基于免疫組化法分析肺腺癌S100A6蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

南巖東 房延鳳 姜華 金發(fā)光 楊拴盈

·論著·

基于免疫組化法分析肺腺癌S100A6蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

南巖東1房延鳳1姜華1金發(fā)光1楊拴盈2

目的探討S100A6蛋白在肺腺癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法收集2007年1月至2009年1月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院、第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院手術(shù)切除的肺癌標(biāo)本，共計98例肺腺癌及其癌旁正常肺組織，用免疫組織化學(xué)法檢標(biāo)本中S100A6蛋白的表達(dá)情況，分析S100A6蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征及生存預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果S100A6蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肺組織(P<0.001)；其表達(dá)與患者性別和年齡無相關(guān)性(P>0.05)，而與吸煙指數(shù)、腫瘤細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)；98例患者5年隨訪期間77例患者死亡，10例患者存活，11例患者失訪，5年生存率為11.49%。其中S100A6蛋白低表達(dá)患者5年累計生存率63.6%，中位生存時間68月；中表達(dá)患者5年累計生存率14.3%，中位生存時間45月；高表達(dá)患者5年累計生存率0%，中位生存時間29月，生存曲線顯示S100A6不同表達(dá)狀態(tài)患者生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；COX回歸模型分析顯示，腫瘤分化、TNM分期和S100A6表達(dá)狀態(tài)是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨立因素(P<0.05)；S100A6蛋白表達(dá)對肺腺癌診斷靈敏度為84.69%，特異度為69.39%。結(jié)論S100A6蛋白在肺腺癌組織中顯著過表達(dá)，與腫瘤分期、分化、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

S100A6蛋白； 肺腺癌； 免疫組織化學(xué)； 預(yù)后

S100蛋白家族是一組具有EF手型的鈣依賴調(diào)節(jié)蛋白，參與細(xì)胞的增殖、分化、鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化、酶活性和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)等多種生理功能[1-2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)S100蛋白家族包含21個成員,其中人類S100A6蛋白含有90個氨基酸殘基,其單體與鈣離子結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化,通過與靶蛋白的相互作用,在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)作用[3-4]。Hua等[5]應(yīng)用cDNA 基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌組織較正常肝組織S100A6表達(dá)上調(diào)超過10倍,且S100A6表達(dá)程度與腫瘤組織低分化程度顯著相關(guān)。Komatsu等[6]應(yīng)用免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn),S100A6在結(jié)腸癌腫瘤組織周邊部染色較中央部染色明顯加深,其表達(dá)與結(jié)腸癌Dukes分期有密切關(guān)系,提示S100A6可能涉及到結(jié)腸腺癌的侵襲與進(jìn)展。我們應(yīng)用鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)S100A6蛋白在肺腺癌中表達(dá)明顯上調(diào)[7]。為了明確S100A6表達(dá)與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對肺腺癌組織S100A6蛋白進(jìn)行檢測，進(jìn)一步分析了其表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征及生存預(yù)后的關(guān)系。

材料與方法

一、一般資料

收集2007年1月至2009年1月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院、第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院手術(shù)切除的肺癌標(biāo)本，共計98例肺腺癌及其癌旁正常肺組織；男56例，女42例；年齡(54.53±16.21)歲； TNM 分期(UICC，2007)：Ⅰ期11例、Ⅱ期23例、Ⅲ期26例和Ⅳ期38例。所有患者術(shù)前均未行放化療，無其他腫瘤史，臨床及病理資料完整。術(shù)后收集新鮮組織標(biāo)本反復(fù)使用無菌生理鹽水沖洗，去除血跡及其他壞死物，置于-80 ℃低溫冰箱保存。術(shù)后隨訪至2014 年5月，11例患者失訪, 其余患者隨訪資料完整。

