金霉素生物合成基因ctcK的研究

林龍鎮(zhèn)+萬云鳳+洪文榮

摘要為檢測ctcK基因的功能，利用基因工程技術在金色鏈霉菌J13（Streptomyces aureofaciens J13）上構建ctcK基因缺失工程菌SK12（ΔctcK），并分析了其次級代謝產物的變化.經質譜分析顯示，工程菌SK12代謝物中檢測到去甲基金霉素m/z=465.10 [M+H]+的分子離子峰，但未檢測到金霉素m/z=479.12 [M+H]+的分子離子峰，這與出發(fā)菌J13代謝物的檢測結果相反.結果表明，ctcK基因的失活阻斷了金霉素的生物合成代謝流，使工程菌SK12主要積累去甲基金霉素，顯示ctcK基因參與金霉素C6位甲基化.本研究初步闡明了ctcK基因的功能，同時獲得了一株主產去甲基金霉素的工程菌.

關鍵詞ctcK基因；去甲基金霉素；甲基化；生物合成；金色鏈霉菌

中圖分類號Q935文獻標識碼A文章編號10002537（2017）01003707

金霉素（CTC）是一類臨床上主要用于治療革蘭氏陽性球菌，特別是葡萄球菌（Staphylococcus）、肺炎球菌（Streptococus pneumoniae）的四環(huán)類廣譜抗生素.除了抗生和抗炎功效之外[13]，自20世紀80年代以來，科學家還陸續(xù)發(fā)現金霉素具有抗腫瘤活性[4]、非抗菌作用[5]及非抗感染用途[6].去甲基金霉素（DMCTC），亦屬于四環(huán)類抗生素，與金霉素相比在C6位少了一個甲基.去甲基金霉素不僅對革蘭氏陽性和陰性菌有抑菌活性，對衣原體（Chlamydia）、立克次體（Rickettsia）、肺炎支原體（Mycoplasma pneumonia）等致病性病毒亦有很好的抑制效果.與金霉素相比，去甲基金霉素不僅抗菌活力更強、結構更穩(wěn)定、還因具有易被人體吸收、排泄快、長效性和高效性等優(yōu)點而被廣泛應用.此外，它還是合成米諾環(huán)素和替加環(huán)素的重要母體[7].

金霉素生物合成途徑和生物合成基因的相關研究不多[810].2013年，鄧子新團隊報道了金霉素生物合成基因簇并確定了鹵化酶基因，同時還推測ctcK基因可能是金霉素C6位甲基化酶基因，但至今仍未經生物學實驗證明（GenBank：HM627755）[11].基于本實驗室已建立的大腸桿菌（Escherichia coli）與金色鏈霉菌接合轉移體系[1213]，本研究采用基因框內敲除方法，特異性滅活ctcK基因，分析ctcK基因失活突變株代謝產物的變化，旨在闡明ctcK基因在金霉素pretetramid到6methylpretetramid生物轉化中的作用，進而驗證ctcK基因是否為金霉素C6位甲基化酶基因.研究結果可間接獲得主產去甲基金霉素的工程菌，為開發(fā)去甲基金霉素等系列藥物奠定基礎.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質粒金色鏈霉菌J13，大腸桿菌top10，大腸桿菌ET12567（pUZ8002），大腸桿菌鏈霉菌穿梭質粒pKC1139及pJTU412均為本實驗室保藏；克隆載體pMD19T購自TaKaRa公司.

1.1.2培養(yǎng)基與抗生素金色鏈霉菌斜面培養(yǎng)基及預萌發(fā)培養(yǎng)基見文獻[13]，種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基見文獻[14]；大腸桿菌生長培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基[15].本研究中使用的抗生素及其終濃度分別為：氨芐青霉素 100 mg/L，安普霉素 50 mg/L，氯霉素 25 mg/L，卡那霉素 50 mg/L，萘啶酮酸 25 mg/L.

1.1.3主要試劑限制性內切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；溶菌酶，RNase A酶，Proteinase K和DNA凝膠回收試劑盒均購自上海生工公司；其他常規(guī)試劑見文獻[16].

1.2方法

1.2.1引物設計以金霉素生物合成基因簇（GenBank：HM627755）為模板，設計兩對引物K1/K2和K3/K4，分別用于擴增ctcK基因上游交換臂KB1和下游交換臂KB2；再根據同源重組原理，設計兩對篩選單交換和雙交換的鑒定引物K5/K6和K7/K8；引物序列及其限制酶見表1.

