們選擇半胱氨酸蛋白酶的通用型抑制劑N-乙基馬來酰亞胺(NEM)作為本次篩選的陽性對照，利用該檢測體系測得NEM的IC50值為134.2 μmol·L-1(Fig 2B)。接著對購買的30個小分子化合物用FRET方法測定100 μmol·L-1的濃度下對ATG4B的抑制活性。如Fig 2C所示，化合物AG-690/10400046表現出最高的抑制活性，該化合物的結構如Fig 2D所示。

2.3 AG-690/10400046對ATG4B的體外抑制活性驗證 為進一步驗證AG-690/10400046對ATG4B的體外抑制活性，采用考馬斯亮藍染色的方法檢測該化合物對ATG4B的酶切抑制效果。如Fig 3A所示，AG-690/10400046能劑量依賴性地抑制ATG4B的活性，且在100 μmol·L-1的條件下幾乎可以完全抑制住ATG4B的活性。FRET方法測得該化合物的IC50值為36.8 μmol·L-1(Fig 3B)。此外，從AG-690/10400046與受體的對接結果來看，該化合物與受體蛋白2CY7 的口袋位置具有良好的結合模式，且與受體蛋白的PHE16及GLU312位點形成了氫鍵作用(Fig 3C～D)，表明該化合物與ATG4B之間有較好的相互作用。以上結果表明該化合物具有較強的ATG4B抑制能力。

Fig 2 Screening of ATG4B inhibitors by FRET assay

A：Verification of the cleavage of FRET substrates by ATG4B using SDS-PAGE. B：NEM was used as a positive control with an IC50of 134.2 μmol·L-1for ATG4B using the FRET-based assay. C：A total of 30 compounds were further tested for their inhibitory effects on ATG4B activity using the FRET-based assay. D：The structure of AG-690/10400046

2.4 AG-690/10400046的特異性抑制作用分析 為了判斷AG-690/10400046是否廣泛的抑制其他半胱氨酸蛋白酶，我們采用半胱氨酸蛋白酶家族的另一成員caspase-3來驗證。如Fig 4A所示，星形孢菌素能有效的誘導HELA細胞產生凋亡。caspase-3的特異性抑制劑Z-VAD-FMK在50 μmol·L-1的濃度下能有效抑制caspase-3的酶切活性。而AG-690/10400046在100 μmol·L-1的濃度下對caspase-3的酶切活性沒有影響，說明該化合物不是普遍的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。

3 討論

ATG4家族成員在脂化與去脂化ATG8家族成員以形成自噬體的過程中扮演著非常重要的作用。ATG4在酵母中僅有一個成員，其功能的缺失將阻斷整個自噬的進程[11]。而在哺乳動物細胞中ATG4有4個家族成員：ATG4A、ATG4B、ATG4C和ATG4D。ATG4B作為ATG4家族中研究最為廣泛的成員，對ATG8家族成員(LC3家族及GABARAP家族)均具有酶切活性[12]。

ATG4B的晶體結構(PDB ID:2CY7)已經被解析出來，其酶切活性位點為：CYS74、ASP278及HIS280[11]，這些位點的突變將導致ATG4B酶切活性的喪失[13]。正常情況下，ATG4B的關鍵氨基酸位點CYS74被一個調節(jié)環(huán)(259～262位氨基酸殘基)所遮蓋。一旦ATG4B與LC3形成復合物，ATG4B的調節(jié)環(huán)部分被LC3的尾部殘基PHE119提升起來，導致ATG4B蛋白結構發(fā)生一定的變化，使得LC3的C末端尾巴可以伸入到ATG4B的酶切位點[14]。另外ATG4B一旦與LC3結合，其N端尾巴(1～20位氨基酸殘基)經歷了很大的構型變化，這可能與其對LC3的去脂化作用有關，因為只有當ATG4B處于游離狀態(tài)時更傾向于與膜上脂化形式的LC3-PE相結合[15]。

