基質(zhì)固相分散萃取-毛細(xì)管電泳測定米制品中丙烯酰胺

殷 斌，吳友誼，周震華，周靖雯

(蘇州科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

基質(zhì)固相分散萃取-毛細(xì)管電泳測定米制品中丙烯酰胺

殷 斌，吳友誼*，周震華，周靖雯

(蘇州科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

建立了基質(zhì)固相分散萃取-毛細(xì)管電泳法檢測米制品中丙烯酰胺的新方法。通過實(shí)驗(yàn)確定了最佳前處理?xiàng)l件：C18及弗羅里硅土混合作為萃取分散劑(質(zhì)量比1∶4)，樣品與分散劑的質(zhì)量比為5∶9，洗脫液為丙酮-二氯甲烷(體積比6∶4)的混合溶劑，洗脫劑體積為10 mL。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，以20 mmol/L硼砂(pH 8.4)作緩沖溶液，在15 kV恒壓下進(jìn)行分離，該方法的線性范圍為10～200 μg/mL，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8，丙烯酰胺的檢出限為0.62 μg/mL，樣品中丙烯酰胺的回收率為85.7%～96.4%。

丙烯酰胺；基質(zhì)固相分散；毛細(xì)管電泳；米制品

丙烯酰胺(Acrylamide)是一種神經(jīng)毒素，威脅食品安全并對人類的健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，可導(dǎo)致細(xì)胞遺傳物質(zhì)DNA的損傷[1]，高劑量的丙烯酰胺還會影響人類的神經(jīng)系統(tǒng)[2]、生殖系統(tǒng)[3]并具有一定的致癌性[4]。食品加熱(包括油炸、烘焙、烹飪、蒸煮)過程往往產(chǎn)生丙烯酰胺，尤其是高溫處理的食品中廣泛存在較高水平的丙烯酰胺[5]，因而加熱食品中丙烯酰胺的分析對食品質(zhì)量管理和保障食品安全具有重要的實(shí)際意義。米制品是我國居民日常生活的主要食物之一，但目前的研究集中于薯?xiàng)l、面包、咖啡等加熱食品，對米制品的研究較少。

目前，加熱食品中丙烯酰胺含量的檢測方法主要有GC-MS和LC-MS(包括LC-MS/MS)[6-13]，此外也有LC[14]，GC[15]和毛細(xì)管電泳(CE)分析丙烯酰胺的報(bào)道[16-18]。GC-MS和LC-MS測定結(jié)果較準(zhǔn)確、檢出限較低、應(yīng)用較廣泛，但儀器昂貴，往往需要衍生處理或加入同位素內(nèi)標(biāo)。LC 方法可不經(jīng)衍生測定丙烯酰胺，操作相對簡單，但流動(dòng)相的消耗較大且有毒。由于丙烯酰胺屬熱不穩(wěn)定化合物，GC測定前需要衍生；而不經(jīng)衍生GC直接測定雖分析時(shí)間較短，但檢出限偏高。毛細(xì)管電泳(CE)是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的分析技術(shù)，具有分離效率高、進(jìn)樣量小、溶劑消耗少、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，在丙烯酰胺檢測中有廣泛的應(yīng)用前景。在樣品分析過程中，良好的樣品前處理方法不僅可以提高檢測的靈敏度、縮短檢測時(shí)間、提高檢測效率，還可以大幅去除雜質(zhì)，降低基體水平。基質(zhì)固相分散(MSPD)萃取技術(shù)整合了傳統(tǒng)樣品前處理技術(shù)中樣品勻化、提取、凈化等過程，集目標(biāo)物提取、凈化和富集為一體，特別適用于處理固態(tài)、半固態(tài)樣品，而目前運(yùn)用基質(zhì)固相分散對米制品進(jìn)行樣品前處理進(jìn)而測定丙烯酰胺的研究尚未見報(bào)道。

