PCR快速檢測在細(xì)菌質(zhì)控考核盲樣鑒定中的應(yīng)用

王煒　江曉　金萍

【摘要】 目的：對多重PCR和熒光PCR兩種核酸檢測方法在多項目質(zhì)控樣本中的檢測應(yīng)用進(jìn)行初步評價。方法：同時采用三種方法對多項目盲樣質(zhì)控樣本進(jìn)行檢測，包括多重PCR、熒光PCR及傳統(tǒng)的國標(biāo)方法。結(jié)果：食源性致病菌盲樣（W-B11）中采用多重PCR、熒光PCR均檢出金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌核酸陽性，培養(yǎng)法同步分離并鑒定為金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌，三種方法檢測結(jié)果一致。結(jié)論：PCR法結(jié)合培養(yǎng)法對于多項目質(zhì)控樣本中病原菌快速初篩分離具有重要意義，可減少傳統(tǒng)培養(yǎng)法漏檢的可能性，提高檢測效率。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)菌盲樣； 聚合酶鏈反應(yīng)； 多項目質(zhì)控考核

【Abstract】 Objective：To evaluate multi-PCR and real-time PCR methods on detection of multi-blind quality control projects.Method：Multi-PCR，real-time PCR and traditional international standard method were used in the blind quality control projects at the same time.Result：Multi-PCR and real-time PCR methods detected W-B11 positive of Staplylcoccus aureus nucleic acid and Bacillus cereus nucleic acid by both.The culture method was isolated and identified as Staphylococcus aureus and Bacillus cereus.The results of the three methods were consistent.Conclusion：The PCR method combined with cultivation method for pathogenic bacteria in the multi projects quality control sample rapid screening has important significance in separation，can reduce the possibility of missing in the traditional training method， improve the detection efficiency.

【Key words】 Bacteria blindness samples； PCR； Multi-blind quality control projects

First-authors address：Nanjing Municipal Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.012

食源性致病菌是危害食品安全和人類健康的主要因素，對食源性致病菌的檢測是食品衛(wèi)生安全檢測中一個重要的部分[1-3]。常見的食源性致病菌不僅包括食品中常見的金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、蠟樣芽孢菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血弧菌等致病性弧菌、變形桿菌屬、空腸彎曲菌、阪崎腸桿菌，還應(yīng)當(dāng)包含常見的致瀉性大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[4-6]。在細(xì)菌盲樣檢測的質(zhì)控考核中，面臨同時檢測多種細(xì)菌、以免遺漏的問題[7-10]。目前在實際檢驗工作中常用于檢測和鑒定食源性致病菌的方法主要還是分離培養(yǎng)、生化鑒定的方法，本研究中，筆者同時應(yīng)用多重PCR、熒光PCR、傳統(tǒng)分離培養(yǎng)3種方法對江蘇省疾病預(yù)防控制中心下發(fā)的食源性致病菌盲樣進(jìn)行檢測，現(xiàn)將檢測過程報告如下。

1 材料與方法

1.1 盲樣來源 江蘇省疾病預(yù)防控制中心下發(fā)的食源性致病菌盲樣W-B11，西林瓶中真空粉末狀樣品。無菌打開西林瓶，立即（1 min內(nèi)）加入3 mL稀釋液（無菌生理鹽水）進(jìn)行溶解，待溶解后吸出放入無菌瓶中，反復(fù)用稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，稀釋液合計50 mL，5瓶總共稀釋至250 mL，回收清洗液放入同一無菌瓶中，此溶液是待檢樣品。

1.2 培養(yǎng)基 3%氯化鈉堿性蛋白胨水、mEC肉湯、Bolton肉湯、TTB增菌液、SC增菌液、志賀氏菌增菌肉湯、7.5%氯化鈉肉湯、改良磷酸鹽緩沖液、mLST-Vm、HE瓊脂、改良CCD瓊脂平板、改良Y培養(yǎng)基、CIN-1培養(yǎng)基、凍干兔血漿、克氏雙糖、營養(yǎng)瓊脂、TSA平板、Skirrow平板來源于北京陸橋公司；沙門氏菌顯色平板、副溶血性弧菌顯色平板、O157顯色平板、阪崎腸桿菌顯色平板來源于法國科瑪嘉；LB1增菌液、LB2增菌液、Baird-Parker瓊脂平板、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂平板、血平板、蠟樣芽孢桿菌生化鑒定盒來源于廣東環(huán)凱公司。

