miR-497-5p對人宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制

張君，高蘭陽，詹平，毛熙光

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

miR-497-5p對人宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制

張君，高蘭陽，詹平，毛熙光

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目的 探討miR-497-5p對人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)增殖的抑制作用及機(jī)制。方法 將對數(shù)生長期人宮頸癌HeLa細(xì)胞隨機(jī)分為兩部分，第一部分細(xì)胞隨機(jī)分為四組：miR-497-5p mimics NC+IKCa1 3′端非翻譯區(qū)(3′-URT)野生型雙熒光素酶重組質(zhì)粒載體(IKCa1-wt)轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics NC+3′-URT突變型雙熒光素酶重組質(zhì)粒載體(IKCa1-mut)轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-mut轉(zhuǎn)染組，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒48 h，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測HeLa細(xì)胞熒光素酶活性。第二部分細(xì)胞隨機(jī)分為三組：miR-497-5p mimics轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics NC轉(zhuǎn)染組和空白對照組，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，用qRT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞IKCa1 mRNA表達(dá)，Western boltting法檢測細(xì)胞IKCa1蛋白表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。結(jié)果 第一部分細(xì)胞中的miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性較其他三組降低(P均<0.05)，其他三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，證實(shí)miR-497-5p與IKCa1 3′-URT存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。第二部分細(xì)胞中的miR-497-5p mimics轉(zhuǎn)染組IKCa1 mRNA、蛋白的相對表達(dá)量較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。第二部分細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h，miR-497-5p mimics轉(zhuǎn)染組增殖能力均較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 miR-497-5p可以通過負(fù)向調(diào)控IKCa1基因表達(dá)以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。

子宮頸癌；微小RNA-497-5p；中電導(dǎo)鈣激活性鉀離子通道；IKCa1基因；HeLa細(xì)胞；細(xì)胞增殖

中電導(dǎo)鈣激活性鉀離子通道(IKCa1)在人體廣泛分布，通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和細(xì)胞膜電位，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理、病理活動。目前證實(shí)IKCa1基因在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤組織中高表達(dá)[1～4]，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成[5]。前期研究[6,7]也發(fā)現(xiàn)，IKCa1基因在宮頸癌組織呈高表達(dá)，但其高表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為[8]，在調(diào)節(jié)惡性腫瘤基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。為了解IKCa1在宮頸癌中高表達(dá)的機(jī)制，2016年4～10月，本研究采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)、qRT-PCR技術(shù)、Western blotting技術(shù)鑒定IKCa1是否為miR-497-5P的靶基因，初步探討miR-497-5p是否能通過靶向調(diào)控IKCa1基因影響HeLa細(xì)胞增殖。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株由西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供；胎牛血清購自杭州四季清；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco；Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen；IKCa1 3′端非翻譯區(qū)(3′-URT)的野生型和突變型雙熒光素酶重組質(zhì)粒載體(IKCa1-wt、IKCa1-mut)、miR-497-5p模擬物(miR-497-5p mimics)、miR-497-5p 模擬物陰性對照(miR-497-5p mimics NC)，均由上海吉瑪制藥構(gòu)建合成；雙Luciferase報告基因檢測系統(tǒng)試劑盒購于Promega；總RNA提取試劑盒購于北京天根；Rever Tre Ace qPCR RT Master Mix和SYBR Green RT-PCR Master Mix購于TOYOBO；PCR引物由上海生工合成；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京凱基生物；IKCa1、β-actin抗體及二抗購于英國Abcam；CCK-8試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所。采用Targetscan、starBase、miRanda、miRDB在線搜索可能與IKCa1 3′-URT結(jié)合的miRNA，發(fā)現(xiàn)IKCa1 3′-URT與miR-497-5p存在互補(bǔ)配對序列，提示IKCa1可能為miR-497-5p的靶基因。

