響應面法優(yōu)化鱘魚精蛋白的提取工藝

饒丹華,白 嬋,耿勝榮,鄧子浩,徐 晨,熊光權,鉏曉艷,李海藍,季 飛,王寶華,李 新,廖 濤,*

(1.武漢工程大學化學與環(huán)境工程學院,湖北武漢 430073;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所/湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照工程技術研究中心,湖北武漢 430064;3.武漢鱘龍生物科技有限公司,湖北武漢 430015)

響應面法優(yōu)化鱘魚精蛋白的提取工藝

饒丹華1,2,白 嬋2,耿勝榮2,鄧子浩2,徐 晨1,2,熊光權2,鉏曉艷2,李海藍2,季 飛3,王寶華3,李 新2,廖 濤2,*

(1.武漢工程大學化學與環(huán)境工程學院,湖北武漢 430073;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所/
湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照工程技術研究中心,湖北武漢 430064;3.武漢鱘龍生物科技有限公司,湖北武漢 430015)

以鱘魚-甲骨板的精巢組織為原料,從中提取魚精蛋白粗品,建立硫酸提取分離魚精蛋白的最優(yōu)工藝。以蛋白得率為指標,通過單因素實驗研究硫酸濃度、液料比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)的影響大小,初步確定魚精蛋白的最佳分離條件。進一步利用響應面軟件Box-Behnken設計模型確定鱘魚精蛋白的最佳提取工藝條件,結果表明:硫酸濃度0.83 mol/L,液料比6.2∶1 mL/g,提取時間0.5 h,提取溫度35 ℃,提取次數(shù)4次。經(jīng)驗證,最優(yōu)工藝條件下魚精蛋白的得率平均達到11.28%,且純度高達86.13%,分子量約為10 ku,有良好的抑菌活性,金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑達15.75 mm。

魚精蛋白,響應面,提取,鱘魚

魚精蛋白是一類以精氨酸為主的多聚陽離子堿性蛋白肽,常存在于魚類精巢組織細胞核中與DNA結合構成核精蛋白。魚精蛋白不僅具有促使細胞繁殖發(fā)育的作用,而且具有阻礙血液凝固、助呼吸、促消化、增強腎功能和抑制腫瘤生長繁殖等多種功能[1-2]。尤其是具有強烈的抑菌活性,可作為化學防腐劑的替代品在食品中使用[3-4],因此受到廣泛關注。

對魚精蛋白的研究,多以硫酸提取[5-7]為主要提取方法,近年也有超聲波輔助提取[8]的方法。國外多側重于海水魚類的研究如鮭科魚[9]、鯡科魚[10],而我國這類海魚資源較缺乏,淡水魚資源豐富,淡水魚副產(chǎn)物精巢原料充足。但到目前為止,國內(nèi)魚精蛋白的研究中淡水魚來源仍范圍較窄,并且得率仍舊較低。如利用硫酸溶液輔助超聲波提取的方法,上官新晨[8]最多得到5.23%的魚精蛋白。若簡化工藝不輔以超聲提取,劉燕妮[11]得到鮭魚和鯉魚魚精蛋白得率分別為2.32%和4.46%,黃占旺[12]最多得到5.23%的鯉魚精蛋白,劉紅玉[7]得到7.38%的大馬哈魚精蛋白。

淡水鱘魚產(chǎn)業(yè)近年發(fā)展迅速,鱘魚向來以高營養(yǎng)價值著稱,蛋白質含量高,8種必需氨基酸評分均超過WHO推薦的成人氨基酸需要量模式[13]。鱘魚-甲骨板是達氏鰉和史氏鱘的雜交品系,由于其生長快,抗病力強,已在湖北省乃至全國廣泛人工養(yǎng)殖。且鱘魚全身脂肪含量低,甲骨板精巢組織較大[14],以鱘魚-甲骨板為原料提取魚精蛋白具有更高蛋白提取率和更強的抑菌特性的可能性。鑒于超聲波輔助提取需20 min[8],與直接酸提所需時間相差不大,并考慮實際工藝越簡化越易操作且成本越低,因此本實驗采用硫酸提取對制備工藝及魚精蛋白抑菌性能進行研究,一方面為選取優(yōu)勢原料來源、提取高得率魚精蛋白提供了理論基礎,一方面也提高了鱘魚加工副產(chǎn)物的附加價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱘魚-甲骨板精巢組織 武漢鱘龍生物科技有限公司;濃硫酸、95%乙醇、丙酮、乙醚、磷酸 均為國藥集團，分析純;考馬斯亮藍G250 國藥集團;金黃色葡萄球菌 中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