1.3 核酸提取試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒來源于天根生化科技（北京）有限公司。

1.4 熒光PCR試劑 沙門氏菌/志賀氏菌核酸檢測試劑盒、副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒、空腸彎曲菌核酸檢測試劑盒、金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒、李斯特氏菌核酸檢測試劑盒、阪崎腸桿菌核酸檢測試劑盒、蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒、五種致瀉性大腸桿菌核酸檢測試劑盒、大腸桿菌O157核酸檢測試劑盒來源于碩世生物科技有限公司。

1.5 MOKOPOWER 10種食源性致病菌核酸多重檢測試劑盒（PCR-毛細(xì)管電泳法）和11種致瀉細(xì)菌核酸多重檢測試劑盒（PCR-毛細(xì)管電泳法）來源于南京美寧康誠生物科技有限公司。10種食源性致病菌核酸多重檢測試劑盒由M0101-A、M0101-B兩種PCR反應(yīng)體系構(gòu)成，可用于檢測金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲桿菌、大腸埃希氏菌O157和變形桿菌。11種致瀉細(xì)菌核酸多重檢測試劑盒由M0201-A、M0201-B兩種PCR反應(yīng)體系構(gòu)成，可用于檢測11種常見的腸道致病菌，包括霍亂弧菌O1、霍亂弧菌O139、沙門氏菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、副溶血弧菌、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、大腸桿菌O157、腸產(chǎn)毒素大腸桿菌（ETEC）和腸黏附性大腸桿菌（EAEC）。

1.6 培養(yǎng)方法 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗GB4789.4-2010、志賀氏菌檢驗GB4789.5-2012、副溶血性弧菌檢驗GB4789.7-2013、金黃色葡萄球菌檢驗GB4789.10-2010、單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗GB4789.30-2010、阪崎腸桿菌檢驗GB4789.40-2010、空腸彎曲菌檢驗 GB4789.9-2014、蠟樣芽孢桿菌檢驗GB4789.14-2014；中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗GB/T4789.8-2008、大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗GB/T4789.36-2008[11-20]。

1.7 核酸提取及熒光PCR檢測 待檢樣品取3 mL按試劑盒說明書操作，提取細(xì)菌基因組DNA。依據(jù)熒光PCR試劑盒說明書分別配制反應(yīng)液分裝于反應(yīng)管（20 μL/管），分別加入處理好的待測樣本核酸、空白對照、陽性對照各5 μL，終體積25 μL/管。PCR擴(kuò)增檢測：將反應(yīng)管用API7500熒光定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測（循環(huán)參數(shù)設(shè)定依據(jù)說明書進(jìn)行設(shè)置），依據(jù)試劑盒說明書判定結(jié)果。

1.8 多重PCR檢測 依據(jù)試劑盒說明書操作，體系分裝后分別取待檢核酸樣本5 μL加入到20 μL PCR反應(yīng)液中，按說明書設(shè)置循環(huán)操作，PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的QIACEL全自動毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果 在檢測依據(jù)規(guī)定的時間范圍內(nèi)觀察結(jié)果，HE平板無可疑菌落生長；O157顯色平板，僅見少許藍(lán)綠色圓形光滑菌落；沙門氏菌顯色平板無菌落生長；阪崎腸桿菌顯色平板有少許淺藍(lán)色圓形光滑菌落，轉(zhuǎn)種TSA平板上無黃色可疑菌落；副溶血性弧菌顯色平板無菌落生長；Baird-Parker瓊脂平板見黑色圓形菌落，外層有一透明圈的可疑菌落；李斯特氏菌顯色平板有三種菌落生長，分別是淺藍(lán)色較小圓形菌落無暈圈、白色圓形光滑菌落、金黃色圓形菌落，無可疑菌落；MYP平板微粉紅色周圍有淡粉紅色沉淀環(huán)可疑菌落，及淺黃色圓形菌落；志賀氏菌顯色平板無可疑菌落生長；Skirrow和CCD瓊脂平板均未見可疑菌落；改良Y、CIN-1平板均未見可疑菌落。

挑取Baird-Parker瓊脂平板上黑色圓形外層有一透明圈可疑單菌落做革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄球狀，在血平板上為金黃色圓形，光滑，濕潤，周圍可見透明溶血圈，BHI肉湯做血漿凝固酶試驗為陽性，樣品中檢出金黃色葡萄球菌。

