羊口瘡病毒QD/2015株B2L基因克隆及生物信息學(xué)分析

李 智，仲 亮，張 靜，劉春羽，范俊豪，王海峰，牛云雷，張七斤

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2. 巴林左旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古赤峰 025450）

羊口瘡病毒QD/2015株B2L基因克隆及生物信息學(xué)分析

李 智1，仲 亮1，張 靜1，劉春羽1，范俊豪1，王海峰1，牛云雷2，張七斤1

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2. 巴林左旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古赤峰 025450）

為分析羊口瘡病毒（ORFV/QD/2015株）B2L基因的分子特征，預(yù)測其編碼蛋白的生物學(xué)功能，對其B2L基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆及序列測定，應(yīng)用生物信息學(xué)相關(guān)軟件及方法，對擴(kuò)增所得的基因進(jìn)行序列分析，并對其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞抗原表位、三級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽等進(jìn)行預(yù)測和分析。結(jié)果顯示：ORFV/QD/2015株B2L基因序列長1 137 bp，編碼379個(gè)氨基酸；該毒株與其他12株羊口瘡病毒參考株的B2L基因核苷酸序列同源性為96.8%～99.7%，氨基酸序列同源性為96.8%～99.2%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，ORFV/ QD/2015株與2015年分離到的ORFV/ShaanXi/2015/China株親緣關(guān)系最近；B2L基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋區(qū)域和β-折疊區(qū)域所占比例較大，預(yù)測此蛋白可能存在7個(gè)細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位，無跨膜區(qū)域，無信號(hào)肽區(qū)域；三級(jí)結(jié)構(gòu)呈彎曲狀螺旋結(jié)構(gòu)。

羊口瘡病毒；B2L基因；生物信息學(xué)分析；蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

羊口瘡（ORF）是由羊口瘡病毒（ORFV）引起的山羊和綿羊的一種急性、接觸性傳染病，人也可感染。本病以羊口唇等處的皮膚和粘膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和結(jié)痂等為主要特征[1]。ORFV全基因組大小為135～139 kb，是雙鏈線性DNA病毒，基因組包含131個(gè)基因，其B2L基因位于基因組的左末端。ORFV在宿主細(xì)胞內(nèi)增值時(shí)，其B2L基因在病毒DNA尚未復(fù)制時(shí)，便大量轉(zhuǎn)錄翻譯為42 KDa大小的蛋白。該蛋白是ORFV外表囊膜的主要成分，可強(qiáng)烈刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答[2]。目前國內(nèi)關(guān)于ORFV B2L基因的生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析的報(bào)道較少。通過本試驗(yàn)可以了解ORFV/QD/2015流行株的生物信息學(xué)特征，充實(shí)ORFV分子流行病學(xué)資料，為下一步進(jìn)行B2L基因的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒

羊口瘡病毒株由涂明亮2015年從青島市分離到，命名為ORFV/QD/2015。通過病毒滴度測定，其TCID50為10-5.5/0.1 mL。毒株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞與菌株

DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 主要試劑

2×Easy Taq SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素（Ampicillin），購自AMERSCO公司；DL2000、PMDTM18-T Vector Cloning Kit，購自寶生物（大連）工程有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。其他試劑均為標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)分析純試劑。

1.4 主要設(shè)備

22331型PCR儀， 購 自德國Eppendorf公司；水平電泳儀BG-Power600i，購自BAYGENE公司；Syngene G：BOX凝膠成像儀，購自英國SYNGENE公司；恒溫水浴鍋，購自北京市長風(fēng)儀器儀表公司；5417R型低溫高速離心機(jī)，購自德國Eppendorf公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZC-250），購自培英儀器公司。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中的ORFV B2L基因序列，利用primer 5.0，在基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物[3]。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

表1 B2l基因引物序列及產(chǎn)物大小

1.6 PCR擴(kuò)增

采用病毒基因組DNA提取試劑盒，提取ORFV/QD/2015株全基因組，以提取的ORFV基因組為模板，用生理鹽水作為陰性對照，用設(shè)計(jì)的B2L特異性引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL， 模 板 DNA 1.0 μL，RNase-Free ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 基因克隆及序列分析

