鹽酸環(huán)丙沙星與牛血清白蛋白的相互作用研究*

王 珊，高奕紅，高豐琴

(咸陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

面對(duì)有機(jī)體的多樣與復(fù)雜及不斷惡化的環(huán)境，人類仍然要直接或間接地遭受各種各樣的危害，因此醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的進(jìn)步和突破，對(duì)新型、高效的藥物開(kāi)發(fā)和應(yīng)用顯得尤為重要和迫切。牛血清白蛋白在結(jié)構(gòu)與性能上與人血清白蛋白極為相似且便宜易得，通過(guò)把它放在模擬人體環(huán)境中來(lái)研究生物學(xué)和生命科學(xué)是十分有意義的[1-2]。由于牛血清白蛋白能與許多內(nèi)源物質(zhì)和外源物質(zhì)結(jié)合，根據(jù)其原理在生理?xiàng)l件下，使目標(biāo)藥物與牛血清白蛋白相結(jié)合，通過(guò)對(duì)其仔細(xì)研究和多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)了解藥物-牛血清白蛋白結(jié)合體的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合力、結(jié)合距離等問(wèn)題，對(duì)于生物學(xué)與生命科學(xué)的進(jìn)一步了解和對(duì)高效、低毒的新藥開(kāi)發(fā)及正確用藥有很強(qiáng)的指導(dǎo)和啟發(fā)意義[3-7]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三羥甲基氨基甲烷：Mr=121.14，天津化學(xué)制藥廠;牛血清白蛋白(BSA)：Mr=66 430，天津化學(xué)制藥廠；鹽酸環(huán)丙沙星(CIP)：Mr=385.82，山西津華暉星制藥廠。以上試劑均為分析純。

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-Vis specord50，德國(guó)耶拿公司；熒光分光光度計(jì)：RT-5310PC，日本島津公司；分析天平：AG135，瑞士梅特勒公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 Tris-HCl(pH=7.40)緩沖溶液的配制

用分析天平準(zhǔn)確稱取3.028 5 g三羥甲基氨基甲烷，將三羥甲基氨基甲烷溶解后定容于250 mL的容量瓶中配成濃度為0.1 mol/L的A溶液。

再準(zhǔn)確量取2.1 mL濃鹽酸(12 mol/L)，并將該濃鹽酸轉(zhuǎn)移至250 mL的容量瓶中并用蒸餾水定容，配成0.1 mol/L的鹽酸溶液記為B液。將B液緩慢加入A液中，在小磁子的攪拌下，在pH=7.40時(shí)加入約230 mL B溶液。然后用分析天平準(zhǔn)確稱量2.925 g NaCl固體，加入至上述混合溶液中，配成c(NaCl)=0.1 mol/L。

最后準(zhǔn)確稱量0.066 4 g BSA固體，加入至上述混合液中，并用蒸餾水定容至500 mL，配成含c(BSA)=2×10-6mol/L的Tris-HCl-NaCl-BSA溶液。

1.2.2 CIP溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.009 6 g CIP，并用上述緩沖溶液-BSA溶解并定容于250 mL的容量瓶中配成的溶液c(CIP)=1×10-4mol/L。

1.2.3 不同c(CIP)的配制

取容量為25 mL的6個(gè)容量瓶，并依次標(biāo)上0、1、2、3、4、5號(hào)，并按序號(hào)依次加入0、1、2、3、4、5 L已配好的c(CIP)=1×10-4mol/L溶液，然后用緩沖溶液-BSA定容，分別配成c(CIP)=0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6mol/L溶液用于熒光和紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)量。

1.2.4 同步熒光光譜法測(cè)量不同c(CIP)

將0、1、2、3、4、5號(hào)不同c(CIP)依次加入到石英比色皿中，調(diào)節(jié)熒光光譜儀，使熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度分別是10和5，固定波長(zhǎng)在280 nm處，波長(zhǎng)范圍為300～540 nm，進(jìn)行同步熒光光譜法測(cè)量，將每組熒光強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)保存下來(lái)。

1.2.5 紫外-可見(jiàn)光譜法測(cè)量c(CIP)

將0、1、2、3、4、5號(hào)不同c(CIP)依次加入到石英比色皿中，調(diào)節(jié)紫外-可見(jiàn)分光光度儀，在波長(zhǎng)范圍為190～540 nm之間以蒸餾水作為參比，掃描紫外-可見(jiàn)光譜，并保存數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物與BSA的相互作用的光譜圖

2.1.1 不同c(CIP)與BSA間作用的熒光光譜圖

在c(BSA)=2×10-6mol/L條件下，不同c(CIP)與BSA間作用的熒光光譜圖見(jiàn)圖1。

λ/nm1～6為c(CIP)=0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6 mol/L圖1 不同c(CIP)與BSA間作用的熒光光譜圖

牛血清白蛋白的熒光發(fā)射波長(zhǎng)在347 nm處[8]。由圖1可見(jiàn)，隨著c(CIP)的增大，牛血清白蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸減小，說(shuō)明鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)牛血清白蛋白具有猝滅的作用[9]。

2.1.2 不同c(CIP)與BSA間作用的同步熒光光譜圖

在c(BSA)=2×10-6mol/L條件下，不同c(CIP)與BSA間作用的同步熒光光譜圖見(jiàn)圖2。

恒定波長(zhǎng)的熒光光譜法被稱為同步熒光光譜法，在可能的條件下，選擇等于斯托克斯位移的Δλ，在理論上也應(yīng)該這樣，但實(shí)際上很多情況下要根據(jù)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行擇優(yōu)選擇，例如：熒光黃的同步熒光分析中Δλ=3 nm，此時(shí)所得同步熒光峰形好、互不干擾，而隨著Δλ的增大，當(dāng)Δλ=10.20 nm時(shí)，同步熒光峰將變寬，估計(jì)會(huì)有重疊。恒定波長(zhǎng)同步熒光光譜法具有選擇性好，靈敏度高，受干擾小等特征。