MYP平板上微粉紅色周圍有淡粉紅色沉淀環(huán)可疑單個菌落在血平板上為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有透明溶血環(huán)，根狀生長試驗為陰性，動力陽性，同時做進(jìn)一步生化鑒定，見表1。經(jīng)30 ℃培養(yǎng)24 h并于室溫放置3 d的硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物做蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗，鏡下僅見游離芽孢，未見深紅色菱形蛋白質(zhì)結(jié)晶體，排除蘇云金芽胞菌。綜合生化結(jié)果及蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗結(jié)果，樣品中檢出蠟樣芽胞桿菌。

2.2 熒光PCR結(jié)果 待檢樣品的金黃色葡萄球菌核酸和蠟樣芽胞桿菌核酸陽性，其他菌核酸檢測結(jié)果均為陰性，具體CT值見表2。

2.3 多重PCR檢測結(jié)果 10種食源性致病菌（金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲桿菌、大腸埃希氏菌O157和變形桿菌）核酸多重檢測結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌核酸陽性，其他菌核酸陰性（圖1 M0101-A、M0101-B）。11種致瀉細(xì)菌（霍亂弧菌O1、霍亂弧菌O139、沙門氏菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、副溶血弧菌、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、大腸桿菌O157、腸產(chǎn)毒素大腸桿菌（ETEC）和腸黏附性大腸桿菌（EAEC））核酸多重檢測結(jié)果均為陰性（圖1 M0201-A、M0201-B）。

3 討論

核酸檢測法的突出特點是快速、靈敏度高，其主要包括普通PCR、實時熒光定量PCR、基因芯片、核酸測序等。普通PCR方法一般需要對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，檢測步驟多、時間長，且只能從定性的角度進(jìn)行分析，靈敏度也不夠。基因芯片的方法基于核酸雜交的原理，通量高、分析速度快，但芯片制作以及后續(xù)雜交檢測都有較高的儀器設(shè)備要求，且對樣本的濃度要求比較高，一般也很難達(dá)到比較高的靈敏度。核酸測序的方法是物種定位最為精確的方法，但對儀器和人員的要求都很高，需要在專業(yè)實驗室進(jìn)行。相比之下，實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR或FQ-PCR）技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢。該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實現(xiàn)其定量功能，為樣品中靶標(biāo)序列或基因片段的精確定量提供了一種簡單而又方便的方法，是目前國際公認(rèn)的病原微生物診斷最有效技術(shù)之一[21-24]。

本室已采用Real-time PCR技術(shù)應(yīng)用于食源性致病菌初篩檢測[25-26]，但目前市場上利用TaqMan技術(shù)開發(fā)的病原微生物檢測試劑盒多是針對單個病原體的特異檢測，對于臨床樣本來說，在樣品病原體未知的情況下，經(jīng)常需要采用多種試劑盒同時進(jìn)行檢測，影響了檢測的效率。多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)通過對樣本中可能存在的最常見的幾種病原體進(jìn)行同時檢測，在優(yōu)化好的適合多重擴(kuò)增的體系中加入擬檢測的病原體特異引物，實現(xiàn)一次性檢測多個病原體，提高檢測效率。毛細(xì)管電泳儀為多重PCR的發(fā)展提供了分辨PCR產(chǎn)物的良好手段，分辨率達(dá)3～5 bp，無需配膠、制膠，無需手工上樣、人工拍照，多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)結(jié)合毛細(xì)管電泳儀是今后微生物實驗室檢測多重病原的一個發(fā)展方向。在MOKOPOWER系統(tǒng)中，由于引物對較多，引物二聚體不能完全避免，但均小于100 bp，而PCR產(chǎn)物大小均都在150 bp以上，因此可以明確區(qū)分。本文中，筆者對質(zhì)控樣品同時以多重PCR、熒光PCR、傳統(tǒng)分離培養(yǎng)3種方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果一致。應(yīng)用多重PCR和熒光PCR可在數(shù)小時內(nèi)得出初篩結(jié)果，為培養(yǎng)結(jié)果指明方向。PCR快速診斷對大型活動安全保障、食品安全、傳染病突發(fā)事件的初篩具有重要意義，將其應(yīng)用于多項目質(zhì)控樣本的檢測中，可以減少傳統(tǒng)培養(yǎng)方法漏檢的可能性，提高檢測效率。

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（收稿日期：2016-11-22） （本文編輯：周亞杰）