虹鱒傳染性胰臟壞死病毒的分離鑒定及聚類分析

劉淼,徐黎明,趙景壯,曹永生,劉紅柏,尹家勝,盧彤巖

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

虹鱒傳染性胰臟壞死病毒的分離鑒定及聚類分析

劉淼,徐黎明,趙景壯,曹永生,劉紅柏,尹家勝,盧彤巖

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

為研究傳染性胰臟壞死病毒 (IPNV)感染虹鱒Oncorhynchus mykiss的病理特性,取云南省某養(yǎng)殖場(chǎng)大規(guī)模死亡的虹鱒稚魚進(jìn)行了病原的分離與鑒定,試驗(yàn)中利用鮭鱒魚常見病毒敏感細(xì)胞大鱗大麻哈魚胚胎細(xì)胞 (Chinook salmon embryo cells,CHSE-214)、鯉上皮瘤細(xì)胞 (Epitheliaoma papulosum cyprinid,EPC)和虹鱒性腺細(xì)胞 (Rainbow trout gonad cell line,RTG-2)對(duì)虹鱒稚魚無(wú)菌組織懸液進(jìn)行病毒培養(yǎng),并對(duì)產(chǎn)生細(xì)胞病變的上清進(jìn)行病毒RNA提取及鮭鱒魚常見病毒的RT-PCR檢測(cè),利用敏感細(xì)胞進(jìn)行病毒分離株的噬斑培養(yǎng)及滴度測(cè)定,并對(duì)病毒形態(tài)進(jìn)行透射電鏡觀察。結(jié)果表明:細(xì)胞培養(yǎng)顯示,該組織懸液能使CHSE-214和RTG-2細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變;RT-PCR結(jié)果顯示,檢測(cè)樣本呈IPNV陽(yáng)性,傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)呈陰性;該IPNV分離株(命名為ChRtm213)在CHSE-214、RTG-2和EPC細(xì)胞上的病毒滴度分別為105.2、103.2、102.3TCID50/mL,在CHSE-214細(xì)胞上培養(yǎng)4 d即可形成肉眼可見的病毒噬斑;在透射電鏡下清晰可見大量病毒粒子呈晶格狀排列于細(xì)胞質(zhì)內(nèi);ChRtm213分離株與西班牙毒株2310 (AY489225)VP2相似度較高,核苷酸序列一致性為96.4%;聚類分析結(jié)果顯示,ChRtm213分離株與參考毒株加拿大Jasper(ATCC:VR-1325)聚為一簇,屬于Gengroup 5基因型。研究表明,ChRtm213分離株異于已報(bào)道的IPNV分離株,具有不同的血清型及病毒毒力,可為傳染性胰臟壞死病毒的檢測(cè)及防控提供參考。

虹鱒;傳染性胰臟壞死病毒 (IPNV);CHSE-214;基因型

傳染性胰臟壞死病毒 (Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)隸屬于雙RNA病毒科Birnaviridae、水生雙 RNA病毒屬Aquabirnavirus[1]。該病毒為二十面體對(duì)稱,無(wú)囊膜,直徑為50～75 nm,核酸為雙鏈RNA[2-3]。由于毒株、宿主和環(huán)境因素的不同,IPNV可造成10%～90%的死亡率[4-5]。傳染性胰腺壞死病 (Infectious pancreatic necrosis,IPN)是鮭鱒魚類最為嚴(yán)重的傳染性疾病之一,該病主要危害虹鱒Onchorhyncus mykiss、美洲紅點(diǎn)鮭 Salvelinus fontinalis、褐鱒 Salmo trutta、大西洋鮭Salmo salar和大麻哈屬Oncorhynchus spp.的魚苗及幼魚[6]。IPN最早發(fā)生在加拿大、美國(guó),后來(lái)擴(kuò)散至歐亞的十余個(gè)國(guó)家[1],于20世紀(jì)80年代末又傳入日本[7]、韓國(guó)[8]和中國(guó)的遼寧、山西、山東、甘肅等地[9-12]。近年來(lái),關(guān)于IPN的報(bào)道主要集中在檢測(cè)方法的建立及病毒特性研究[13-15],而有關(guān)IPN大規(guī)模暴發(fā)的研究報(bào)道較少。