回收純化的目的DNA片段，將其連接至PMD18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中；利用含氨芐青霉素抗性的LB平板，篩選陽性重組質(zhì)粒；提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為PMD18-T-B2L，送北京華大生物工程有限公司測序。參考GenBank上公布的ORFV B2L基因序列，利用DNAStar軟件中的MegAlign程序，分析測序結(jié)果，構(gòu)建進(jìn)化樹[4]。ORFV參考毒株信息見表2。

1.8 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用DNAStar軟件中的Protean程序，使用Garnier-Robson、Chou-Fasman兩種方法，分析預(yù)測ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[5-6]；運(yùn)用DNAStar軟件中的Protean程序，分析預(yù)測該蛋白細(xì)胞抗原表位參數(shù)；運(yùn)用SWISSMODEL預(yù)測該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；采用SignalP 4.1預(yù)測該蛋白信號(hào)肽；運(yùn)用TMHMM Server 2.0 預(yù)測該蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域[7]。

表2 GenBank中ORFV參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

以提取的ORFV/QD/2015株DNA為模板，進(jìn)行B2L基因特異性PCR擴(kuò)增，然后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到與預(yù)期相符、大小為1 137 bp的條帶（圖1）。

圖1 ORFV/QD/2015株B2L基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

2.2 測序結(jié)果

對質(zhì)粒PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行拼接，其核苷酸序列見圖2。由圖2可知，B2L基因序列長為1 137 bp，可編碼379個(gè)氨基酸。

圖2 ORFV/QD/2015株B2L基因測序結(jié)果

2.3 ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列同源性分析

運(yùn)用Clustal W法比對分析ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列與GenBank上公布的12株ORFV參考毒株B2L基因的核苷酸序列。結(jié)果表明，ORFV/QD/2015株B2L基因與其他12株ORFV參考株B2L基因的核苷酸序列同源性為96.8%～99.7%，其中與陜西省2015年分離到的毒株同源性高達(dá)99.7%（圖3）。

圖3 ORFV/QD/2015株B2L基因的核苷酸同源性分析

2.4 ORFV/QD/2015株B2L基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列與GenBank上公布的12株ORFV參考株B2L基因的核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，ORFV/ QD/2015株與陜西省2015年分離到的病毒株處于同一遺傳進(jìn)化分支，親緣性最近（圖4）。

圖4 ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 ORFV/QD/2015株B2L基因氨基酸序列同源性分析

對ORFV/QD/2015株B2L基因氨基酸序列與GenBank上公布的12株ORFV參考株B2L基因氨基酸序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果表明，ORFV/ QD/2015株B2L基因氨基酸序列與其他12株ORFV參考株的B2L基因氨基酸序列同源性為96.8%～99.2%，其中與陜西省2015年分離到的和福建省2012年分離到的毒株B2L基因氨基酸序列同源性高達(dá)99.2%（圖5）。

圖5 ORFV/QD/2015株B2L基因氨基酸同源性分析

2.6 ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用DNAStar程序中的Protean軟件，使用Garnier-Robson和Chou-Fasman兩種方法，分析ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，不同預(yù)測方法對蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果不完全相同。β-折疊和β-轉(zhuǎn)角等特定結(jié)構(gòu)的數(shù)目和所處位置有較大差異，Garnier-Robson方法分析該蛋白β-轉(zhuǎn)角較少，并且?guī)缀鯖]有無規(guī)則卷區(qū)。結(jié)合兩種算法，該蛋白α-螺旋位于18～28、37～47、64～76、92～99、155～160、218～229、244～248、256～266、314～318、329～337和357～371等區(qū)間，β-折疊位于14～17、34～37、48～50、80～83、106～108、128～132、139～146、147～150、166～173、179～187、191～195、200～206、211～215、235～239、241～244、252～256、270～278、297～309和342～349等區(qū)間，β-轉(zhuǎn)角位于4～6、9～11、29～31、124～128、136～138、161～165、196～200和338～340等區(qū)間（圖6）。

圖6 ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

2.7 ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白細(xì)胞抗原表位參數(shù)預(yù)測