二、主要試劑

兔抗人S100A6 多克隆抗體購于美國NeoMarkers公司，工作濃度1︰100；SP 試劑盒購于北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。樣本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。免疫組化染色按試劑盒說明進(jìn)行：石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，3% H2O2室溫孵育15 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 漂洗、加封閉液孵育15 min后，一抗滴加后4 ℃孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。陽性對照為已知染色陽性的人肺腺癌組織切片做標(biāo)準(zhǔn)，PBS緩沖液替代一抗做低對照。

三、結(jié)果判定

由2位病理科醫(yī)師在未知患者臨床資料的情況下，獨立觀察每張切片, 每例切片在40倍鏡下隨機選取5個視野進(jìn)行觀察，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)清晰的黃色、棕黃色顆粒為S100A6 蛋白表達(dá)陽性。陽性細(xì)胞數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞10%以下為0分，10%～49%為1分，50%～69%為2分，≥70%為3分；信號強弱的判斷標(biāo)準(zhǔn)：低或者基本無顯色為0分，弱陽性為1分，陽性為2分，強陽性為3分；兩項評分相乘，≤2為低表達(dá)(+)，3～4為中表達(dá)(++)，6～9為高表達(dá)(+++)。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料采用率表示，組間比較應(yīng)用χ2檢驗；應(yīng)用Kaplan-Meier 對生存率進(jìn)行比較，Cox比例風(fēng)險回歸模型確立患者生存時間的影響因素；檢驗標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，取雙側(cè)檢驗。

結(jié) 果

一、S100A6在肺腺癌組織及正常肺組織表達(dá)檢測

S100A6 蛋白的免疫著色主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，腫瘤間質(zhì)和細(xì)胞核未見染色，見圖1。98例肺腺癌標(biāo)本組織中S100A6低表達(dá)15例(15.3%)，中表達(dá)26例(26.5%)，高表達(dá)57例(58.2%)；配對的98例正常肺組織低表達(dá)68例(69.4%)，中表達(dá)23例(23.5%)，高表達(dá)7例(7.1%)；兩組表達(dá)比較，統(tǒng)計具有顯著性差異(P<0.001)，見表1。

表1 S100A6在肺腺癌組織及正常肺組織的差異表達(dá)(%)

圖1 S100A6蛋白在肺腺癌及其配對正常肺組織中表達(dá)；注: A：正常肺組織低表達(dá)；B：肺腺癌組織低表達(dá)(×10)；C：肺腺癌組織中表達(dá)；D：肺腺癌組織高表達(dá)(×40)

二、S100A6蛋白表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征關(guān)系

S100A6蛋白表達(dá)與肺腺癌患者性別、年齡無相關(guān)性(P>0.05)，而與患者吸煙指數(shù)、腫瘤細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期均有顯著相關(guān)性能(P<0.05)，見表2。

表2 S100A6蛋白表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征關(guān)系[n(%)]

三、S100A6蛋白不同表達(dá)患者生存分析

對98例患者進(jìn)行了隨訪，隨訪時間5年，隨訪期間77例患者死亡，10例患者存活，11例患者失訪，5年生存率為11.49%。S100A6蛋白低表達(dá)患者5年累計生存率63.6%，中位生存時間68月；中表達(dá)患者5年累計生存率14.3%，中位生存時間45月；高表達(dá)患者5年累計生存率0%，中位生存時間29月，見表3；生存曲線顯示S100A6不同表達(dá)狀態(tài)患者生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3和圖2。

表3 S100A6不同表達(dá)狀態(tài)患者平均生存期比較

圖2 S100A6不同表達(dá)狀態(tài)患者生存率比較；注：A：生存函數(shù)曲線；B：危險函數(shù)曲線

四、COX回歸模型分析

將患者臨床病理特征因素單因素，包括性別、年齡、吸煙指數(shù)、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、S100A6表達(dá)等選入COX多因素比例風(fēng)險回歸模型，采用逐步回歸法多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤分化(P<0.01)、TNM分期(P<0.01)和S100A6表達(dá)狀態(tài)(P<0.01)是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨立因素，見表4、圖3。