λ/nm1～6為c(CIP)=0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6 mol/L圖2 不同c(CIP)與BSA間作用的同步熒光光譜圖

通過(guò)對(duì)圖2的分析可以清楚地知道，隨著c(CIP)濃度的增大，牛血清白蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸減小，這結(jié)果充分證明CIP對(duì)牛血清白蛋白有熒光猝滅的效果。另一方面，從對(duì)以上圖譜的分析可充分證明CIP對(duì)牛血清白蛋白有熒光猝滅作用，而且伴隨著c(CIP)的增大，猝滅強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)[10-12]。

2.1.3 紫外-可見(jiàn)分光光譜圖

紫外-可見(jiàn)吸收光譜法是驗(yàn)證小分子藥物與牛血清白蛋白是否生成復(fù)合物的非常有效的方法，為確證CIP與BSA的作用，分別測(cè)定了BSA及CIP-BSA體系的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，在c(BSA)=2×10-6mol/L條件下，不同c(CIP)與BSA間作用的紫外-可見(jiàn)分光光譜圖見(jiàn)圖3。

λ/nm1～6為c(CIP)=0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6 mol/L圖3 不同c(CIP)與BSA間作用的紫外-可見(jiàn)分光光譜圖

由圖3可見(jiàn)，CIP-BSA體系的吸收光譜與其理論吸收光譜有明顯差別，說(shuō)明CIP與牛血清白蛋白之間發(fā)生了相互作用，并生成了新復(fù)合物[5]。

2.2 熒光光譜分析

2.2.1 CIP與BSA相互作用分析

通過(guò)對(duì)圖1～圖3的分析，牛血清白蛋白的熒光強(qiáng)度隨c(CIP)的增大而表現(xiàn)為逐漸降低，且在最大發(fā)射波長(zhǎng)的吸收峰處，牛血清白蛋白略有紅移現(xiàn)象，說(shuō)明CIP對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝滅過(guò)程是靜態(tài)猝滅，Stern-Volmer方程如下。

F0/F=1+Kqτ0c=1+Ksvc

(1)

式中，τ0為熒光壽命的大小，s；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，L/mol；Kq為猝滅速率常數(shù)，L/(mol·s)；F0、F分別為有、無(wú)猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；c為猝滅劑的濃度， mol/L。

CIP與BSA相互作用的Stern-Volmer分析見(jiàn)圖4。

c(CIP)×106/(mol·L-1)圖4 CIP與BSA相互作用的Stern-Volmer分析

由圖4計(jì)算得出：Ksv=34 053 L/mol；Kq=3.405 3×1012L/(mol·s)。

Kq反映了體系中分子的彼此擴(kuò)散和相互碰撞對(duì)生物大分子熒光壽命衰減速率的影響,各類熒光猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010L/(mol·s)。通過(guò)計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIP對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝滅速率常數(shù)Kq值都遠(yuǎn)大于2.0×1010L /(mol·s)(最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù))[14]，可以推斷動(dòng)態(tài)猝滅應(yīng)該是靜態(tài)猝滅。

當(dāng)猝滅體分子和熒光物質(zhì)分子之間形成新的復(fù)合物而發(fā)生靜態(tài)猝滅時(shí),服從Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程：

(2)

通過(guò)圖5計(jì)算得到靜態(tài)猝滅常數(shù)KLB=3.593×10-5L/mol，更加充分證明了該熒光猝滅不是因?yàn)榕鲎捕鸬膭?dòng)態(tài)猝滅，而是通過(guò)反應(yīng)生成的化合物而導(dǎo)致的靜態(tài)猝滅[15]。

c(CIP)-1×10-5/(L·mol-1)圖5 CIP與BSA相互作用的雙倒數(shù)分析

2.2.2 藥物與BSA相互作用的猝滅反應(yīng)參數(shù)

藥物與BSA相互作用的猝滅反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 藥物與BSA相互作用的猝滅參數(shù)

通過(guò)表1數(shù)據(jù)可知，CIP與牛血清白蛋白相互作用的猝滅規(guī)律為靜態(tài)猝滅[11-13]，同時(shí)由猝滅數(shù)據(jù)按Stern-Volmer方程，得到的猝滅速率常數(shù)Kq值都遠(yuǎn)大于2.0×1010L/(mol·s)(最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù))，充分證實(shí)了猝滅不是由于碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅,而是由藥物與牛血清白蛋白相互作用反應(yīng)生成化合物而引起的靜態(tài)猝滅[14-15]。另一方面，通過(guò)計(jì)算數(shù)據(jù)可知，由上述Stern-Volmer方程，雙倒數(shù)曲線的相關(guān)系數(shù)R可看出各曲線線性很好，結(jié)合點(diǎn)數(shù)n都近似為1。

3 結(jié) 論

CIP與牛血清白蛋白相互作用的規(guī)律為靜態(tài)猝滅，牛血清白蛋白與CIP之間的結(jié)合常數(shù)K=35 010.636、靜態(tài)猝滅常數(shù)KLB=3.593×10-5、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.081 3、猝滅速率常數(shù)Kq=3.405 3×1012。這些數(shù)據(jù)分析結(jié)果可以為之后的醫(yī)藥研發(fā)提供很大的幫助。

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