HIV—1型Nef基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

李苗苗+楊霄旭+楊朝霞+向雙林+韓梅

摘要為了構(gòu)建艾滋病毒HIV1型Nef基因重組表達(dá)載體，利用PCR從pNL43質(zhì)粒上擴(kuò)增 HIV1型Nef基因，獲得Nef基因完整的編碼區(qū)，構(gòu)建可表達(dá)Nef蛋白的 pEBmycnef重組表達(dá)載體.經(jīng)鑒定正確后，利用 LipofectamineTM 2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè) Nef蛋白的瞬時(shí)表達(dá).為了建立穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞系，采用G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的方法，篩選出單克隆細(xì)胞系.擴(kuò)大培養(yǎng)克隆細(xì)胞后，通過(guò)RTPCR和Western Blot分別檢測(cè)Nef的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平，經(jīng)長(zhǎng)達(dá)60 d的傳代，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞系，為研究RNAi在艾滋病治療方面的應(yīng)用提供了細(xì)胞模型.

關(guān)鍵詞Nef基因；SW480細(xì)胞；G418；穩(wěn)定細(xì)胞系

艾滋?。ˋIDS）全稱(chēng)為“獲得性免疫缺陷綜合征”，是一種由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的，以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病.RNA干擾（RNAi）是細(xì)胞內(nèi)序列特異性抑制靶基因表達(dá)的機(jī)制，具有高效性、特異性和副作用小的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于抗HIV1 治療研究是近來(lái)研究熱點(diǎn)[12].RNAi抑制HIV1的復(fù)制，最直接的方法就是利用RNAi方法直接干擾HIV1病毒的RNA，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道幾乎HIVl的所有基因都可作為干擾的靶點(diǎn)：如LTR[3]〖KG-*6〗，gag[45]〖KG-*6〗，pol[6]〖KG-*6〗，vpu[7]〖KG-*6〗，vif[5]〖KG-*6〗，tat[8]和env[9]等基因.RNAi還可以將干擾的位點(diǎn)靶定到細(xì)胞上與HIV病毒感染密切相關(guān)的受體蛋白、輔助受體蛋白或其他的一些細(xì)胞因子[10].

負(fù)調(diào)控因子（negative factor，Nef） 是人免疫缺陷病毒（ HIV） 附屬蛋白之一，相對(duì)分子質(zhì)量小，柔韌性大，核心結(jié)構(gòu)呈球形.Nef 不具酶活性，具有銜接蛋白的作用，可下調(diào) CD4，主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（MHCⅠ），主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHC Ⅱ）和 CD28 分子，在對(duì)抗宿主免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用.Nef 可增強(qiáng)病毒的復(fù)制和感染性，抑制 HIV 感染細(xì)胞的凋亡，在 HIV 致病機(jī)制方面也發(fā)揮關(guān)鍵作用.基于Nef在體內(nèi)的致病機(jī)制，多種抗HIV1病毒策略被提出，使Nef成為潛在的HIV1靶點(diǎn).本文試圖構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HIV1型Nef蛋白的SW480細(xì)胞系，為研究RNAi在艾滋病治療方面的應(yīng)用提供細(xì)胞模型.

1材料和方法

1.1材料

大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)菌、pEBMultineomyc質(zhì)粒、pNL43質(zhì)粒、SW480細(xì)胞（人結(jié)腸癌細(xì)胞）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；RNA提取試劑TRIzol和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司； Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ與NotⅠ購(gòu)自ThermoFisher公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和去內(nèi)毒試劑購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；G418購(gòu)自Sigma公司；小鼠源Antimyc抗體、內(nèi)參蛋白actin抗體和HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG均購(gòu)自Santa Cruz公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；其他常規(guī)試劑與耗材均購(gòu)自于上海生工生物科技有限公司.

1.2引物設(shè)計(jì)合成

參照pNL43質(zhì)粒上HIV1型Nef基因序列，利用Primer Premier 5 以及Nebcutter 2.0軟件設(shè)計(jì)的引物如下：Nef正向引物，5′CGCGGATCCGGGTGGCAAGTGGGTC3′；Nef反向引物，5′ATTTGCGGCCGCTCAGCAGCTCTTGAAGTAC 3′.分別在上游引物和下游引物5′端加上了BamHⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基，引物由上海生工生物有限公司合成.