表4 87例肺腺癌患者生存預(yù)后的COX回歸多因素分析

圖3 基于隨訪患者的生存；注：(A)和死亡(B)函數(shù)曲線

五、S100A6蛋白表達(dá)對肺腺癌診斷效能評價

以S100A6 蛋白表達(dá)程度重新區(qū)分肺癌組織和正常肺組織，中、高表達(dá)定義為肺癌組織，低表達(dá)定為正常肺組織，結(jié)果113例判斷為肺癌組織，83例判斷為正常肺組織，見表5；經(jīng)計算，其靈敏度為84.69%，特異度為69.39%，假陽性預(yù)測值為73.45%，陰性預(yù)測值81.93%。

表5 S100A6蛋白表達(dá)判斷肺癌及正常肺組織

討 論

原發(fā)性支氣管肺癌(簡稱肺癌)是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著人類的生命[8-10]。肺腺癌惡性程度高，早期即可出現(xiàn)胸膜、縱隔淋巴結(jié)、骨骼、腦等器官的轉(zhuǎn)移，致使患者初診時已處于Ⅲ-Ⅳ期，失去了手術(shù)治療的時機，5年生存率仍然不足5%[11]。胸部低劑量CT掃描雖有可能發(fā)現(xiàn)早期肺癌，但是其高額花費和輻射危害使得該項檢查不可能反復(fù)或重復(fù)進(jìn)[12]。肺癌標(biāo)記物是肺癌細(xì)胞產(chǎn)生和釋放以及肺癌發(fā)生和發(fā)展過程中以代謝產(chǎn)物的形式存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)或宿主體液中的某些異常增多的物質(zhì)、酶及激素等。這些分子標(biāo)記物對原發(fā)肺癌的早期診斷、高危人群的篩選、良惡性腫瘤的鑒別、腫瘤發(fā)展程度的判斷、腫瘤治療效果的評價以及腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后的預(yù)測等方面有重要作用[13]。肺癌分子標(biāo)記物屬非損傷、低成本的檢測手段，更能反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)特性，因此備受臨床青睞[14]。然而，目前臨床上目前尚未找到理想的肺癌腫瘤標(biāo)志物。

近年來發(fā)現(xiàn)，S100蛋白家族是在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)作用, 參與細(xì)胞周期活動、細(xì)胞分化、腫瘤生長以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌活動等過程的一類非泛素化、EF-手型鈣結(jié)合蛋白[1]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)S100蛋白家族成員有23個，其中 S100A6與腫瘤的增殖、浸潤轉(zhuǎn)移和凋亡密切相關(guān),且在多數(shù)上皮腫瘤如黑色素瘤、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膽管癌、卵巢癌、人急性粒細(xì)胞白血病等腫瘤中高表達(dá)[15-17]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測了98例肺腺癌及其癌旁正常肺組織標(biāo)本中S100A6蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示肺癌組織較正常肺組織S100A6蛋白顯著高表達(dá)，其免疫著色主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，腫瘤間質(zhì)和細(xì)胞核未見染色，與文獻(xiàn)報道一致。S100A6蛋白表達(dá)與肺腺癌患者性別、年齡無相關(guān)性(P>0.05)，而與吸煙指數(shù)、腫瘤細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期均有顯著相關(guān)性，且隨吸煙指數(shù)、分化程度、轉(zhuǎn)移及分期程度加重而表達(dá)增強，進(jìn)一步提示S100A6蛋白表達(dá)異?？赡苁欠伟┌l(fā)生的早期事件，并且伴隨了肺癌的發(fā)展全部過程，因此臨床上通過監(jiān)測S100A6蛋白的表達(dá)有助于了解腫瘤的生物學(xué)特性[18]。