1.2.2分子克隆PCR、酶切、酶連、大腸桿菌感受態(tài)細胞制備及其轉化、小量質粒DNA提取，方法參見實驗手冊[17]；金色鏈霉菌染色體DNA提取參見鏈霉菌遺傳操作手冊[16]；DNA測序委托上海生工公司.

1.2.3單交換突變株篩選將重組質粒轉化大腸桿菌ET12567（pUZ8002），再通過接合轉移方法將其導入金色鏈霉菌J13. 35 ℃培養(yǎng)16～20 h后，覆蓋30 mg/L安普霉素和25 mg/L萘啶酮酸，繼續(xù)在35 ℃培養(yǎng)，4 d后長出接合子.挑取其中一株命名為金色鏈霉菌SK11，簡稱SK11，提取其基因組DNA作為模板，進行PCR驗證.接合轉移具體方法見文獻[14].

1.2.4雙交換突變株篩選將單交換工程菌在斜面培養(yǎng)基上松弛培養(yǎng)5代，然后分離單菌落，將單菌落影印至含安普霉素的抗性平板和不含抗生素的普通平板上.培養(yǎng)5 d后，從887株菌中篩選得到1株安普霉素敏感菌株，命名為金色鏈霉菌SK12，簡稱SK12，提取其基因組DNA，進行PCR驗證.

1.2.5發(fā)酵及代謝產物組分檢測對菌株進行分離純化，獲得長勢較好的單菌落，轉接斜面35 ℃培養(yǎng)5～7 d，待斜面孢子豐滿.刮取適量的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，32 ℃，280 r/min振蕩培養(yǎng)18～22 h，使菌體處于對數生長期.再按照10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，29 ℃，265 r/min，發(fā)酵72 h.放瓶后，將發(fā)酵液用草酸酸化至pH 1.2～1.5，并于4 ℃靜置30 min，以釋放效價.再依次加入0.1%～0.2%的黃血鹽及0.1%～0.2%的硫酸鋅，不斷攪拌10 min，以除去蛋白.然后4 ℃，12 000 r/min，離心5 min，取上清，經甲醇稀釋5倍，過0.22 μm濾膜，所得樣品直接用于高效液相色譜分析.樣品經甲醇稀釋至適當濃度，再過0.22 μm濾膜，用于質譜分析.

1.2.6高效液相色譜條件及質譜方法液相色譜條件：采用島津液相色譜儀LC20A和SinoChrom ODSBP色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）進行分析；流動相中V（甲醇）∶V（10 mol/L甲酸）=20∶80；流速：1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長360 nm；進樣量：10 μL.

質譜掃描條件：采用Exactive Plus高分辨質譜儀和電噴霧離子化源（ESI源）進行測定；極性檢出模式：正模式（MS+）；毛細管電壓：3 800 V；干燥氣：N2；流速：6 L/min；干燥氣溫度：320 ℃；檢測方式：一級全掃描.

2結果與分析

2.1CtcK蛋白序列基本性質分析

通過生物信息學軟件Vector.NTI 11.5查找已公布的金霉素生物合成基因簇（GenBank： HM627755）并將ctcK基因序列翻譯成CtcK蛋白氨基酸序列.使用瑞士生物信息中心引擎（http：//web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl）及蛋白質二級結構在線分析軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析此蛋白氨基酸的親疏水性和跨膜區(qū)，可知CtcK蛋白以疏水性氨基酸為主，且CtcK蛋白不具有跨膜區(qū)，蛋白全部在膜外.

2.2CtcK蛋白三維結構及功能分析

將CtcK蛋白氨基酸序列通過SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，經Rasmol軟件進行顯示和分析，結果如圖1（彩圖見封三）.該蛋白含有兩條肽鏈，二級結構以α螺旋為主.再經蛋白保守結構域在線分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）表明CtcK中76 aa～317 aa組成SAM依賴型甲基轉移酶結構域.因此推測ctcK基因可能是負責催化金霉素C6位甲基化酶的基因.