本文針對丙烯酰胺現(xiàn)有分析方法中存在分析時(shí)間長、需加入內(nèi)標(biāo)等不足，通過基質(zhì)固相分散萃取對樣品中的丙烯酰胺進(jìn)行富集和凈化，建立了毛細(xì)管電泳檢測丙烯酰胺的新方法并將其應(yīng)用于米類加熱食品的分析檢測，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國貝克曼公司)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司)；固相萃取抽氣系統(tǒng)(美國Supelco公司)；DC12H 型氮吹儀(上海安普科學(xué)儀器公司)；SK-1快速混勻儀、KX-29離心沉淀機(jī)(金壇市科析儀器有限公司)；Master-S純水機(jī)(上海和泰儀器有限公司)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%，阿拉丁公司)；甲醇、乙腈(色譜純，上海安普科學(xué)儀器公司)；丙酮、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷(分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)；鐵氰化鉀(分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠)；HC-C18填料、中性氧化鋁(分析純，450 ℃灼燒4 h)、弗羅里硅土(分析純)購自德國CNW科技公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

儲備液的配制：稱取丙烯酰胺0.020 0 g于100 mL棕色容量瓶中，用水定容密封，-10 ℃下保存待用。各濃度的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)使用液由儲備液加水稀釋而成并經(jīng)過0.22 μm 尼龍濾膜(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)過濾。

準(zhǔn)確稱取3.750 0 g鐵氰化鉀固體于25 mL棕色容量瓶中，用水定容配成Carrez Ⅰ溶液[19]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集及前處理 雪餅、鍋巴、小小酥、長鼻王4種米制品購自校園周邊超市。樣品處理過程參照文獻(xiàn)[20]并加以改進(jìn)：先用研缽將上述樣品磨碎，加入30 mL正己烷搖勻離心，去除上層溶液，置于烘箱中于40 ℃下烘干，待用。準(zhǔn)確稱取3份各0.500 0 g樣品于研缽中，分別加入0.25 mL Carrez Ⅰ溶液，再分別稱取0.180 0 g C18以及0.720 0 g弗羅里硅土分散劑于3個(gè)研缽中，各研磨10 min至分散均勻，待裝柱。加標(biāo)樣品與未加標(biāo)樣品處理步驟相似，只是在“加入0.25 mL Carrez Ⅰ溶液”前需加入100 μL 200 μg/mL丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液并靜置15 min，使標(biāo)液在樣品中更好的分散。

取3支10 mL玻璃注射器，在注射器底部裝少量脫脂棉并壓平，將研磨均勻的樣品分別轉(zhuǎn)移至注射器中，再于上方放少量脫脂棉，用力壓實(shí)。將柱子放于固相萃取裝置上，用洗脫液開始洗脫，洗脫速度控制在1滴/s，收集完洗脫液后，氮吹儀吹干，用0.4 mL水定容，再加入1 mL正己烷，混勻，去除少量的油類物質(zhì)，3 000 r/min下離心10 min，取下層溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液進(jìn)樣，進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。

1.3.2 電泳條件 熔融石英毛細(xì)管(河北銳灃色譜器件有限公司)：內(nèi)徑50 μm，總長度50.3 cm，有效長度39.5 cm。為提高分析的重現(xiàn)性，每天進(jìn)樣前，依次用0.1 mol/L NaOH、水、硼砂緩沖液沖洗毛細(xì)管8，5，6 min，進(jìn)樣間分別用緩沖液沖洗2 min。毛細(xì)管電泳運(yùn)行電壓：15 kV；0.5 psi壓力下進(jìn)樣6 s；檢測波長：210 nm；溫度：25 ℃；緩沖溶液：20 mmol/L pH 8.4硼砂。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

緩沖液的選擇是影響毛細(xì)管電泳分離的主要因素，本文分別考察了硼砂和磷酸鹽對分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)磷酸鹽的電流相對較大，基線不平穩(wěn)，且分離效果欠佳。對于硼砂緩沖液，不同濃度的硼砂影響出峰的時(shí)間，濃度越大遷移時(shí)間越長，當(dāng)采用20 mmol/L硼砂作為緩沖溶液時(shí)，出峰較快且基線平穩(wěn)，因而采用20 mmol/L硼砂作為緩沖溶液。進(jìn)一步考察了硼砂緩沖液pH值的影響，結(jié)果顯示，在8.2～10.2范圍內(nèi)隨著pH值的增加，遷移時(shí)間增長，峰形變寬；當(dāng)硼砂緩沖液的pH值為8.4時(shí)，丙烯酰胺出峰尖銳、無拖尾，且與雜質(zhì)能較好的分離，因此選用pH 8.4的硼砂作為緩沖液。