腫瘤標(biāo)志物診斷與鑒別診斷的能力和及其對患者的預(yù)后判斷是臨床上關(guān)注的關(guān)鍵問題。本研究應(yīng)用S100A6 蛋白表達(dá)高、低達(dá)程度重新界定肺癌組織和正常肺組織，獲得了良好的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值等診斷效能指標(biāo)，表明通過S100A6蛋白檢測聯(lián)合影像學(xué)可為肺內(nèi)結(jié)節(jié)的診斷提供有效的途徑。本研究數(shù)據(jù)分析示，S100A6的表達(dá)狀態(tài)與患者的生存期有明顯相關(guān)性，低表達(dá)患者比高表達(dá)患者生存期顯著延長；結(jié)合患者的臨床病理特征，應(yīng)用COX多因素比例風(fēng)險回歸模型分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤分化、TNM分期和S100A6表達(dá)狀態(tài)是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨立因素，據(jù)此建立肺腺癌患者生存函數(shù)可對肺腺癌患者進(jìn)行有效的預(yù)后判斷。

已有的研究表明，S100A6蛋白功能包括鈣傳感器、釋放細(xì)胞內(nèi)鈣信號、調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞分化，刺激Ca2+依賴的胰島素釋放、刺激催乳素分泌及胞外分泌等。S100A6通過調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架，與泛素連接酶及CacyBP/SIP蛋白相互作用導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白降解，在增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)[19-21]。然而，S100A6的調(diào)控可能涉及復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)機制，尚需要進(jìn)一步應(yīng)用分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)明確S100A6在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制。

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(本文編輯：王亞南)

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Analysis of S100A6 protein expression and the clinical significance of patients with lung adenocarcinoma based on the method of immunohistochemisty

NanYandong1,FangYanfeng1,JiangHua1,JinFaguang1,YangShuangying2.

1DepartmentofRespiratoryDisease,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,SecondAffiliatedHospitalofMedicalSchool,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China

JinFaguang,Email：jinfag@fmmu.edu.cn

Objective To explore S100A6 protein expression in lung adenocarcinoma and its clinical significance. Methods Immunohistochemisty (IHC) method was used to detect S100A6 protein expression in 98 cases of lung adenocarcinoma tissues and their paired adjacent normal lung tissues. The interrelation of S100A6 protein expression and clinical and pathological characteristics was analyzed by statistics methods. Results The expression of S100A6 protein was higher in lung adenocarcinoma tissue than that in normal lung tissue (P<0.001). The expression of S100A6 protein was not related to age and sex(P>0.05), while is significantly related to smoking index, tumor differentiation, lymph node metastasis, distant metastasis and TNM stage(P<0.05). During the 5-year follow-up period, 77 patients of 98 patients died, 10 patients survived, 11 patients were lost, and the 5-year survival rate was 11.49%. The 5-year cumulative survival rate and the median survival time are respectively 63.6% and 68 months in the patients with low expression of S100A6 protein; 14.3% and 45 months in the patients with moderate expression of S100A6 protein and 0% and 29 months in the patients with high expression of S100A6 protein. Survival curve showed that the survival rate of patients with different S100A6 expression was statistically significant (P<0.05). Cox regression model revealed that the tumor differentiation, TNM stage and S100A6 protein expression were independent hazard factors of lung adenocarcinoma prognosis (P<0.05). The diagnostic sensitivity of the S100A6 protein expression level to lung adenocarcinoma was 84.69% and the specificity was 69.39%. Conclusions S100A6 protein is over-expressed in lung adenocarcinoma tissue and is closely related to the differentiation, stage, metastasis and prognosis of lung adenocarcinoma.

S100A6 protein; Lung Adenocarcinoma; Immunohistochemisty; Prognosis

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.01.004

國家自然科學(xué)基金資助項目(81001040) 第四軍醫(yī)大學(xué)優(yōu)秀文職人員基金(2011-01) 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院后備人才基金(5033)

710038西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸內(nèi)科1710004西安，西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科2

金發(fā)光，Email：jinfag@fmmu.edu.cn

R563，R734.2

A

2015-12-24)