本研究中,以中國(guó)云南省某養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)大規(guī)模(近70%)死亡的虹鱒稚魚 (1.5 g左右)為研究對(duì)象,收集樣本并進(jìn)行常規(guī)病毒檢測(cè),分離出一株IPNV(命名為ChRtm213),并利用滴度測(cè)定、噬斑培養(yǎng)、透射電鏡觀察、基因型分析、血清學(xué)預(yù)測(cè)等方法對(duì)ChRtm213分離株進(jìn)行了生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明,該分離株與中國(guó)已報(bào)道的IPNV毒株具有不同的來(lái)源、病毒滴度和血清型,本研究結(jié)果可為中國(guó)IPNV的全面監(jiān)測(cè)及防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用虹鱒稚魚150尾取自云南省某養(yǎng)殖場(chǎng),大鱗大麻哈魚胚胎細(xì)胞 (Chinook salmon embryo cells,CHSE-214)、鯉上皮瘤細(xì)胞 (Epitheliaoma papulo sum cyprinid,EPC)、虹鱒性腺細(xì)胞(Rainbowtrout gonad cell line,RTG-2)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所魚類病害教研室曾令兵教授惠贈(zèng);MEM培養(yǎng)基購(gòu)自 Hyclone公司;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、0.25%EDTA-Tyrisin購(gòu)自Gibco公司;SV Total RNA Isolation System購(gòu)自Promega公司;PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver 2.0試劑盒、pMD19-T simple載體和DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程技術(shù)有限公司;低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自Lonza公司;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)GenBank收錄的IPNV表面蛋白VP2的基因序列,利用Primer Premier 5.0選取保守序列設(shè)計(jì)引物,上游引物 VP2-F:5′CAAGGCAACCGCAACYTACT 3′,下游引物VP2-R:5′ATKGCAGCTGTGCACCTCAT 3′,目的片段大小為584 bp。傳染性造血器官壞死病毒 (Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)檢測(cè)用引物HL-F/HL-R為黑龍江水產(chǎn)研究所魚病實(shí)驗(yàn)室建立的檢測(cè)方法中設(shè)計(jì)的引物[16]。

1.2.2 病毒的細(xì)胞檢測(cè) 試驗(yàn)中將虹鱒稚魚全魚進(jìn)行勻漿,在12 000 g條件下離心10 mim,上清液經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾膜過濾,按1∶100的最終稀釋度稀釋,取適量接種于生長(zhǎng)單層的CHSE-214、EPC和RTG-2細(xì)胞中,18℃下吸附1 h后棄去孵育液,加入細(xì)胞維持液,在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),利用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞病變情況并拍照。同時(shí),設(shè)立不加入孵育液的細(xì)胞作為對(duì)照組。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80%后,反復(fù)凍融細(xì)胞培養(yǎng)物3次,分裝病毒懸液于冰箱 (-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒的RT-PCR鑒定 吸取上述所得病毒懸液200 μL,按照SV Total RNA Isolation System說(shuō)明書提取病毒基因組RNA。按照一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明書,分別以VP2-F/VP2-R和HL-F/ HL-R為引物進(jìn)行病毒檢測(cè)。RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性1 min,50℃下退火1 min,72℃下延伸50 s,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收,回收產(chǎn)物與pMD19-T simple載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定,將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast分析。