1.3HIV1型Nef片段的擴(kuò)增

以pNL43質(zhì)粒為模板，使用Ex Taq DNA聚合酶，采用PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)HIV1型Nef基因編碼區(qū)，全長(zhǎng)640 bp.PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 g/L pNL43質(zhì)粒 1 μL，正向引物和反向引物（10 nmol/L）各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 14.5 μL.PCR 的擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min.得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，根據(jù)片段大小用DNA純化試劑盒進(jìn)行切膠回收.

1.4HIV1型Nef真核表達(dá)載體構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物和pEBMultineomyc質(zhì)粒分別用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后， 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)，卡那霉素LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA測(cè)序鑒定.

1.5重組表達(dá)載體的瞬時(shí)表達(dá)及Western Blot檢測(cè)

SW480細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清和100×青霉素鏈霉素雙抗混合液的DMEM培養(yǎng)液中，在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，接種量為2×106個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)使其密度達(dá)80%～90%.參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，將8 μg pEBmycnef重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載體pEBMultineomyc質(zhì)粒的SW480細(xì)胞為對(duì)照，48 h后收集細(xì)胞.冰上收獲細(xì)胞，經(jīng)裂解后離心取上清，加入上樣緩沖液和DTT煮沸10 min.用10%SDSPAGE膠分離細(xì)胞蛋白，上樣20 μg.110 V恒壓80 min轉(zhuǎn)至PVDF膜上.將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用含5%的脫脂奶粉過(guò)夜封閉.再孵育小鼠抗myc的抗體，充分洗膜，隨后孵育HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，充分洗膜.然后各取1 mL ECL化學(xué)發(fā)光試劑A和B液混勻，5 min后平鋪于膜的蛋白面，〖HJ2.1mm〗通過(guò)顯影儀（Tonon公司）顯影拍照.

1.6SW480細(xì)胞G418最低致死濃度的測(cè)定

將SW480細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng).待細(xì)胞密度達(dá)到80%后，使用不同濃度G418（0，100， 200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L）的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每天更換培養(yǎng)基，連續(xù)觀察12 d，確定全部細(xì)胞死亡的最低濃度，即為最佳的G418篩選濃度.

1.7穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞株的篩選和鑒定

SW480細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)16 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至匯合度達(dá)80%時(shí)，將0.8 μg pEBmycnef質(zhì)粒在20μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞.48 h后將細(xì)胞1∶10稀釋轉(zhuǎn)種24孔板，同時(shí)加入終濃度為900 mg/L的G418，同時(shí)設(shè)pEBMultineomyc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照.2～3 d換液1次，待大部分細(xì)胞死亡之后，改用450 mg/L G418的培養(yǎng)液維持壓力篩選3周，挑出單個(gè)細(xì)胞集落，有限稀釋到96孔板進(jìn)行單克隆篩選，篩選出的單克隆細(xì)胞依次于48孔、12孔、6孔板及6 cm和10 cm培養(yǎng)皿擴(kuò)大培養(yǎng).擴(kuò)大培養(yǎng)到一定量后，進(jìn)行冷凍保存.剩余的一些細(xì)胞連續(xù)傳代60 d以上（約30代），取一部分細(xì)胞進(jìn)行Nef的RTPCR檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)，確保細(xì)胞株的穩(wěn)定性.

2結(jié)果

2.1HIV1 Nef基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用PCR方法擴(kuò)增Nef基因產(chǎn)物，將20 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)1條約640 bp大小的片段（如圖1），片段大小符合預(yù)期，說(shuō)明已成功擴(kuò)增出HIV1 Nef基因.

2.2真核表達(dá)載體pEBmycNef的鑒定

2.2.1轉(zhuǎn)化菌中Nef基因的PCR鑒定將上述過(guò)夜連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑取4個(gè)克隆擴(kuò)增后，進(jìn)行菌夜PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，瓊脂糖電泳可見(jiàn)一條約為640 bp大小的Nef目的基因條帶，與預(yù)期的條帶大小吻合.

2.2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pEBmycNef的雙酶切鑒定

重組載體pEBmycNef經(jīng)BamH Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切后，瓊脂糖電泳可見(jiàn)一條約為640 bp大小的Nef目的基因條帶，一條為10 223 bp大小的pEBMultineomyc條帶（圖3），說(shuō)明載體構(gòu)建正確.

PCR擴(kuò)增的Nef全長(zhǎng)DNA序列插入pEBMultineomyc載體，測(cè)序結(jié)果與pNL43質(zhì)粒報(bào)道的Nef序列相符，表明Nef全長(zhǎng)編碼區(qū)DNA成功插入到pEBMultineomyc質(zhì)粒中，且插入方向和閱讀框架均正確.