T18 ULTRA-TURRAX高速勻漿機 德國IKA;ME303E分析天平 METTLER TOLEDO;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 武漢科爾儀器設備有限公司;GL-25MS高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;UH5300紫外可見分光光度計 HITACHI;生物安全柜 Heal Force;LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海中安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝 參照黃占旺[12]等人的研究方法并稍作修改,將冰凍的魚白(即魚精巢組織)取出解凍,去除脂肪、結締組織、上皮組織等雜質。稱取10 g除雜處理的魚白切碎成漿狀,置于100 mL離心管中,加入100 mL 0.14 mol/L NaCl溶液,均質勻漿1 min,于0 ℃中攪拌20 min,靜置10 min,4000 r/min低溫(0 ℃)離心分離10 min,棄去上清液。

在沉淀物中按一定量加入一定濃度的硫酸溶液在一定溫度下提取一定時間,4000 r/min低溫(0 ℃)離心10 min,上清液過濾;離心后的沉淀再重復操作一定次數(shù)。

將濾液合并,用三倍體積的95%冷乙醇沉淀,沉淀用丙酮洗滌兩次,乙醚洗滌一次,再冷凍干燥,得魚精蛋白粗品。以產(chǎn)品的得率為測定指標,進行比較實驗。重復實驗3次,取平均值。

1.2.2 魚精蛋白得率的測定 蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍G250染色法[15]。

魚精蛋白得率(%)=蛋白含量/鱘魚精巢總重×100

1.2.3 單因素實驗 硫酸濃度∶固定硫酸與原料的液料比為3∶1 mL/g,0 ℃提取1 h,提取次數(shù)1次,硫酸濃度分別設為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mol/L,比較不同硫酸濃度下的魚精蛋白得率。

液料比:固定硫酸濃度為0.8 mol/L,0 ℃提取1 h,提取次數(shù)1次,液料比分別設為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1 mL/g,比較不同液料比下的魚精蛋白得率。

提取時間:固定硫酸濃度為0.8 mol/L,液料比為6∶1 mL/g,0 ℃提取,提取次數(shù)1次,提取時間分別設為0.25、0.5、1、1.5、2 h,比較不同提取時間下的魚精蛋白得率。

提取溫度:固定硫酸濃度為0.8 mol/L,液料比為6∶1 mL/g,提取時間0.5 h,提取1次,提取溫度分別設為0、15、25、35、45、55、65 ℃,比較不同提取溫度下的魚精蛋白得率。

提取次數(shù):固定硫酸濃度為0.8 mol/L,液料比為6∶1 mL/g,35 ℃水浴提取,提取時間0.5 h,提取次數(shù)分別設為1、2、3、4、5、6次,比較不同提取次數(shù)下的魚精蛋白得率。

1.2.4 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上,利用軟件Design-Expert V8.0.6中的Box-Behnken Design設計原理,選取對魚精蛋白得率影響較為顯著的硫酸濃度、液料比、提取次數(shù)作為考察因素,設計3因素3水平響應面實驗[16-18],因素水平編碼見表1,以魚精蛋白得率為響應面的評價指標,進一步優(yōu)化提取工藝。

表1 Box-Behnken設計的因素編碼和水平Table 1 Codes and levels of test factors in Box-Behnken

1.2.5 魚精蛋白的鑒定 通過坂口反應[19]鑒定。將蛋白粉用適量蒸餾水復溶,取0.5 mL依次加入10% NaOH 5滴、0.2%α-萘酚1滴、次氯酸鈉溶液1滴,觀察是否顯紅色。