1.2 HeLa細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞隨機(jī)分為兩部分。第一部分HeLa細(xì)胞按1×105/孔接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，隨機(jī)分為四組，miR-497-5p mimics NC+IKCa1-wt轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics NC+IKCa1-mut轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-mut轉(zhuǎn)染組。第二部分HeLa細(xì)胞按照3×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，隨機(jī)分為三組：miR-497-5p mimics轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics NC轉(zhuǎn)染組和空白對照組。將各培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，配制轉(zhuǎn)染混合液，利用Lipofectamin2000，每孔轉(zhuǎn)染適量相應(yīng)的雙熒光素酶報告載體和(或)miRNA。轉(zhuǎn)染6 h后，棄轉(zhuǎn)染液，加入適量新鮮不含抗生素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 HeLa細(xì)胞內(nèi)雙熒光素酶活性檢測 采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)。第一部分HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，1×PLB裂解液按照100 μL/孔加入24孔培養(yǎng)板中，室溫輕緩晃動培養(yǎng)板15 min。每孔取裂解產(chǎn)物20 μL置于檢測板中，按照30 μL/孔加入LARⅡ試劑，于多功能酶標(biāo)儀上檢測螢火蟲熒光素酶活性。取出檢測板，每孔加入Stop & Glo Reagent試劑30 μL，于多功能酶標(biāo)儀上檢測海腎熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.4 HeLa細(xì)胞內(nèi)IKCa1 mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR技術(shù)。第二部分HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，按照RNA提取試劑盒步驟提取細(xì)胞總RNA，NanoDrop ND-1000測定及變性瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA質(zhì)量。質(zhì)量合格的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min。按照熒光定量試劑說明加入相應(yīng)組分，反應(yīng)體系20 μL。IKCa1上、下游引物：5′-GCAGGAACTGGCATTGGACT-3′、5′-CTGATCGTGCATTTAACCAGGA3′，GAPDH上、下游引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG3′、5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、56 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s 40個循環(huán)，95 ℃ 10 s，72 ℃ 5 s，95 ℃ 10 s。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算IKCa1 mRNA相對表達(dá)量。

1.5 HeLa細(xì)胞內(nèi)IKCa1蛋白表達(dá)檢測 采用Wertern boltting法。第二部分HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后提取細(xì)胞總蛋白。將總蛋白分為兩部分，一部分進(jìn)行蛋白濃度測定，一部分加入適量5×Loding buffer混勻，沸水浴5 min后-80 ℃保存?zhèn)溆?。取等量?xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗膜1次。5%脫脂奶粉封閉，搖床搖晃2 h后，TBST洗膜3次，加入封閉液稀釋好的一抗(IKCa1 1∶200，β-actin 1∶5 000)，4 ℃搖床孵育過夜。室溫?fù)u床使之恢復(fù)室溫，TBST洗膜3次，加入稀釋好的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)成像，保存圖片。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。采用Quntity One軟件測得灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 HeLa細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。第二部分HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，經(jīng)胰酶消化，收集細(xì)胞，將其按照6×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)置調(diào)零孔，每組5個復(fù)孔，置于恒溫箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，更換培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10 μL，避光培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長測吸光度值(OD值)，OD值與細(xì)胞數(shù)呈正比，以此評估細(xì)胞增殖能力。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 miR-497-5p與IKCa1 3′-URT相互作用對熒光素酶活性的影響 miR-497-5p mimics NC+IKCa1-wt轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics NC+IKCa1-mut轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-mut轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性分別為0.015 2±0.000 3、0.007 1±0.000 1、0.015 1±0.000 4、0.015 0±0.000 4。miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性較其他三組降低(P均<0.05)，其他三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。證實(shí)miR-497-5p與IKCa1 3′-URT存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 miR-497-5p 對HeLa細(xì)胞內(nèi)IKCa1 mRNA表達(dá)的影響 空白對照組、miR-497-5p mimics NC轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics轉(zhuǎn)染組IKCa1 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.000±0.000、1.135±0.153、0.395±0.070。miR-497-5p mimics轉(zhuǎn)染組IKCa1 mRNA相對表達(dá)量較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 miR-497-5p 對HeLa細(xì)胞內(nèi)IKCa1蛋白表達(dá)的影響 空白對照組、miR-497-5p mimics NC轉(zhuǎn)染組、miR-497-5p mimics轉(zhuǎn)染組IKCa1蛋白的相對表達(dá)量分別為0.869±0.019、0.939±0.044、0.425±0.021。miR-497-5p mimics轉(zhuǎn)染組IKCa1蛋白相對表達(dá)量較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.4 miR-497-5p 對HeLa細(xì)胞增殖能力的影響 培養(yǎng)24、48、72、96 h，miR-497-5p mimics轉(zhuǎn)染組OD值均較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組不同培養(yǎng)時間細(xì)胞增殖能力比較