2.3SW480細(xì)胞G418最低致死濃度的測(cè)定

使用G418終濃度分別為0～1 000 mg/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SW480細(xì)胞，觀察細(xì)胞的死亡情況. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加藥后1 d，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯的變化；持續(xù)篩選7 d，大量細(xì)胞開(kāi)始脫落死亡，貼于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞逐漸變圓；至12 d，細(xì)胞全部死亡（圖4）.確定SW480細(xì)胞全部死亡的最低濃度為900 mg/L.

2.4Nef基因在SW480細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pEBmycNef和載體質(zhì)粒pEBMultineomyc分別轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，收集細(xì)胞，裂解后上樣進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示.重組質(zhì)粒pEBmycNef轉(zhuǎn)染細(xì)胞中在約29 000處有特異性條帶，而載體質(zhì)粒pEBMultineomyc轉(zhuǎn)染細(xì)胞中沒(méi)有，表明HIVl Nef基因在SW480細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá).圖中actin蛋白為內(nèi)參蛋白.

2.5穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞系的鑒定

pEBmycNef質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，經(jīng)G418抗性篩選3周后，在顯微鏡下挑選出了4個(gè)細(xì)胞集落，經(jīng)傳代擴(kuò)增后，用Western Blot技術(shù)檢測(cè)到Nef的表達(dá)，而空載對(duì)照SW480細(xì)胞則未檢測(cè)到Nef基因的表達(dá)（圖6），并且在連續(xù)傳代60 d后，通過(guò)RTPCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)，仍可以檢測(cè)到 Nef基因的轉(zhuǎn)錄（圖7）與表達(dá)（圖8）.以上結(jié)果表明，已篩選到穩(wěn)定表達(dá)HIV1型Nef基因的SW480細(xì)胞株.

3討論

RNAi通過(guò)降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)來(lái)沉默基因這種技術(shù)在生物學(xué)研究領(lǐng)域具有極重要的意義，RNAi不僅可以作為基因功能研究與評(píng)價(jià)的方法工具，它還可以作為一種基因治療的手段.2001年Tusehl研究組開(kāi)創(chuàng)了RNAi技術(shù)治療人類(lèi)疾病的新途徑.將RNAi用于病毒性疾病的治療和預(yù)防研究取得了一些顯著的效果，比如乙肝病毒（HBV）[13]、丙肝病毒（HCV）[14]、人乳頭瘤病毒（HPV）[15]、EB病毒[16].將RNAi應(yīng)用于艾滋病治療的文獻(xiàn)也不計(jì)其數(shù)[17]，這些研究都為HIV1的基因治療提供了很好的參考依據(jù).但是RNAi還無(wú)法應(yīng)用于臨床治療艾滋病，阻礙這一進(jìn)程的是RNAi的傳遞模式.

2006年，向雙林等提出利用修改過(guò)的非治病性細(xì)菌在體內(nèi)及體外定向傳遞shRNA到靶細(xì)胞中以發(fā)揮干擾作用.他們將這種依賴(lài)細(xì)菌進(jìn)行的RNAi傳遞技術(shù)稱(chēng)之為T(mén)ransKingdom RNAi （tkRNAi）[18].該研究的最終目的是將這種依賴(lài)細(xì)菌進(jìn)行的RNAi傳遞技術(shù)應(yīng)用到干擾艾滋病病毒的基因研究中，試圖探尋更有效的RNAi傳遞方法，為將RNAi應(yīng)用到臨床上治療艾滋病提供理論依據(jù).由于HIV病毒基因的RNAi干擾實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)無(wú)法進(jìn)行，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)HIV1型病毒蛋白的細(xì)胞模型顯得至關(guān)重要.

本實(shí)驗(yàn)從pNL43質(zhì)粒上擴(kuò)增出Nef基因，隨后與pEBMultineomyc質(zhì)粒共同經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化構(gòu)建成pEBmycnef真核表達(dá)質(zhì)粒.通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證和DNA測(cè)序分析證明nef全長(zhǎng)編碼區(qū)DNA成功插入到pEBMultineomyc質(zhì)粒中，且插入方向和閱讀框架均正確.利用 LipofectamineTM 2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，裂解細(xì)胞，收集蛋白，利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)到 Nef蛋白的瞬時(shí)表達(dá).然后利用G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的方法，首次建立了穩(wěn)定表達(dá)HIV1型Nef基因的SW480細(xì)胞系，為研究tkRNAi在艾滋病治療方面的應(yīng)用提供了細(xì)胞模型.

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