1.2.4 使半數(shù)組織細(xì)胞致死的病毒感染量(TCID50)的測(cè)定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的EPC細(xì)胞,消化后按照2×104cells/100 μL分裝于96孔板中,接種各分離株不同稀釋度的病毒懸液,每個(gè)稀釋度8孔,每孔100 μL,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組,20℃下培養(yǎng),觀察7 d后,利用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.2.5 病毒的噬斑培養(yǎng) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHSE-214細(xì)胞,用0.25%的 EDTA-Tyrisin消化后分裝于6孔板中,當(dāng)細(xì)胞匯合成單層時(shí)備用。將病毒懸液稀釋,按1∶1000、1∶10 000、1∶100 000倍比稀釋成10-3、10-4、10-53個(gè)濃度,分別取1 mL各濃度病毒懸液接種于單層CHSE-214細(xì)胞的6孔板中,18℃下吸附1 h。將濕熱滅菌后的15 g/L低熔點(diǎn)瓊脂糖置于40℃水浴中保存,然后與2×MEM細(xì)胞維持液按照1∶1混勻,棄去病毒懸液,用Hanks液洗滌后,每孔加入2 mL含有低熔點(diǎn)瓊脂糖的細(xì)胞維持液,凝固后于18℃下倒置培養(yǎng),每天觀察噬斑的形成和變化,4 d后每孔中加入含有中性紅 (終濃度為0.06%)的低熔點(diǎn)瓊脂糖細(xì)胞維持液,12 h后進(jìn)行拍照,并挑取合適的噬斑進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.6 電鏡觀察 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHSE-214細(xì)胞,以0.25%EDTA-Tyrisin消化后,于25 cm2小瓶 (Corning)中傳代培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合成單層時(shí),接種1 mL稀釋1000倍的第5代病毒懸液,18℃下吸附1 h,棄去病毒懸液,加入5 mL細(xì)胞維持液,18℃條件下病毒感染48 h后,將細(xì)胞維持液吸出,加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定,取固定好的細(xì)胞培養(yǎng)物制備超薄切片,進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用MegAlign軟件,以VP2基因片段為目標(biāo)基因,對(duì)IPNV-ChRtm213與GenBank收錄的其他國(guó)家IPNV分離株及部分水生雙RNA病毒進(jìn)行VP2核苷酸序列同源性分析。利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。試驗(yàn)所用毒株信息如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

將虹鱒勻漿液接種于 CHSE-214、EPC和RTG-2細(xì)胞后,觀察細(xì)胞病變情況。顯微鏡觀察結(jié)果顯示:48 h時(shí),CHSE-214細(xì)胞出現(xiàn)皺縮變圓、崩解脫落等明顯的細(xì)胞病變,RTG-2細(xì)胞只出現(xiàn)少數(shù)的病變?cè)?且病變?cè)罴?xì)胞形態(tài)異常,而EPC細(xì)胞未出現(xiàn)任何異常;72 h時(shí),CHSE-214細(xì)胞大面積崩解脫落,RTG-2細(xì)胞病變部位擴(kuò)大,只有很少部分細(xì)胞崩解脫落,而EPC細(xì)胞仍然未有任何變化,生長(zhǎng)正常 (圖1)。

表1 試驗(yàn)用病毒分離株信息Tab.1 Information of IPNV isolates used in this study

圖1 虹鱒組織懸液接種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變 (20×)Fig.1 Cytopathic effect of cells inoculated with rainbow trout suspension(20×)

2.2 RT-PCR檢測(cè)

對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果顯示,在IPNV泳道出現(xiàn)符合目的片段大小的特異性條帶(584 bp),而在IHNV對(duì)應(yīng)的泳道上未見任何條帶(圖2)。特異性片段序列與GenBank收錄的多條IPNV VP2序列一致性為 90%,說(shuō)明該病毒為IPNV,命名為ChRtm213。

2.3 病毒TCID50測(cè)定及空斑純化

將ChRtm213接種于生長(zhǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的CHSE-214、EPC和RTG-2細(xì)胞中,利用Reed-Muench法測(cè)定 ChRtm213在不同細(xì)胞系中的TCID50。結(jié)果顯示,ChRtm213在CHSE-214細(xì)胞中具有最高的滴度,為105.2TCID50/mL,在EPC 和RTG上分別為102.3、103.2TCID50/mL。

將病毒懸液按103～105倍進(jìn)行梯度稀釋后接種到CHSE-214細(xì)胞中,2 d后產(chǎn)生肉眼可見噬斑,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),噬斑逐漸增大,4 d后加入中性紅染色,噬斑更加清晰可見,且噬斑數(shù)量與病毒懸液稀釋度呈負(fù)相關(guān) (圖3)。染色12 h后,挑取噬斑進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification by RT-PCR

