眼針對腦缺血再灌注損傷大鼠PI3K/Akt通路影響的實驗研究*

宓 丹 王德成 陳 雪

（遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110036）

·研究報告·

眼針對腦缺血再灌注損傷大鼠PI3K/Akt通路影響的實驗研究*

宓 丹 王德成 陳 雪

（遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110036）

目的 通過觀察眼針治療對磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路的調控作用，探尋眼針治療缺血性腦血管病的機制。方法 將64只SPF級Wistar大鼠分為空白組、假手術組、模型組（3 h、24 h、72 h）、眼針組（3 h、24 h、72 h）。采用改良線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型，通過眼針刺激對腦缺血再灌注損傷大鼠模型進行干預。觀察眼針干預后大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分，并對各組大鼠缺血側大腦皮層PI3K、Akt蛋白表達水平進行檢測。結果 與空白組及假手術組比，模型組與眼針組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損；與模型組比眼針組24 h，72 h大鼠神經(jīng)功能評分顯著下降（P＜0.05）；與空白組及假手術組比，模型組與眼針組各時間點PI3K、Akt蛋白表達增加，其中眼針組與模型組各時間點比增加更顯著（P＜0.05）。結論 眼針治療能夠激活PI3K、Akt信號通路，促進Akt磷酸化，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

腦缺血再灌注 眼針 PI3K Akt

急性腦血管病以高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率成為危害人類健康的三大殺手之一。其中缺血性腦血管病占急性腦血管的80%，如何防治缺血性腦血管病一直是醫(yī)學界亟待解決的問題。缺血性腦血管病的治療主要以血管再通和神經(jīng)保護為主要治療方法。溶栓治療雖然能使閉塞的血管再通，但因其治療窗為癥狀發(fā)生后的4.5 h，僅有2%～3%的人能從中獲益［1］。近年來的血管內(nèi)取栓雖然延遲了治療窗的時間，但研究顯示臨床結局并末優(yōu)于標準內(nèi)科治療［2］。因而神經(jīng)保護治療日益受到重視，2013年美國心臟學會/美國卒中學會（AHA/ASA）聯(lián)合頒布了急性缺血性卒中早期管理指南，首次積極地推薦了神經(jīng)保護治療，將神經(jīng)保護劑的研究推向高潮。眼針是一種有效的治療腦梗死的微針技術，通過刺激經(jīng)絡，從多方面、多靶點阻斷腦缺血后的級聯(lián)反應，發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護作用，但其治療機制尚末完全明確。本文通過眼針治療對腦缺血再灌注損傷大鼠磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號傳導通路的調控作用，探討眼針治療缺血性腦血管病的部分機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大白鼠64只，雌雄不限，體質量（200±20）g，購自遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK2010-0001。大鼠購入后，適應性飼養(yǎng)1周，動物室保持室溫（20±2）℃，相對濕度45%，12 h晝夜節(jié)律，自由飲水，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，隔天更換一次墊料。實驗設計及實施過程中嚴格遵循動物實驗的3R原則［3］。

1.2 試劑與儀器 兔抗大鼠PI3K、Akt多克隆抗體（均購自abcam公司）；HRP標記的羊抗兔二抗 （北京中杉金橋生物技術有限公司）。電泳儀（北京六一儀器設備廠）；凝膠成像分析系統(tǒng)，天能公司，4200SF型。

1.3 分組與造模 模型制備采用改良線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型［4］。將大鼠用10%水合氯醛麻醉后，分離頸部肌肉與血管，暴露頸內(nèi)動脈，將魚線插入頸內(nèi)動脈2 cm處，2 h后將魚線拔出。模型制備成功標準：大鼠出現(xiàn)對側前爪不能完全伸展，缺血對側眼部出現(xiàn)Honer證。參照Longa評分標準［5］對腦缺血再灌注模型制備成功的大鼠進行神經(jīng)功能評分：1分為不能完全伸展對側前爪；2分為向對側轉圈；3分為向對側傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者或實驗過程中大鼠死亡的剔除，并依次補充。 假手術組大鼠術式同模型制備方式相同，區(qū)別在于魚線插入深度為0.5～1 cm?？瞻捉M未做任何處理。將大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、假手術組、模型3 h組、模型24 h組、模型72 h組、眼針3 h組、眼針24 h組、眼針72 h組，共8組，每組8只。干預方法，眼針組：用31號13 mm毫針，于肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)，進行針刺，定位參照人體取穴方法［6］。手法：平刺，進針3 mm。留針20 min，留針期間捻轉行針1次，每次1 min。治療時機：眼針組于腦缺血2 h再灌注后即刻進行治療，存活期間每12小時1次；眼針3 h組于取材前30 min再進行眼針治療1次。模型組與假手術組，每12小時抓拿大鼠1次?？瞻捉M不做任何處置。