研究了分離電壓在10～18 kV范圍內(nèi)對各組分遷移時(shí)間的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著電壓的升高，樣品的遷移速度加快，分析時(shí)間縮短，但焦耳熱相應(yīng)增大，基線開始出現(xiàn)漂移，靈敏度降低。綜合考慮分離度、分析時(shí)間等因素，選擇15 kV 作為分離電壓。

在0.5 psi下，研究了進(jìn)樣時(shí)間在2～12 s范圍內(nèi)的影響，結(jié)果表明：隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加，峰高及峰寬均有所增加，當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間超過6 s后，峰高變化較小，但峰展寬增大，本文最終選擇進(jìn)樣時(shí)間為6 s。

考察了柱溫在15，20，25，30 ℃時(shí)對分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)溫度對樣品的分離效果影響較小，但隨著溫度升高，出峰時(shí)間縮短，這是由于隨著溫度升高，緩沖液的粘度有所降低，從而使電滲流增大。但此時(shí)樣品中雜質(zhì)峰與丙烯酰胺峰較接近，因此選擇最佳柱溫為25 ℃。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 分散劑的選擇 選用弗羅里硅土、C18、氧化鋁、活性炭作為備用分散劑，在未確定最佳洗脫劑時(shí)，考慮到丙烯酰胺的極性相對較大，先以8 mL乙腈為洗脫劑進(jìn)行洗脫。按“1.3.1”方法加標(biāo)處理雪餅樣品，每種分散劑對應(yīng)的樣品平行制備3組，確定各分散劑的回收率。對比發(fā)現(xiàn)，弗羅里硅土比C18、氧化鋁及活性炭的吸附效果好，但回收率較低?？紤]到弗羅里硅土的極性與丙烯酰胺的極性可能有所差異，可添加其他分散劑來調(diào)節(jié)極性，通過其他分散劑與弗羅里硅土混合比較發(fā)現(xiàn)，將弗羅里硅土與C18混合后作為分散劑的提取效果相對最好。

2.2.2 分散劑的比例選擇 稱取一定量的雪餅樣品并加標(biāo)，考察相同量，但不同混合比例的C18與弗羅里硅土混合分散劑(1∶9，1∶6，1∶4，1∶3，1∶2)對加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果表明：當(dāng)C18與弗羅里硅土的混合比例為1∶4時(shí)，回收率達(dá)到最大，繼續(xù)增大C18的量，回收率反而降低，因此實(shí)驗(yàn)確定以C18∶弗羅里硅土(1∶4)作為分散劑。此外，由于所選樣品中含有少量蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)易附著在毛細(xì)管內(nèi)壁，從而影響檢測的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)采用加入適量CarrezⅠ溶液以抑制蛋白質(zhì)的干擾。因此，最終以C18∶弗羅里硅土(1∶4)，同時(shí)加入0.25 mL CarrezⅠ溶液為分散劑。

圖1 分散劑對丙烯酰胺回收率的影響Fig.1 Effect of dispersant on recovery of acrylamide

2.2.3 樣品與混合分散劑比例的選擇 按“1.3.1”方法加標(biāo)處理雪餅樣品5份，分別加入0.800 0，0.900 0，1.000 0，1.100 0和1.200 0 g 混合分散劑(C18∶弗羅里硅土=1∶4)，考察了樣品與分散劑比例對提取效果的影響。采用10 mL丙酮∶二氯甲烷(體積比6∶4)混合溶劑洗脫，進(jìn)行基質(zhì)固相提取。結(jié)果表明當(dāng)分散劑的用量增至0.900 0 g時(shí)，回收率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加分散劑的用量回收率反而減小(圖1)。因此采用樣品與分散劑的質(zhì)量比為5∶9。2.2.4 洗脫劑及其用量的選擇 考察了甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯等作為洗脫劑對丙烯酰胺的洗脫能力。按“1.3.1”方法加標(biāo)處理雪餅樣品，稱取1 g C18∶弗羅里硅土混合分散劑(1∶4)，洗脫液用量12 mL，進(jìn)行基質(zhì)固相分散萃取。結(jié)果表明，相比較其他幾種洗脫劑，丙酮對丙烯酰胺的洗脫效果較好，但洗脫出的雜質(zhì)較多，而當(dāng)丙酮與二氯甲烷混合洗脫時(shí)，對基質(zhì)去除效果好，所得電泳圖雜質(zhì)峰少，且回收率有所提高。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)丙酮∶二氯甲烷的體積比為6∶4時(shí)，回收率最高且雜質(zhì)較少，所以實(shí)驗(yàn)最終選用丙酮∶二氯甲烷(6∶4)作為洗脫劑。 繼續(xù)考察了洗脫溶劑體積(6，8，10，12，14 mL)對丙烯酰胺回收率的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)洗脫劑從6 mL增至10 mL時(shí)，洗脫更加充分。繼續(xù)增加洗脫劑時(shí)，丙烯酰胺的回收率幾乎無變化，因此確定混合洗脫劑的體積為10 mL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法靈敏度