圖3 IPNV在CHSE-214細(xì)胞中形成的噬斑Fig.3 Plagues caused by IPNV in CHSE-214

2.4 電鏡觀察

將CHSE-214細(xì)胞接種ChRtm213分離株,24 h后,制備超薄切片進(jìn)行電鏡觀察,結(jié)果顯示,在細(xì)胞質(zhì)中觀察到呈晶格狀排列的多面體IPNV病毒粒子,無(wú)囊膜,直徑為50～70 nm(圖4)。

2.5 聚類分析

同源性分析結(jié)果顯示,本研究中 ChRtm213 (KX234591) 分離株與西班牙毒株 2310 (AJ489225)VP2相似度較高,核苷酸序列一致性為96.4%,與美國(guó)毒株OV2(AY026484)VP2相似度較低,核苷酸序列一致性為81.0% (圖5)。聚類分析結(jié)果顯示,ChRtm213分離株與參考毒株加拿大Jasper(ATCC:VR-1325)聚為一簇 (圖6),具有較近的親緣關(guān)系。

圖4 CHSE-214細(xì)胞中IPNV的電鏡觀察Fig.4 Electron microscopy of IPNV in CHSE-214

3 討論

3.1 敏感細(xì)胞系的選擇

IPNV最早流行于歐美等國(guó)家,隨著水產(chǎn)品貿(mào)易的增加,后擴(kuò)散至亞洲多個(gè)國(guó)家。中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)于20世紀(jì)80年代暴發(fā)了IPN病,曾造成流行區(qū)域虹鱒的大規(guī)模死亡。目前,該病毒并未進(jìn)入世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 (OIE)要求上報(bào)的疫病名錄中。中國(guó)對(duì)IPNV病毒的研究資料較少,主要集中在病毒檢測(cè)方法的建立及疫苗的初步構(gòu)建上。病毒細(xì)胞敏感性分析顯示,ChRtm213分離株可在CHSE-214 和RTG-2細(xì)胞上增殖,并產(chǎn)生典型細(xì)胞病變,但CHSE-214比RTG-2細(xì)胞具有更好的敏感性,主要表現(xiàn)為出現(xiàn)細(xì)胞病變所需時(shí)間短及病毒滴度高。ChRtm213分離株在EPC細(xì)胞上的滴度最低 (102.3TCID50/mL),當(dāng)病毒含量較低時(shí),無(wú)法利用EPC細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),該結(jié)論與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17]相一致。因此,CHSE-214是檢測(cè)IPNV的最適細(xì)胞系,透射電鏡觀察表明,接種了IPNV的CHSE-214細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在大量晶格狀排列的IPNV病毒粒子,進(jìn)一步說(shuō)明CHSE-214細(xì)胞對(duì)IPNV病毒具有較好的敏感性,是IPNV病毒體外增殖的首選細(xì)胞。