1.4 觀察指標 按照規(guī)定的時間點對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，采用Western-blot法檢測各組大鼠缺血側大腦皮層PI3K、Akt蛋白表達水平，方法如下：在規(guī)定的時間點，將大鼠斷頭處死，小心去除顱骨，剝離腦組織，將缺血側大腦皮層組織分離收集于同一個EP管中（作為一份檢測樣本），按組織凈重與裂解液1∶10的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液中，用高速電動勻漿器在冰上將大腦皮層組織制備成勻漿，于冰上靜置20 min后，14000 r/min，離心15 min，收集上清液，即為缺血側大腦組織總蛋白。采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，以每孔上樣20 μg總蛋白的上樣量調整蛋白濃度及上樣體積，進行垂直電泳，采用濕轉法將蛋白由凝膠中轉至PVDF膜，一抗（1∶500）4℃孵育過夜、二抗（1∶2000）37℃孵育2 h，充分洗膜后，加ECL發(fā)光液1 mL，于凝膠成像分析系統(tǒng)中采集照片，用凝膠成效系統(tǒng)自帶軟件測定目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白的比值作為該樣本蛋白表達水平進行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料均以±s）表示，大鼠神經(jīng)功能缺損評分，PI3K、Akt蛋白的表達水平采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較 見表1?？瞻捉M與假手術組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。模型和眼針各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，模型24 h組大鼠神經(jīng)功能障礙評分最高，模型72 h組大鼠神經(jīng)功能障礙評分降低，但仍高于模型3 h組。眼針24 h組大鼠神經(jīng)功能障礙評分最高，眼針72 h組大鼠神經(jīng)功能障礙評分降低，低于眼針3 h組。與模型組同時間點相比，眼針24 h，72 h組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分降低（P＜0.05）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

與本組3 h時比較，*P＜0.05；與模型組同時間點比較，△P＜0.05。

2.2 各組大鼠PI3K、Akt蛋白的表達 見表2、圖1和圖2。實驗結果顯示：與空白組和假手術組比，模型組與眼針組PI3K、Akt蛋白表達水平顯著升高。其中模型組腦缺血再灌注3 h后即出現(xiàn)PI3K、Akt蛋白表達水平升高，持續(xù)到24 h，72 h后PI3K、Akt蛋白升高趨勢并沒有進一步增加。眼針組PI3K、Akt蛋白表達水平在缺血3 h后開始升高，隨著眼針治療時間的延長PI3K、Akt蛋白表達水平進一步升高。與模型組比，眼針各時間點PI3K、AKt蛋白表達水平均高于模型組（均P＜0.05）。

表2 各組大鼠缺血側大腦皮層PI3K、Akt蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠缺血側大腦皮層PI3K、Akt蛋白表達比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組較，△P＜0.05。

PI3K Akt 3 h 24 h 72 h 3 h 24 h 72 h空白組 6 0.24±0.044 - - 0.24±0.043 - -假手術組 6 0.23±0.047 - - 0.23±0.041 - -眼針組 6 0.56±0.061*△0.64±0.068*△0.65±0.087*△0.52±0.087*△0.60±0.099*△64±0.99*△模型組 6 0.46±0.053*0.57±0.057*0.51±0.067*0.43±0.096*0.50±0.075*0.48±0.049*組別 n

圖1 各組大鼠缺血側大腦皮層Akt蛋白表達

圖2 各組大鼠缺血側大腦皮層PI3k蛋白表達

3 討 論

神經(jīng)保護治療是指通過拮抗、阻滯或減慢卒中發(fā)病過程中，引起不可逆缺血性腦損傷的生物化學和分子生物學物質水平的改變，來改善疾病的預后。最初神經(jīng)保護治療并不受重視，然而研究發(fā)現(xiàn)溶栓后仍有遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，使神經(jīng)保護劑的研究成為腦卒中治療的熱點。然而既往100多項的神經(jīng)保護劑的臨床實驗研究均以失敗告終，使神經(jīng)保護治療陷入尷尬地位。2013年美國心臟學會/美國卒中學會（AHA/ ASA）聯(lián)合頒布了急性缺血性卒中早期管理指南，首次積極地推薦了神經(jīng)保護治療，將神經(jīng)保護劑的研究推向高潮。眼針是一種微針技術，眼針治療通過刺激“肝區(qū)”“腎區(qū)”“上焦”“下焦”穴位，調整臟腑功能，有效地治療缺血性腦血管病［7］。實驗表明眼針治療可以抑制炎癥反應，保護血管內(nèi)皮，改善腦血流等從多方面打斷腦缺血后的缺血瀑布的級聯(lián)反應，發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護作用［8-9］。但眼針治療缺血性腦血管病的機制尚末完全明確。