Fig 3 Inhibitory effects of AG-690/10400046 on ATG4B activity

A: Determination of the different concentrations of AG-690/10400046 on ATG4B activity using the SDS-PAGE assay; B: AG-690/10400046 showed an IC50of 36.8 μmol·L-1for ATG4B by using the FRET-based assay; C: The binding mode of AG-690/10400046 with ATG4B; D: AG-690/10400046 can form hydrophobic interactions with residues PHE16 and GLU312 of ATG4B

Fig 4 Selectivity of AG-690/10400046 and diagram of virtual screening

(A) Selectivity test of AG-690/10400046 on another cysteine protease caspase-3.(SP:staurosporine).(B)The diagram of virtual screening of ATG4B inhibitors

目前，自噬被報導與多種疾病相關，包括腫瘤、神經退行性疾病、感染性疾病、心血管和代謝性疾病等[16]。而ATG4B作為自噬過程中的一個關鍵性靶標，通過調控ATG4B的活性可以調控整個自噬的過程。因此，作為一個潛在的生物標記物及疾病治療的靶標，特異性ATG4B小分子抑制劑的發(fā)現至關重要。

本研究旨在建立一種虛擬篩選的方法，并利用該方法篩選出特異性ATG4B小分子抑制劑(Fig 4B)。我們基于游離態(tài)ATG4B 的晶體結構2CY7，綜合計算機虛擬篩選以及體外生物活性測試，得到具有明顯ATG4B抑制活性的小分子化合物AG-690/10400046。AG-690/10400046，其IC50為36.8 μmol·L-1，優(yōu)于文獻報道的化合物NSC185058[8]。AG-690/10400046對半胱氨酸家族另一成員caspase-3無酶切抑制作用，說明該化合物為選擇性ATG4B小分子抑制劑而不是廣泛的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。以上結果表明，我們建立了一種可靠的ATG4B小分子抑制劑的虛擬篩選方法，且篩選到了高選擇性ATG4B小分子抑制劑AG-690/10400046。這為進一步尋找或設計更為高效的ATG4B小分子抑制劑及研究ATG4B抑制劑在疾病中的作用奠定了基礎。

[1] 楊根夢，陳 遜，曾曉鋒. 甲基苯丙胺誘導神經細胞自噬的研究進展[J]. 中國藥理學通報，2016，32(10): 1341-4.

[1] Yang G M，Chen X，Zeng X F. Research progress of methamphetamine inducing nerve cell′s autophagy[J].ChinPharmacolBull，2016，32(10): 1341-4.

[2] 齊元麟，陳富華，任正肖，等. 動脈平滑肌細胞的鈣池操縱鈣通道對細胞自噬的調[J]. 中國藥理學通報，2016，32(10): 1416-21.

[2] Qi Y L，Chen F H，Ren Z X，et al. Regulation of autophagy by store-operated calcium channel in arterial smooth muscle cells[J].ChinPharmacolBull，2016，32(10): 1416-21.

[3] Feng Y，He D，Yao Z，et al.The machinery of macroautophagy[J].CellRes，2014，24(1): 24-41.

[4] Kuma A，Mizushima N，Ishihara N，et al. Formation of the approximately 350-kDa Apg12-Apg5.Apg16 multimeric complex, mediated by Apg16 oligomerization, is essential for autophagy in yeast[J].JBiolChem，2002，277(21): 18619-25.

[5] Yu Z Q， Ni T，Hong B，et al . Dual roles of Atg8-PE deconjugation by Atg4 in autophagy[J].Autophagy，2012，8(6): 883-92.

[6] Liu P F，Leung C M，Chang Y H，et al. ATG4B promotes colorectal cancer growth independent of autophagic flux[J].Autophagy，2014，10(8): 1454-65.

[7] Rothe K，Lin H，Lin K B，et al. The core autophagy protein ATG4B is a potential biomarker and therapeutic target in CML stem/progenitor cells[J].Blood，2014，123(23): 3622-34.