將蛋白粉溶解液進行SDS-PAGE電泳分析。聚丙烯酰胺凝膠電泳[20-21]條件為分離膠濃度15%,濃縮膠濃度4%。

1.2.6 抑菌實驗 將1 g魚精蛋白粉加入10 mL滅菌水中溶解制成10-1g/mL濃度,在室溫下浸泡6 mm濾紙片1 h。將金黃色葡萄球菌菌種活化,且在37 ℃下擴大培養(yǎng)24 h。將第二代擴大培養(yǎng)液稀釋10倍進行涂布,印上濾紙片正置20 min后于37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h后進行觀察,此外設置滅菌水浸泡濾紙印在相同金黃色葡萄球菌涂布平板上作為對照組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件處理作圖,響應面實驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert V8.0.6軟件處理分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 硫酸濃度對魚精蛋白得率的影響 硫酸濃度對魚精蛋白得率的影響見圖1。較低硫酸濃度范圍內(nèi),魚精蛋白提取的不完全,得率受硫酸濃度影響較大,隨其上升迅速提高;當濃度達到0.6 mol/L,蛋白的提取接近飽和,得率增加的幅度變得平緩;濃度增大到0.8 mol/L的峰值后只會隨濃度增大而降低,此時高濃度的硫酸會破壞蛋白結構,降低魚精蛋白含量導致得率下降。故而最優(yōu)硫酸濃度值為0.8 mol/L。

圖1 硫酸濃度對魚精蛋白得率的影響Fig.1 Effect of H2SO4 concentration on the yield of protamine

2.1.2 液料比對魚精蛋白得率的影響 液料比對魚精蛋白得率的影響如圖2。液料比由2∶1 mL/g增大到8∶1 mL/g,魚精蛋白得率呈先升高后降低變化趨勢,在6∶1 mL/g時得率達到最佳值9.24%,是2∶1 mL/g時平均得率的2.56倍,增長速度接近1 mL/g提高1.41%,得率提升顯著,6∶1 mL/g增到8∶1 mL/g,得率僅降低0.65%,減小趨勢較緩。硫酸溶液用量過小,魚精蛋白溶解不完全,用量過大,操作精細度降低,提取步驟轉換容器時的蛋白損失增大,不利于蛋白得率的提高。故使得蛋白得率最大化的最佳液料比為6∶1 mL/g。

圖2 液料比對魚精蛋白得率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on the yield of protamine

2.1.3 提取時間對魚精蛋白得率的影響 提取時間對魚精蛋白得率的影響見圖3。提取時間在0.5 h內(nèi),魚精蛋白與周圍組織中的油脂、不溶性雜蛋白等物質緩慢分離并不斷溶解于稀酸溶液,此時提取還不充分,因此得率隨時間延長而有增加趨勢。稀硫酸既可以增大堿性魚精蛋白溶解度,另一方面酸度也影響蛋白穩(wěn)定性[22],會造成蛋白得率損失。隨著蛋白的不斷溶解與酸液接觸面增大,并且水浴會導致繼續(xù)散失水分,溶液中的硫酸濃度增大,魚精蛋白的損失會逐漸增多,綜合來看0.5 h時魚精蛋白溶解量與損失量差值達到最大化,得率較高,提取較為充分。整體而言,酸提時間對蛋白得率的影響較弱,變化不大,提取時間為0.5 h為最佳。