運(yùn)用DNAStar程序中的Protean軟件，綜合分析預(yù)測ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白細(xì)胞抗原表位參數(shù)。采用Kyte-D00little法分析親水性，Karplus-Schulz法分析柔韌性，Jameson-Wolf法分析抗原指數(shù)，Emini法分析氨基酸表面可及性，結(jié)果顯示，31～32、58～67、71～72、87～96、98～99、101～109、111～113、128～129、149～167、190～198、206～210、212～213、216～219、222～233、279～284、310～311、314～319、337～345、352～353、355～358和366～376位 氨 基酸親水性較高；28～32、43～46、58～64、66～69、75～78、86～95、106～116、134～146、151～154、174～176、187～191、197～201、201～210、217～221、228～234、279～284、311～321、352～360和367～373位氨基酸柔韌性較高；9～15、30～32、42～45、57～79、86～98、107～116、150～154、160～165、172～178、206～210、217～223、226～233、265～271、278～285、291～297、309～321、323～329、338～342和 351～378位 氨基酸抗原指數(shù)較高；43～44、58～60、87～94、151～153、161～166、206～208、217～218、279～282、315～318、340～342和367～369位氨基酸表面可及性較高（圖7）。

圖7 ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白細(xì)胞表位參數(shù)預(yù)測

運(yùn)用DNAStar程序中的Protean軟件，分析比較不同參考株之間的B2L基因編碼蛋白的抗原指數(shù)。結(jié)果顯示，ORFV/QD/2015株與5株參考毒株的B2L基因編碼蛋白抗原指數(shù)較高的氨基酸位點(diǎn)基本一致（圖8）。

2.8 ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白可能呈彎曲狀螺旋結(jié)構(gòu)（圖9）。

圖8 ORFV不同參考株間抗原指數(shù)比較

圖9 ORFV/QD/2015 株B2L基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.9 ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白的信號(hào)肽預(yù)測

采用SignalP 4.1（http://www.chs.dtu.dk/services/ SignalP/）預(yù)測ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白信號(hào)肽，結(jié)果顯示該蛋白無信號(hào)肽（圖10）。

2.10 ORFV/QD/2015株B2L基因編碼的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

運(yùn) 用 TMHMM Server V2.0（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白并無跨膜結(jié)構(gòu)域（圖11）。

3 討論

圖10 ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測

圖11 ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

目前，ORF廣泛流行于全球各羊養(yǎng)殖國家或地區(qū)，且發(fā)生頻率和流行范圍呈逐年上升趨勢。我國雖是農(nóng)牧業(yè)大國，但由于對ORF缺乏關(guān)注，很多科研機(jī)構(gòu)沒有對該病開展理論研究，市場需求也較小，因此缺少相關(guān)ORF檢測試劑盒。本研究通過對涂明亮分離到的ORFV/QD/2015株的B2L基因進(jìn)行生物信息學(xué)研究，為進(jìn)一步對該基因的表達(dá)和診斷試劑盒制備奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也了解了當(dāng)前ORFV/QD/2015株的生物信息學(xué)特征。

本研究將ORFV/QD/2015株B2L基因核苷酸序列和氨基酸序列與GenBank上公布的12株ORFV參考株B2L基因核苷酸序列和氨基酸序列分別進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)：ORFV/QD/2015株B2L基因與其他12株參考株的B2L基因核苷酸序列同源性為96.8%～99.7%。其中，與2015年陜西省分離到的羊口瘡病毒B2L基因核苷酸序列同源性高達(dá)99.7%；與其他12株參考株B2L基因的氨基酸序列同源性為96.8%～99.2%，其中與2015年陜西省和2012年福建省分離到的羊口瘡病毒B2L基因氨基酸序列同源性高達(dá)99.2%。從進(jìn)化樹上可以看出，ORFV/QD/2015株與2015年陜西省分離到的ORFV處于同一遺傳進(jìn)化分支，因此認(rèn)為涂明亮分離到的ORFV/QD/2015株與陜西株的親緣性最近。

蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊的化學(xué)鍵能較高，能牢固地維持蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，通常處于內(nèi)部且不易變形，不利于抗原抗體的結(jié)合，而轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的區(qū)域結(jié)構(gòu)比較松散，穩(wěn)定性差，易發(fā)生扭曲變構(gòu)，多處于蛋白質(zhì)分子表面，容易與抗體分子接近及結(jié)合[7-8]。該蛋白α-螺旋和β-折疊所占比例較大，幾乎沒有無規(guī)則卷曲，所以該蛋白是否有良好的反應(yīng)原性有待驗(yàn)證。該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽是非分泌性蛋白，因此預(yù)測蛋白的生物學(xué)特征時(shí)，通過單一參數(shù)的確定是不準(zhǔn)確的，還需要同時(shí)考慮親水性、表面可及性、抗原指數(shù)和柔韌性等參數(shù)[9-10]。本研究經(jīng)綜合考慮，選取親水性高、柔韌性好、表面可及性大、抗原指數(shù)高的區(qū)域作為候選抗原表位，并兼顧二級(jí)結(jié)構(gòu)各參數(shù)，比較了不同參考株B2L基因編碼蛋白的抗原指數(shù)，最終推測出ORFV/QD/2015株B2L基因編碼蛋白的細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位區(qū)域?yàn)?8～69、86～95、205～211、216～219、279～284、311～321和352～378位氨基酸[11-12]，認(rèn)為該蛋白有一定的免疫原性。這些抗原優(yōu)勢表位區(qū)域的確定，為以后表達(dá)該蛋白提供了參考，但其蛋白免疫原性和反應(yīng)原性如何，還需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證[13]。

[1] 李旭東. 羊傳染性膿皰實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[2] 涂明亮. 羊口瘡病毒生物學(xué)特性研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[3[ 李金明. 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2011：4-5.

[4] 安維雪. 羊痘病毒內(nèi)蒙古分離株生物學(xué)特性的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[5] 吳健敏，呂茂民，陽玉彪，等. 豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜蛋白基因的克隆及其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位預(yù)測[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（4）：412-416.

[6] KARPLUS P A，SCHULTZ G E. Prediction of chain fl exibility in proteins [J]. Immunology，1985，72（2）：212.

[7] 張海，王開功，文明，等.牛乳頭狀瘤病毒貴州株L1基因克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（11）：2834-2843.

[8] 黃莉，謝麗基，鄧顯文，等. 禽呼腸孤病毒σB和σC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞抗原表位預(yù)測[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（11）：2880-2885.

[9] 馬凡舒，張蕾，王洋. B細(xì)胞抗原表位預(yù)測方法的研究進(jìn)展[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2016，43（1）：63-67.

[10] 溫立斌，何孔旺，楊漢春，等. 類豬圓環(huán)病毒因子P1 VP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞表位預(yù)測[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（5）：45-49.

[11] 王光祥，尚佑軍，呂占祿，等. 羊口瘡病毒B2L蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞表位的預(yù)測[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2014，42（11）：1133-1138.

[12] POLANCO C，BUHSE T，UVERSKY V N. Structure and function relationships of proteins based on polar pro fi le：A review[J]. Acta Biochim Pol，2016，63（2）：229-233.

[13] 杜杰，尹惠瓊，韋平，等. 藍(lán)舌病病毒VP7蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測[J]. 中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2013，21（1）：29-36.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Cloning and Bioinformatic Analysis of B2L Gene of Orf Virus QD/2015 Strain

Li Zhi1，Zhong Liang1，Zhang Jing1，Liu Chunyu1，F(xiàn)an Junhao1，Wang Haifeng1，Niu Yunlei2，Zhang Qijin1
（1. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018；2. Baarin Left Banner Animal Disease Prevention and Control Center，Chifeng，Inner Mongolia 025450）

In order to analyze molecular characteristics of B2L gene of Orf virus（ORFV/QD/2015） strain and to predict biological function of B2L protein. In this study，the B2L gene was ampli fi ed，cloned and sequenced. Using related bio-informatics softwares and methods，the amplified sequence was analyzed and B2L protein's secondary structure，tertiary structure，B-cell preponderant epitope，conserved domain，transmembrane domain and signal peptide were also predicted and analyzed. Results showed that the length of B2L gene was 1 137 bp，encoding 379 amino acids. The B2L gene of ORFV/QD/2015 strain shared amino acid identities of 96.8%～99.2% and nucleotide identities of 96.8%～99.7%，respectively，compared with other 12 ORFV reference strains. Phylogenetic analysis indicated a closest relationship between ORFV/QD/2015 strain and ORFV/ShaanXi/2015/China strain，the latter was isolated in 2015. Prediction of secondary structure of B2L protein indicated α-helix and β-sheet took up a large proportion.，and B2L protein possibly contained 7 potential antigen epitopes. However，no transmembrane domain or signal peptide was identi fi ed. The tertiary structure of B2L protein was curved spiral structure.

ORFV；B2L gene；bioinformatics analysis；prediction of protein structure

S852.65

B

1005-944X（2017）03-0091-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.024