2.3重組質粒pJTK2的構建

以J13的染色體DNA為模板，用兩對引物K1/K2和K3/K4分別擴增上游交換臂KB1（2 033 bp）和下游交換臂KB2（2 051 bp）.PCR樣品經電泳檢測后，回收目標條帶并進行TA克隆，得到中間質粒pTK1和pTK2.質粒pTK1和pTK2分別經XbaⅠ/EcoRⅤ和EcoRⅤ/EcoRⅠ雙酶切后，回收KB1和KB2片段；質粒pJTU412經XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切，回收7 879 bp的片段并與KB1和KB2片段進行酶連，構建質粒pJTK1；最后，用EcoR Ⅰ對質粒pJTK1和puc30apr分別進行單酶切，分別回收11 951 bp和1 168 bp的片段，再次酶連，經篩選得到最終質粒pJTK2（pJTU412∶∶KB1∶∶KB2∶∶apr），其酶切驗證見圖2B.該質粒以Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ雙酶切，得到5 234，3 766，2 978和1 141 bp四條帶；用EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ雙酶切，得到7 879，4 072，1 141和27 bp四條帶；用EcoR Ⅴ/Hind Ⅲ雙酶切，得到9 289，2 855和975 bp三條帶；pJTK2經以上3種方式酶切，電泳條帶大小均與理論預測一致，克隆系列經測序與預測吻合.由此，重組質粒pJTK2構建完畢.

2.4金色鏈霉菌SK12重組菌株的構建

接合轉移得到的突變株SK11，用引物K5/K6擴增到1 559 bp和2 300 bp片段，PCR產物電泳檢測結果與理論預測大小一致，初步確定為單交換菌株，電泳結果見圖3B泳道2.

影印篩選得到的突變株SK12，用引物K5/K6和K7/K8分別擴增到1 559 bp和2 454 bp片段，與親株相比均缺失了741 bp片段，〖JP3〗電泳結果見圖3B泳道3和6.經測序分析，證明SK12確實為ctcK基因框內缺失工程菌.

2.5工程菌SK12的菌落形態(tài)及代謝產物分析

ctcK基因缺失工程菌SK12的基內菌絲體為棕紅色，而親株J13為棕黃色.除此之外，工程菌SK12與親株J13的孢子顏色均為棕灰色，且生長周期相同，這與程惠芳所報道的去甲基金霉素突變株的菌落形態(tài)相符[18].繼續(xù)用傳代方法將SK12傳5代后，其菌落形態(tài)依舊保持穩(wěn)定.將SK12和J13按1.2.5方法進行發(fā)酵及代謝產物組分分析，經高效液相色譜檢測，結果如圖4.J13樣品（圖4，c）與金霉素標準品（圖4，a）主峰保留時間基本相近，分別為31.193 min和32.184 min，因此認為31.193 min的峰為金霉素峰.SK12樣品（圖4，d）與去甲基金霉素標準品（圖4，b）主峰保留時間也基本相近，分別為20.260 min和19.712 min，因此認為20.260 min的峰為去甲基金霉素峰.據此可知，與親株J13（圖4，c）相比，工程菌SK12（圖4，d）不再合成金〖HJ1.75mm〗霉素，而主產去甲基金霉素，說明ctcK基因的缺失阻斷了金霉素的合成，使金霉素合成代謝積累在去甲基金霉素，顯示ctcK基因參與C6位甲基化.

由于金霉素及去甲基金霉素含有氯原子，因此有典型的[A+2]同位素峰，且[A]∶[A+2]≈3∶1.而四環(huán)素不含氯原子，所以沒有[A+2]同位素峰.質譜檢測結果顯示，出發(fā)菌J13代謝產物中檢測到金霉素m/z=479.12 [M+H]+的準分子離子峰及其[A+2]的同位素峰m/z=481.12 [M+H]+，且兩者豐度比約為3∶1，與理論相符，檢測結果見圖5.此外，J13代謝產物中還檢測到四環(huán)素的準分子離子峰m/z=445.16 [M+H]+，但未檢測到去甲基金霉素的離子峰，這可能是由于去甲基金霉素相對含量較低，因此未能檢測出來.另外，質譜圖中的離子峰m/z=146.08 [M+H]+，m/z=161.09 [M+H]+，m/z=282.28 [M+H]+，m/z=338.34 [M+H]+，m/z=381.08 [M+H]+，m/z=527.16 [M+H]+可能是碎片峰或雜質峰，因為在金霉素生物合成途徑中均沒有相應質量數的中間代謝產物.與親株J13相反，工程菌SK12代謝產物中檢測到了去甲基金霉素m/z=465.10 [M+H]+的準分子離子峰及其[A+2]的同位素峰m/z=467.10 [M+H]+，但未檢測到金霉素和四環(huán)素的離子峰.質譜結果進一步說明ctcK基因的缺失阻斷了金霉素的合成，使金霉素合成代謝積累在去甲基金霉素，初步闡明了ctcK基因負責參與催化C6位甲基化.此外，SK12代謝產物中檢測到m/z=365.10 [M+H]+（6Pretetramid）的離子峰，但未檢測到m/z=351 [M+H]+（Pretetramid）的離子峰，這可能是因為ctcK基因的缺失不能完全阻斷Pretetramid到6Pretetramid 的代謝流.當然，也有可能是因為m/z=365.10 [M+H]+不是6Pretetramid的離子峰，而是碎片峰或雜質峰.