3 討論

IKCa1是鈣激活鉀離子通道家族中的重要成員之一，由定位于19號染色體q13.2區(qū)的IKCa1基因編碼，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能和細(xì)胞分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。近年來大量研究證實(shí)，IKCa1參與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。Haren等[1]發(fā)現(xiàn)，IKCa1在乳癌組織和乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與乳腺癌分期、分化程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Lallet-Daher等[3]在研究中發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中IKCa1基因呈高表達(dá)，IKCa1特異性阻斷劑TRAM-34阻斷IKCa1通道后，p21表達(dá)水平升高，從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。Wang等[2]通過小鼠在體試驗(yàn)證實(shí)，阻斷IKCa1通道能抑制子宮內(nèi)膜癌的生長。Zhang等[9]利用shRNA技術(shù)沉默IKCa1基因和TRAM-34阻斷IKCa1通道后，細(xì)胞周期素D1、細(xì)胞周期素E、存活素表達(dá)降低，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期阻滯在G0～1期；同時發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)水平下降，從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲。我們前期研究中也證實(shí)IKCa1在宮頸癌中高表達(dá)[6，7]，克霉唑阻斷IKCa1通道后，IKCa1 mRNA表達(dá)下調(diào)，并抑制HeLa細(xì)胞增殖[10]，提示IKCa1基因參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，然而IKCa1高表達(dá)的機(jī)制尚不明確。

近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA調(diào)控人類1/3以上的基因，超過一半的miRNA基因位于腫瘤相關(guān)的染色體或其脆性位點(diǎn)上，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[11]，發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用。目前已證實(shí)，宮頸癌及其癌前病變與高危型人類乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染密切相關(guān)。有研究[12]顯示，miR-497-5p在宮頸癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，與高危型HPV感染密切相關(guān)。因此，對miR-497-5p與IKCa1基因是否存在靶向關(guān)系的探討，可能有利于了解IKCa1基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的意義及作用機(jī)制。

目前鑒定miRNA靶基因的方法主要有兩類：一類是生物信息學(xué)方法，操作簡單方便，但仍存在假陽性的可能；一類是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，包括雙熒光素酶報告基因、RNA檢測和Wertern boltting技術(shù)，準(zhǔn)確率高。本研究采取生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來鑒定IKCa1是否為miR-497-5P的靶基因。miRNA mimics是用化學(xué)合成方法合成的，通過模擬生物體內(nèi)源的miRNA，增強(qiáng)內(nèi)源性miRNA的表達(dá)。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics來上調(diào)HeLa細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)水平。miRNA主要通過與靶基因mRNA 3′-URT區(qū)的互補(bǔ)序列完全或不完全結(jié)合而發(fā)揮作用。利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)來檢測miR-497-5p與IKCa1 mRNA 3′-URT 是否存在互補(bǔ)序列。熒光素酶活性檢測顯示共轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics和IKCa1-wt后，HeLa細(xì)胞熒光素酶活性降低，初步證實(shí)IKCa1為miR-497-5p的靶基因之一，為miR-497-5p靶向調(diào)控IKCa1基因提供了結(jié)構(gòu)學(xué)依據(jù)。miRNA調(diào)控基因表達(dá)的主要方式是以完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)結(jié)合目的基因mRNA 3′-URT，導(dǎo)致mRNA降解，從而抑制蛋白質(zhì)合成。因此我們采用qRT-PCR、Wertern boltting法檢測各組IKCa1 mRNA及蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-497-5p mimics的HeLa細(xì)胞中IKCa1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均較空白對照組降低，提示miR-497-5p可負(fù)向調(diào)控IKCa1的表達(dá)，從而為miR-497-5p靶向調(diào)控IKCa1基因提供了功能學(xué)依據(jù)。