PI3K/Akt是一條促進細胞存活和和抑制細胞凋亡的信號傳導通路［10］。PI3K是細胞內(nèi)重要的信號轉導分子，可被生長因子、細胞因子、激素等細胞外信號激活，活化的PI3K轉位到細胞膜表面，使膜上的磷酸肌醇磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PBP）、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸（PI-3，4-P2）和磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PI-3，4，5）發(fā)揮第二信使作用。Akt是PI3K/Akt信號傳導通路的關鍵物質，靜息狀態(tài)下位于細胞質內(nèi)，其活性主要通過PDK正性調節(jié)，是PI3K的重要下游效應分子，激活的Akt可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白從而調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡，促進細胞存活［11］。Noshita等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠大腦中動脈閉塞1 h再灌注4 h后梗死灶周圍磷酸化的Akt明顯增加。而應用PI3K抑制劑能降低Akt磷酸化水平，增大梗死體積，提示信號轉導通路參與了腦缺血的病理學過程［12］。雷軍等研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能促進p-Akt的表達，降低MPO活性和TNF-α含量，減輕腦梗死體積，注射PI3K抑制劑后，降低白藜蘆醇對腦缺血再灌注損傷的保護作用［13］。湯諹等用反復3次關閉頸總動脈的方法復制缺血后適應模型，觀察到經(jīng)缺血后適應的大鼠活化水平增高Akt，神經(jīng)元亞細胞結構損傷降低，同時發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元損傷的程度與Akt活化水平呈負相關關系［14］。以上研究證實PI3K/Akt信號傳導通路在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。PI3K／Akt通路主要通過以下途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用。1）細胞凋亡：激活的Akt通過過磷酸化Bad、Caspase-9、Forkhead、NF-κB等基因的表達，從而發(fā)揮抑制細胞凋亡作用［15］。王曉天等研究發(fā)現(xiàn)腦缺血復灌后Bad與AKt結合減少，注射PI3K／Akt信號傳導通路激活劑后Bad與AKt結合增多，同時Bad與Bcl-X1結合和神經(jīng)元凋亡明顯減少，認為激活PI3K/Akt通路可以減少Bad轉位到線粒體誘導神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用［16］。2）促進血管新生：研究表明活化的Akt能使血管內(nèi)皮細胞的eNOS的絲氨酸殘基Serll77發(fā)生磷酸化并激活其酶活性，促進血管內(nèi)皮生長因子誘導的內(nèi)皮細胞增殖和遷移［17］。AKt磷酸化后還能促進HIF-1α的表達和活性增加，增加其轉錄活性，促進血管新生作用［18］。

本研究表明，腦缺血再灌注3 h后PI3k蛋白開始表達，同時Akt蛋白表達也增高，說明缺血、缺氧損傷可以激活PI3k/Akt通路，發(fā)揮內(nèi)源性保護機制。PI3k、Akt蛋白表達在腦缺血再灌注損傷24 h達到高峰，之后開始下降，提示PI3k/Akt通路的激活只是腦缺血后的應激反應，不能減輕腦缺血再灌注損傷。經(jīng)眼針治療后PI3k、Akt蛋白表達明顯增加增加，各時間點與模型組比兩組之間差異顯著。隨眼針治療時間延長PI3k、Akt蛋白表達進一步增加，同時觀察到大鼠神經(jīng)功能缺損明顯減輕。由此我們可以推斷眼針可以激活PI3k/Akt通路，促進Akt磷酸化，減少腦缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

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Effects of Eye Acupuncture on PI3K/AKt Signaling Path after Cerebral Ischemia-reperfusion Injury inRats

MI Dan，WANG Decheng CHEN Xue. The Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Liaoning，Shenyang 110036，China.

Objective：To explore the mechanism of eye acupuncture on cerebral ischemia-reperfusion rats by observing its effects on PI3K/Akt signaling path.Methods：62 SPF grade Wistar rats were divided into 8 groups：the blank group，Sham operation group，the model groups with 3 h，24 h and 72 h，the eye acupuncture groups with 3 h，24 h and 72 h.Improved suture-occluded method was adopted to establish cerebral ischemia-reperfusion model，and eye acupuncture was applied to observe nerve function defect score and to detect the level of PI3K，Akt protein expression in ischemic cOrtex of rats in specific time point.Results：Compared with the blank group and sham operation group，model groups and eye acupuncture groups had different degrees of nerve function defect.Compared with the model group，nerve function defect score of the eye acupuncture 24 h and 72 h groups decreased obviously（P＜0.05）.Compared with the blank group and sham opration group，the level of PI3K and Akt p53 protein expression of model groups and eye acupuncture groups increased.Compared with the model group，the expressions of PI3K and AK of eye acupuncture group also markedly increased at each point（P＜0.05）. Conclusion：Eye acupuncture has neuro-protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury through the activation of PI3K/Akt signaling pathway and can promote the phosphorylation of Akt.

Cerebral ischemia-reperfusion；Eye acupuncture；PI3K；Akt

R245.32+9

A

1004-745X（2017）02-0212-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.008

2016-11-08）

遼寧省科技廳研究項目（2014020162）