圖3 提取時間對魚精蛋白得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of protamine

2.1.4 提取溫度對魚精蛋白得率的影響 提取溫度對魚精蛋白得率的影響見圖4。水浴溫度對蛋白得率產(chǎn)生一定影響。溫度過高、過低都會降低魚精蛋白的提取得率。適當提高溫度會促進蛋白分子伸展,增大蛋白與水的相互融合,提高溶解效率,但過高后蛋白分子內(nèi)部非極性疏水基團暴露,可降低蛋白溶解性[23]。魚精蛋白在35 ℃時得率最高,為9.44%,提取溫度從0 ℃升至35 ℃期間魚精蛋白得率增長較緩慢,達到35 ℃后隨溫度升高得率急劇下降,65 ℃即降至8.47%。并且溫度在65 ℃以下得到的蛋白均為正常白色,大于65 ℃得到的蛋白開始偏黃色,且水溶性不好[24]。綜合考慮,提取最佳溫度為35 ℃。

圖4 提取溫度對魚精蛋白得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of protamine

2.1.5 提取次數(shù)對魚精蛋白得率的影響 提取次數(shù)對魚精蛋白得率的影響見圖5。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA analysis of regression model

注:**表示差異極顯著(p<0.01);*表示差異顯著(p<0.05)。

提取4次以內(nèi),蛋白得率隨重復次數(shù)增加顯著上升,在第4次魚精蛋白得率達到最高值11.12%,提取4次以上蛋白得率出現(xiàn)小幅度損失而降至10.4%左右。殘渣中可提魚精蛋白在第4次基本被提取完全,繼續(xù)重復提取只會增加操作過程中的損失,降低魚精蛋白得率。因此,提取次數(shù)最佳為4次。

圖5 提取次數(shù)對魚精蛋白得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on yield of protamine

2.2 響應面實驗

響應面實驗結果如表2所示。

表2 響應面設計方案及結果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

軟件得到的魚精蛋白得率(Y)關于硫酸濃度(A)、液料比(B)和提取次數(shù)(C)的模型回歸方程為:

Y=-67.2673+35.13582A+16.64113B+5.91139C-0.73038AB+0.48406AC-0.33975BC-19.7701A2-1.17884B2-0.48751C2

2.2.1 預測模型的顯著性檢驗 為了檢驗方程的有效性,對上述預測模型進行方差分析,結果如表3所示。

由表3分析結果模型p為0.0016<0.01,可知魚精蛋白得率的回歸方程模型極顯著,并且模型R2=0.9406,與實際擬合度>90%,模型預測值能較好反映實際值。失擬項的p為0.3631>0.05,失擬不顯著,該模型具有統(tǒng)計學意義,回歸方程可以比較準確的預測出魚精蛋白的最優(yōu)提取工藝條件,且預測值能夠較好地與實際值吻合。

液料比(B)p=0.0037<0.01,達到極顯著水平;提取次數(shù)(C)的p=0.0272<0.05,屬于差異顯著項;硫酸濃度(A)p=0.1462,對響應值沒有顯著性影響。此外,硫酸濃度平方項(A2)和液料比平方項(B2)均為對得率影響極顯著,提取次數(shù)平方項(C2)的影響稍小,但也是顯著影響因子。結合表3中F值大小,各因素影響魚精蛋白得率的主次順序是液料比>提取次數(shù)>硫酸濃度。

2.2.2響應面曲面分析 圖6～圖8是根據(jù)二次多項回歸模型作出的各因素交互項的響應面圖。

圖6 液料比和硫酸濃度對魚精蛋白得率的影響Fig.6 Effects of the liquid to material ratio on the extraction rate of protamine

圖7 液料比和提取次數(shù)對魚精蛋白得率的影響Fig.7 Effects of liquid to material ratio and extraction times on the extraction rate of protamine

圖8 硫酸濃度和提取次數(shù)對魚精蛋白得率的影響Fig.8 Effects of the concentration of H2SO4and extraction times on the extraction rate of protamine