在最佳色譜條件下，以200 μg/mL丙烯酰胺儲備液配制濃度分別為10，20，40，80，100，200 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)毛細(xì)管電泳儀測定，以丙烯酰胺所得峰面積(y)對其濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明，在10～200 μg/mL范圍內(nèi)，丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，回歸方程為y=208.4x+207.2，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8。方法的檢出限(S/N=3)為0.62 μg/mL。

圖2 加標(biāo)雪餅樣品(a)以及未加標(biāo)長鼻王、小小酥、鍋巴、雪餅樣品的電泳圖(b～e)Fig.2 Electropherograms of spiked snow biscuit sample(a)，unspiked samples of Proboscis King biscuit(b)，fried cracker(c)，rice crust(d) and snow biscuit(e)

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)及實(shí)際樣品的檢測

在最優(yōu)MSPD和分離條件下，利用所建立的方法測定了雪餅等米制品中的丙烯酰胺含量(圖2)。由圖可見，在優(yōu)化條件下，電泳圖中丙烯酰胺的峰形尖銳對稱，雜質(zhì)峰很少，表明分離效果好、基質(zhì)去除較為徹底。分別在0.500 0 g雪餅樣品中，不加標(biāo)和添加100 μL丙烯酰胺儲備液，制備平行樣各3份，測得雪餅中丙烯酰胺的平均含量為8.39 mg/kg，回收率為85.7%～96.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%。

將該方法用于所購其它樣品(鍋巴、長鼻王、小小酥)中丙烯酰胺含量的測定，分別測得丙烯酰胺含量為27.3，31.9，29.7 mg/kg。

3 結(jié) 論

本文將MSPD前處理技術(shù)與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，建立了一種測定雪餅、鍋巴等米制食品中丙烯酰胺的新方法。結(jié)果表明，MSPD作為前處理方法能夠有效地提取米制品中的丙烯酰胺，具有良好的凈化作用。該方法操作簡便、靈敏度高、凈化效果好、回收率高，適用于米制品中痕量丙烯酰胺的測定。

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Determination of Acrylamide in Rice Product by Matrix Solid Phase Dispersion(MSPD)-Capillary Electrophoresis

YIN Bin，WU You-yi*，ZHOU Zhen-hua，ZHOU Jing-wen

(School of Environmental Science and Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009，China)

A new method coupling matrix solid phase dispersion(MSPD) with capillary electrophoresis was developed for the determination of acrylamide in rice product.The optimized conditions obtained in experiments were as follows：Florisil and C18were used as a mixed dispersant with a mass ratio of 1∶4.The mass ratio of sample to dispersant was 5∶9.The mixture of 10 mL acetone-dichloromethane(6∶4) was used as elution solvent.Under the optimized experimental conditions，20 mmol/L borate solution(pH 8.4) was used as buffer.The sample was separated at a constant voltage of 15 kV.The linear range of acrylamide was in the range of 10-200 μg/mL，with a correlation coefficient(r) of 0.999 8.The limit of detection(LOD，S/N=3) was 0.62 μg/mL for acrylamide and the recoveries were in the range of 85.7%-96.4%.

acrylamide；matrix solid-phase dispersion(MSPD)；capillary electrophoresis；rice product

2016-07-08；

2016-10-13

住建部科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013-K7-24)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.023

O657.8；S852.44

A

1004-4957(2017)02-0280-04

*通訊作者：吳友誼，博士，副教授，研究方向：環(huán)境污染物分析，Tel：0512-68786836，E-mail：youyiwu@sohu.com