[8] Akin D，Wang S K，Habibzadegah-Tari P，et al. A novel ATG4B antagonist inhibits autophagy and has a negative impact on osteosarcoma tumors[J].Autophagy，2014，10(11): 2021-35.

[9] Li M，Chen X，Ye Q Z，et al. A high-throughput FRET-based assay for determination of Atg4 activity[J].Autophagy，2012，8(3): 401-12.

[10]Li M，Khambu B，Zhang H，et al. Suppression of lysosome function induces autophagy via a feedback down-regulation of MTOR complex 1(MTORC1) activity[J].JBiolChem，2013，288(50): 35769-80.

[11]Kirisako T， Ichimura Y，Okada H，et al. The reversible modification regulates the membrane-binding state of Apg8/Aut7 essential for autophagy and the cytoplasm to vacuole targeting pathway[J].JCellBiol，2000，151(2): 263-76.

[12]Li M，Hou Y，Wang J，et al. Kinetics comparisons of mammalian Atg4 homologues indicate selective preferences toward diverse Atg8 substrates[J].JBiolChem，2011，286(9): 7327-38.

[13]Kumanomidou T，Mizushima T，Komatsu M，et al. The crystal structure of human Atg4b, a processing and de-conjugating enzyme for autophagosome-forming modifiers[J].JMolBiol，2006，355(4): 612-8.

[14]Sugawara K，Suzuki N N，Fujioka Y，et al. Structural basis for the specificity and catalysis of human ATG4B responsible for mammalian autophagy[J].JBiolChem，2005，280(48): 40058-65.

[15]Satoo K，Noda N N，Kumeta H，et al. The structure of ATG4B-LC3 complex reveals the mechanism of LC3 processing and delipidation during autophagy[J].EMBOJ，2009，28(9): 1341-50.

[16]陳菊英，劉朝純，曾 智，等. 紫草素通過PI3K/Akt通路促進人乳腺癌MCF-7細胞自噬[J]. 中國藥理學通報，2013，29(2): 194-8.

[16]Chen J Y，Liu Z C，Zeng Z，et al. Shikonin promotes autophagy of MCF-7 human breast cancer cells through PI3K /Akt pathway[J].ChinPharmacolBull，2013，29(2): 194-8.

Virtual screening andinvitroactivity studies of novel ATG4B inhibitors

FU Yuan-yuan,WU Yi-nuo,YU Xiu,GUO Ne,ZHANG Ren-wei,LIU Cui,ZHENG Xue-ping,DAI Qi,LIU Pei-qing,LI Min

(SchoolofPharmaceuticalSciences,NationalandLocalUnited
EngineeringLabofDruggabilityandNewDrugsEvaluation,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510006,China)

Aim To screen out novel ATG4B inhibitors based on the computer-aided drug screening and investigate theinvitroactivities of these inhibitors.Methods By performing in silico docking based on the crystal structure of ATG4B(PDB ID: 2CY7), the SPECS database with 200 000 compounds were screened. The inhibitory effect on ATG4B of those candidate compounds was verified by fluorescence resonance energy transfer assay(FRET).Results Site 5 of the 2CY7 was the most suitable pocket for molecular docking. After screening, 30 compounds were purchased from SPECS database for further bioassay. Among them, AG-690/10400046 effectively inhibited ATG4B activityinvitrowith high specificity.Conclusion A promising method is established for screening ATG4B inhibitors.Compound AG-690/10400046 is screened out with high activity and specificity.This work lays a foundation for virtual screening and later physiological function studies of ATG4B inhibitors.

ATG4B; inhibitors; molecular docking; virtual screening; autophagy; pocket site 5

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.014.html

2016-10-25,

2016-12-02

國家自然科學基金資助項目(No 31671437)；廣東省自然科學基金資助項目(No 2016A030313335)

伏園園(1991-)，女，碩士生，研究方向：藥物篩選，E-mail:863068184@qq.com; 李 民(1976-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：細胞自噬，通訊作者，E-mail: limin65@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.007

A

1001-1978(2017)03-0321-06

R329.24；R319；R965.1；R977.6