圖6曲面模型中,固定提取次數(shù)4次時,硫酸濃度和液料比的改變都使得響應值呈倒U型變化趨勢。液料比的改變引起的響應面坡度改變比較大,尤其小于6 mL/g時坡度較陡峭,而硫酸濃度的變化所引起的響應面坡度變化相對平緩,表明液料比對蛋白得率的影響大于硫酸濃度。由圖7可知,當硫酸濃度(0.8 mol/L)不變時,重復提取次數(shù)越多,蛋白得率先是以較快的速度增大,在4次時達到峰值,隨后再多次提取得率不再增加。液料比改變的曲面坡度比提取次數(shù)大,表明液料比對蛋白得率的影響大于提取次數(shù)。圖8中,液料比固定6 mL/g時,硫酸濃度和提取次數(shù)的改變均引起模型曲面坡度的平緩變化,坡度差異不明顯,兩者對得率的影響相差不大。根據(jù)表3中BC、AB、AC的p值均在0.1以上,說明兩兩因素之間交互作用不顯著。

2.2.3 魚精蛋白最優(yōu)提取工藝確定及驗證 通過軟件處理得到的最優(yōu)條件是:硫酸濃度0.83 mol/L,液料比6.18∶1 mL/g,提取次數(shù)4.32次,此條件下蛋白得率理論值達到11.45%。結合實際調整最優(yōu)提取工藝,確定為硫酸濃度0.83 mol/L,液料比6.2∶1 mL/g,提取次數(shù)4次。按照此工藝條件進行提取驗證實驗,平行3次,結果實際最優(yōu)工藝條件下魚精蛋白得率平均值為11.28%,與理論值11.4532%接近,相對誤差為1.55%,證明回歸模型比較穩(wěn)定。

本實驗魚精蛋白得率經(jīng)優(yōu)化后遠高于劉紅玉[7]的大馬哈魚精蛋白得率(7.38%)。原因與多方面因素有關,提取物種來源、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)等不同都會影響蛋白得率的高低。本實驗中鱘魚-甲骨板本身脂質等雜質較少,精蛋白含量高,更容易被提取,且液料比對魚精蛋白得率影響最顯著,本實驗采用6.2∶1 mL/g的液料比,高于劉紅玉的3.5 mL/g,同時本實驗提取次數(shù)更多,提取更充分,提取溫度較0 ℃更高,加快了魚精蛋白的溶解過程,因此得率較高。

2.3 魚精蛋白鑒定

魚精蛋白主要含有大量精氨酸,坂口反應是精氨酸的特征鑒定反應,實驗提取到的魚精蛋白坂口反應顯明顯紅色,精氨酸含量豐富。粗提產(chǎn)物蛋白經(jīng)考馬斯亮藍染色比色法測定,蛋白純度達到86.13%,蛋白含量較高。

進一步的電泳結果見圖9,15%的分離膠和4%濃縮膠濃度對產(chǎn)物蛋白電泳效果較好,三條a和兩條b泳道樣品上樣量不同不影響定性分析,可視為平行組。提取蛋白的電泳條帶均集中在小分子量區(qū)域,約為10 ku,是理想的小分子魚精蛋白產(chǎn)物。胡曉璐[24]從柔魚中分離純化得到的精蛋白分子量為11.0和13.5 ku,上官新晨[8]從鯉魚中得到的精蛋白分子量為15.3 ku,均與本實驗結果相接近,說明提取蛋白分子組成與文獻魚精蛋白差異較小。此外雜蛋白通常分子量較大,往往產(chǎn)生多個條帶,而結果顯示蛋白條帶較為單一,說明雜質蛋白存在極少。

綜上,上述工藝粗提產(chǎn)物中魚精蛋白得率較高、純度較好。

圖9 鱘魚魚精蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.9 SDS-PAGE electrophoretogram of sturgeon protamine