2.6ctcK基因回補實驗

以金色鏈霉菌J13的基因組DNA為模板，通過K1/K4引物PCR擴增KB3片段（4 811 bp），將其克隆到pMD19T載體，得到陽性克隆子，提取其質粒，并命名為質粒pKB11.質粒pKB11和質粒pKC1139分別用XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切，再經回收、酶連、轉化、篩選陽性克隆子，獲得ctcK基因回補同源重組質粒pKB12（pKC1139∶∶KB3），其酶切驗證見圖6B.將pKB12轉入ET12567（pUZ8002），并通過接合轉移方法將其導入工程菌SK12中，篩選獲得一株pKB12質粒整合到SK12染色體上的重組菌株，命名為金色鏈霉菌SK13.由于該重組菌株存在同源片段，容易發(fā)生二次重組.因此可通過影印篩選獲得ctcK基因回復突變株SK14（簡稱SK14），PCR電泳檢測結果見圖7B.將SK14按照1.2.5中的方法進行搖瓶發(fā)酵并用高效液相色譜對其代謝產物進行分析.結果表明，SK14（圖8，b）重新主產金霉素，與親株J13（圖8，a）相比沒有明顯差異，進而再次證明ctcK基因是負責參與催化C6位甲基化的基因.

3結論與討論

四環(huán)類抗生素生物合成過程中，C6甲基化酶基因一直是研究熱點，但至今仍未完全闡明.2007年，Zhang等將龜裂鏈霉菌（Streptomyces rimosus）oxyF基因進行異源表達，證實了OxyF為土霉素C6位甲基化酶，負責pretetramid 到6methylpretetramid的生物轉化過程，且表明OxyF對pretetramid底物具有高度特異性[19].本研究在此基礎上，通過序列比對發(fā)現ctcK基因與oxyF基因序列同源性高達74.4%，且經生物信息學分析再次發(fā)現CtcK蛋白中亦存在SAM依賴型甲基轉移酶結構域，因此推測ctcK基因可能參與金霉素C6位甲基化.據此，本研究利用基因敲除技術滅活ctcK基因，獲得ctcK基因失活突變菌SK12（ΔctcK）.經HPLC及MS分析顯示，工程菌SK12不再合成金霉素，主要積累去甲基金霉素，與出發(fā)菌J13主要積累金霉素明顯不同，說明ctcK基因的失活阻斷了金霉素的生物合成代謝流，使工程菌積累去甲基金霉素，初步闡明了ctcK基因參與C6位甲基化.此外，ctcK基因的缺失并沒有使代謝積累pretetramid，而是繼續(xù)合成去甲基金霉素，這可能是由于后續(xù)的下游修飾酶對底物的特異性要求不高，使得pretetramid可以進行后續(xù)的一系列氧化、鹵化、轉氨及氨二甲基化等修飾作用，最終合成去甲基金霉素.

通過基因回補實驗，將ctcK基因重新導入工程菌SK12（ΔctcK）中，獲得回復突變株SK14，其代謝產物主要積累金霉素，與出發(fā)菌J13相同.這與Ryan等將ctc09基因（與ctcK基因序列同源性高達99.4%）克隆至pLP212281表達載體，并導入產6去甲基四環(huán)素的金色鏈霉菌A377中，得到突變株主產四環(huán)素的研究結果相符[9].這兩個研究結果不僅表明ctcK基因可能是金霉素C6位甲基化酶基因，還顯示CtcK可以催化四環(huán)類抗生素pretetramid到6methylpretetramid的甲基化反應，催化途徑如圖9.然而，基因功能的最終確定還須對該基因進行體外表達等一系列研究工作.

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