3.2 分離毒株的血清型分析

IPNV病毒含有10個(gè)血清型,其中A組血清型包含A1(West Buxton,WB)、A2(Spajarup,Sp)、A3(Abild,Ab)、A4(Hecht,He)、A5(Tellina, Te)、A6(Canada 1,C1)、A7(Canada 2,C2)、A8(Canada 3,C3)和A9(Jasper,JaATCC),B組含有B1(Tellinavirus,TV-1)。根據(jù)IPNV的多聚蛋白氨基酸序列,可將 IPNV分為6個(gè)基因簇(Genogroup 1～6),其中Genogroup 1對(duì)應(yīng)血清型為A3,Genogroup 2為A5和A6,Genogroup 3為A2,Genogroup 4為A7和A8,Genogroup 5為A1 和A9,Genogroup 6為 A4[18]。本研究中,利用IPNV主要表面蛋白VP2氨基酸序列對(duì)ChRtm213分離株進(jìn)行基因型分析,結(jié)果顯示,ChRtm213與美國(guó)的VR299(A1)、西班牙的2310(A1)和加拿大Jasper(A9)同屬于Genogroup 5基因型。根據(jù)文獻(xiàn)推導(dǎo)可知,中國(guó)ChRtm213分離株的血清型為A1或A9;同源性分析結(jié)果顯示,中國(guó)ChRtm213分離株與A1血清型的VR299和2310分離株VP2具有更高的相似度,但ChRtm213分離株血清型的確定有待進(jìn)一步驗(yàn)證;此外,由于在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中未檢索到中國(guó)IPNV分離株的基因序列信息,因此,在同源性分析過程中,加入了同屬的水生雙RNA病毒日本分離株Y-6 (AB006783)和YTAV-06(AB281673),并進(jìn)行了比較,ChRtm213分離株與水生雙RNA病毒日本分離株VP2相似度相對(duì)較低,核苷酸序列一致性為84.5%左右。前期研究表明,中國(guó)現(xiàn)有IPNV分離株血清型均為A2(SP),病毒滴度均高達(dá)108TCID50/mL,具有很高的致死性[6-9],而本研究中的ChRtm213分離株病毒滴度最高為105TCID50/ mL,但由于未檢索到已報(bào)道的中國(guó)IPNV毒株的任何基因序列,因此,無(wú)法對(duì)國(guó)內(nèi)IPNV分離株間的TCID50及血清型的差異進(jìn)行深入分析。

綜上所述,本研究中分離的ChRtm213不同于中國(guó)現(xiàn)行的其他IPNV分離株,該病株具有不同的血清型及病毒毒力。本研究結(jié)果可為中國(guó)不同地區(qū)的IPNV監(jiān)測(cè)及疫苗研制提供數(shù)據(jù)參考。

圖5 ChRtm213與不同國(guó)家IPNV分離株VP2的同源性分析Fig.5 Homological analysis of VP2 in ChRtm213 with IPNV isolates from different countries

圖6 以VP2基因序列構(gòu)建的ChRtm213分離株進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of ChRtm213 isolate based on gene sequence of VP2

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Isolation,identification and cluster analysis of an infectious pancreatic necrosis virus

LIU Miao,XU Li-ming,ZHAO Jing-zhuang,CAO Yong-sheng, LIU Hong-bai,YIN Jia-sheng,LU Tong-yan

(Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China)

A pathogen of an infectious pancreatic necrosis(IPN)was isolated and cultured in rainbow trout Oncorhynchus mykiss collected from Yunnan Province by chinook salmon embryo cells(CHSE-214),epitheliaoma papulosum cyprinid(EPC)and rainbow trout gonad cell line(RTG-2)inoculated with sterile tissue suspension. The RNA was extracted from cells with cytopathic effect,and identified by RT-PCR assays used for common salmon virus detection.The isolate was further analyzed with plaque assay,virus titer detection,and electron microscopy observation.The cell culture showed that the tissue suspension led to produce typical cytopathic effect(CPE) on CHSE-214 and RTG-2 instead of EPC.The RT-PCR showed that the sample was positive to infectious pancreatic necrosis virus(IPNV)and negative to infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV).The IPNV isolate was named as ChRtm213,with titer of 105.2TCID50/mL on CHSE-214,103.2TCID50/mL on RTG-2 and 102.3TCID50/mL on EPC.ChRtm213 produced plagues in CHSE-214,and plenty of virons in crystalline arrangement was observed in cytoplasm.The ChRtm213 had the maximal homology with Spain IPNV-2310 isolate,with nucleotide identity of 96.4%.The cluster analysis revealed that ChRtm213,in the same cluster with reference strain Canada isolate Jasper(ATCC:VR-1325),belonged to Gengroup 5.A novel IPNV was isolated and identified from Yunnan Province,and the findings provide reference for the monitoring and vaccine development of IPNV in China.

Oncorhynchus mykiss;infectious pancreatic necrosis virus;CHSE-214;gene type

Q785;S917

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.010

2095-1388(2017)01-0056-06

2016-04-13

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (GA13B401);黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (C201462);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) (HSY201514)

劉淼 (1987—),女,碩士。E-mail:446048847@qq.com

盧彤巖 (1976—),女,研究員。E-mail:lutongyan@hotmail.com