2.4 魚精蛋白抑菌實驗

圖10(a)為在無菌水中浸泡瀝干的濾紙片印在金黃色葡萄球菌涂布平板的效果圖,作為空白對照,圖10(b)為0.1 g/mL魚精蛋白溶液中浸泡瀝干的濾紙片印在金黃色葡萄球菌涂布平板的效果圖,作為實驗組。對照組濾紙片周圍沒有抑菌圈出現(xiàn),而實驗組靠近濾紙片處沒有菌落生長,遠離濾紙片區(qū)域菌落生長正常,有明顯的抑菌圈,平均直徑達15.75 mm。魚精蛋白由于分子量小滲透到菌體內(nèi)部與脫氫酶等重要代謝酶結合,阻礙代謝而最終導致菌類自溶死亡,因而具有天然抗菌性[8]。王陸玲[25]使用本實驗百分之一濃度(1‰)的魚精蛋白即得到10 mm抑菌圈,劉燕妮[11]使用0.01 g/mL的鮭魚精蛋白得到9.5 mm抑菌圈。根據(jù)上官新晨[8]、胡曉璐[23]的研究,魚精蛋白抑菌性受pH、金屬離子濃度、酶等影響較大,本實驗所提取魚精蛋白抑菌性能稍弱于王陸玲的實驗性結果，類似于劉燕妮的實驗性結果,均與這些因素的差異有緊密關系?？傮w上,所提取的魚精蛋白抑菌活性良好。

圖10 鱘魚魚精蛋白抑菌實驗Fig.10 Antibacterial experiment of sturgeon protamine

3 結論

在單因素實驗基礎上用響應面回歸模型優(yōu)化鱘魚魚精蛋白提取,得到最佳工藝條件為:硫酸濃度0.83 mol/L,液料比6.2∶1 mL/g,35 ℃水浴提取4次,每次0.5 h,魚精蛋白實際得率最佳可達11.28%。影響魚精蛋白得率的因素中按照影響大小排序依次為:液料比>提取次數(shù)>硫酸濃度。

粗提產(chǎn)物坂口反應明顯,魚精蛋白含量較高,達到86.13%。SDS-PAGE電泳條帶單一,無明顯雜質條帶,最優(yōu)工藝下從鱘魚提取精蛋白不僅得率高,純度也較高。同時,用金黃色葡萄球菌測試的結果表明,鱘魚精蛋白抑菌圈明顯,0.1 g/mL濃度抑菌圈直徑達15.75 mm,抑菌活性良好。本研究為活性魚精蛋白高效制備提供了良好來源和工藝途徑。

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Optimization of extraction process of sturgeon sperm proteinby response surface methodology

RAO Dan-hua1,2,BAI Chan2,GENG Sheng-rong2,DENG Zi-hao2,XU Chen1，2,XIONG Guang-quan2,ZU Xiao-yan2,LI Hai-lan2,JI Fei3,WANG Bao-hua3,LI Xin2,LIAO Tao2,*

(1.College of Chemistry and Environmental Engineering,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430073,China;2.Institute of Agro-Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Hubei Engineering Research Center for Farm Products Irradiation,Wuhan 430064,China;3.Wuhan Xunlong Biological Technology Co.,Ltd.,Wuhan 430015,China)

The extraction and separation of protamine from sturgeon by H2SO4was studied and the optimal extraction process was set up. Taking the protein yield as the main indicator,the optimal separating conditions were initial determined on the basis of single factor tests on the influence of the concentration and amount of H2SO4,extraction temperature,extraction duration and extraction times. The best extraction conditions were finally confirmed with the Box-Behnken design in Design-Expert software:the concentration of H2SO4was 0.83 mol/L while the amount was 6.2∶1 times volume,the extraction temperature was better at 35 ℃ and extracting 0.5 h for 4 times was recommended. It proved that the mean yield of protamine was 11.28% under the optimal extraction conditions. Moreover,the extracted protamine has been shown to have not only high purity of 86.13% and low molecular weight of 10 ku but also good antibacterial activity against staphylococcus aureus with the inhibition zone diameter of 15.75 mm.

protamine;response surface;extraction;sturgeon

2016-08-16

饒丹華(1990-)，女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品加工與安全方面的研究，E-mail：672629882@qq.com。

*通訊作者:廖濤(1979-)，男，博士，副研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工與安全研究，E-mail：17418431@qq.com。

湖北省農(nóng)科院青年科學基金項目(2016NKYJJ28)；湖北省重大科技創(chuàng)新計劃項目(2015ABA038)；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項目(2016-620-000-001-036)。

TS254

B

:1002-0306(2017)04-0272-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.043