本研究通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了miR-497-5p mimics的HeLa細(xì)胞增殖活性降低，提示miR-497-5p可抑制HeLa細(xì)胞增殖活性，可能與miR-497-5p負(fù)向調(diào)控IKCa1基因有關(guān)。同時，與我們前期研究中發(fā)現(xiàn)阻斷IKCa1通道能抑制HeLa細(xì)胞增殖的結(jié)論相符。

綜上所述，miR-497-5p可以抑制HeLa細(xì)胞增殖，這可能是通過下調(diào)IKCa1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

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Inhibitory effect of miR-497-5p on proliferation of human cervical carcinoma cell

ZHANGJun,GAOLanyang,ZHANPing,MAOXiguang

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the inhibitory effect and mechanism of miR-497-5p on proliferation of human cervical cancer HeLa cells. Methods The human cervical cancer HeLa cells in the logarithmic growth phase were randomly divided into two parts. The first part was randomly divided into 4 groups: miR-497-5p mimics NC and IKCa1-wt co-transfection group, miR-497-5p mimics and IKCa1-wt co-transfection group, miR-497-5p mimics NC and IKCa1-mut co-transfection group and miR-497-5p mimics and IKCa1-mut co-transfection group which were transfected by corresponding plasmids for 48 h. The luciferase activity of HeLa cells was detected by double luciferase reporter assay system. The second part was randomly divided into 3 groups: miR-497-5p mimics transfection group, miR-497-5p mimics NC transfection group and blank control group. Cells in each group were transfected with Lipofectamin 2000. The expression of IKCa1 mRNA was detected by qRT-PCR, IKCa1 protein expression was detected by Western blotting and the proliferation ability of HeLa cells was measured by CCK-8 assay. Results The luciferase activity of miR-497-5p mimics and IKCa1-wt co-transfection group was lower than that of the other three groups of the first part (allP<0.05), and no significant difference among other three groups ( allP>0.05), which confirmed that miR-497-5p and IKCa1 3 '-URT had specific binding sites. The expression of IKCa1 mRNA and protein of the miR-497-5p mimics transfection group was lower than that of the other two groups of the second part (allP<0.05), and there was no significant difference between the other two groups (allP>0.05). The proliferation ability of the miR-497-5p mimics transfection group was lower than that of the other two groups at 24, 48, 72 and 96 h of culture (allP<0.05), and there was no significant difference between the other two groups (allP>0.05). Conclusion miR-497-5p can inhibit the proliferation of cervical cancer HeLa cells by negatively regulating the expression of IKCa1 gene.

cevical carcinoma; micro RNA-497-5p; intermediate-conductance-Ca2+-activated K+channel; IKCa1 gene; HeLa cells; cell proliferation

四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(110373)；四川省瀘州市科技局科研項(xiàng)目(2013LZLY-J30)。

張君(1988-)，女，碩士在讀，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤。E-mail：446358256@qq.com

毛熙光(1965-)，男，碩士，教授，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤。E-mail：mxg6639@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.005

R737.33

A

1002-266X(2017)05-0015-04

2016-11-10)