組織樣品的直接質(zhì)譜分析及其應(yīng)用

盧海艷，張 華，肖義坡，李 毅，顧海巍，陳煥文

(東華理工大學(xué) 江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013)

專題策劃

組織樣品的直接質(zhì)譜分析及其應(yīng)用

盧海艷，張 華，肖義坡，李 毅，顧海巍，陳煥文*

(東華理工大學(xué) 江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013)

質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快、能提供分子結(jié)構(gòu)信息等特點(diǎn)，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域扮演著重要角色，常用于組織樣品分析。傳統(tǒng)地，組織樣品分析一般需經(jīng)過研磨、萃取、分離等繁雜的預(yù)處理過程，導(dǎo)致耗時(shí)低效，無法滿足大量樣品高通量分析的實(shí)際需求，且不可避免地使組織樣品中的一些活性成分損失。近年來，隨著新型常壓質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，使得組織樣品可在無需樣品預(yù)處理的條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)、非破壞、在線直接質(zhì)譜分析，大大提高了分析效率。該文著重介紹了新型直接質(zhì)譜技術(shù)在組織樣品分析中的應(yīng)用，并簡要展望了該技術(shù)在生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、活體分析等領(lǐng)域的發(fā)展趨勢。

質(zhì)譜技術(shù)；組織樣品；應(yīng)用；綜述

組織樣品是由許多形態(tài)相似的細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)所組成的一個(gè)極其復(fù)雜的有機(jī)體，含有豐富的生物學(xué)信息，是代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。特別是隨著生命科學(xué)的發(fā)展，生物組織樣品從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察、組織成分研究發(fā)展到發(fā)病機(jī)制研究，這就迫切需要發(fā)展原位、實(shí)時(shí)、在線、非破壞、高通量、低損耗的生物組織研究的新方法。質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快、能提供分子結(jié)構(gòu)信息等特點(diǎn)，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域扮演著重要角色，常用于組織樣品分析。但是，傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)包括電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)[1-2]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)[3-6]和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(CE-MS)[7-8]等，一般僅適用于經(jīng)過勻漿、萃取、分離等多步驟精細(xì)處理的分析樣品，導(dǎo)致耗時(shí)低效，無法滿足大量組織樣品高通量分析的實(shí)際需求。在復(fù)雜冗長的組織樣品預(yù)處理過程中，不可避免地使組織樣品中的一些活性成分損失，或者發(fā)生生物降解而導(dǎo)致待測組分變化，使得這些技術(shù)在組織樣品等這類基質(zhì)復(fù)雜樣品中的應(yīng)用受到一定限制。顯然，復(fù)雜樣品預(yù)處理過程已成為制約組織樣品分析的瓶頸。

近年來，隨著復(fù)雜樣品直接電離技術(shù)包括電噴霧解吸電離(DESI)[9]、低溫等離子體探針(LTP)[10-11]、表面解吸常壓化學(xué)電離(DAPCI)[12-14]、實(shí)時(shí)在線分析(DART)[15]、空氣動(dòng)力輔助電離(AFAI)[16]、紙噴霧(Paper spray)[17]及探針電噴霧離子源(PESI)[18-19]等的發(fā)展，使得組織樣品可在無需樣品預(yù)處理的條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)、非破壞、在線直接質(zhì)譜分析，大大提高了分析效率。同時(shí)，使組織樣品中內(nèi)源性化合物如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、藥物分子等從細(xì)胞和亞細(xì)胞水平進(jìn)行鑒定、從空間分布進(jìn)行研究成為可能，極大地拓寬了對(duì)組織樣品所揭示的不同生理過程進(jìn)行深入理解的角度和維度[20]。此外，基于ESI技術(shù)發(fā)展起來的利用生物組織樣品直接產(chǎn)生電噴霧的技術(shù)包括組織噴霧(Tissue spray)[21]、葉噴霧(Leaf spray)[22]、直接離子化(DI)動(dòng)植物組織技術(shù)[23]等，進(jìn)一步為分析組織樣品提供了更為廣闊的手段。

如何在無需樣品預(yù)處理的條件下對(duì)組織樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)、非破壞、在線直接質(zhì)譜分析是提高分析效率的重要問題。本文著重介紹了新型常壓質(zhì)譜技術(shù)在組織樣品分析中的應(yīng)用，并簡要展望了新型常壓質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、活體分析等領(lǐng)域的發(fā)展趨勢及意義。

1 直接質(zhì)譜分析組織表面

近年來，隨著復(fù)雜樣品直接電離質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，使得組織樣品可在無需樣品預(yù)處理的條件下進(jìn)行直接質(zhì)譜分析，大大提高了分析效率。常見的表層解吸電離技術(shù)包括電噴霧解吸電離(DESI)[24]、低溫等離子體探針(LTP)[11,25-26]、表面解吸常壓化學(xué)電離(DAPCI)[12-14]、實(shí)時(shí)在線分析(DART)[15]、空氣動(dòng)力輔助電離(AFAI)[16]、中性解吸電噴霧萃取電離(ND-EESI)[27-29]等，上述技術(shù)可直接快速分析復(fù)雜組織樣品表面的痕量分析物，甚至對(duì)組織樣品表面的某些化學(xué)組分進(jìn)行質(zhì)譜成像分析，包括對(duì)半腦缺血、腫瘤轉(zhuǎn)移等生物模型小鼠的腦、腎、脾等組織的質(zhì)譜成像研究[30-31]。

1.1 電噴霧解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(DESI-MS)

電噴霧解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(DESI-MS)能夠在大氣壓條件下直接對(duì)固體表面的痕量物質(zhì)進(jìn)行解吸電離，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，具有無需復(fù)雜樣品預(yù)處理、化學(xué)特異性、高通量分析等優(yōu)點(diǎn)[9]。自2004年問世以來，已廣泛應(yīng)用于植物組織分析[32]、食品分析[33]、藥物分析[34]、臨床樣品分析[35]、法醫(yī)分析[36]和生物組織的質(zhì)譜成像等領(lǐng)域[36-37]。質(zhì)譜成像(MSI)技術(shù)是結(jié)合質(zhì)譜的離子掃描技術(shù)和成像處理軟件的一種新型成像方法，具有免標(biāo)記、無需復(fù)雜樣品預(yù)處理、空間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)[20,38]。Wiseman等[39]利用DESI-MS技術(shù)檢測完整鼠腦切片中的脂類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該方法可以有效地檢測出神經(jīng)節(jié)苷脂類物質(zhì)(包括GQ1，GT1，GD1和GM1)和硫代鞘糖脂。Masterson等[40]利用DESI-MS成像技術(shù)分析人類精原細(xì)胞瘤及正常組織，并對(duì)照(HE)染色發(fā)現(xiàn)正常睪丸組織中甘油磷酸肌醇(PI)的含量高于精原細(xì)胞瘤組織。此外，利用DESI-MS成像技術(shù)對(duì)人體肝癌組織表面化合物的空間分布分析發(fā)現(xiàn)，癌癥組織中某些磷脂類物質(zhì)的含量高于正常組織，該結(jié)果推動(dòng)了直接質(zhì)譜分析技術(shù)在外科手術(shù)、病理研究中的發(fā)展[9]。DESI-MS技術(shù)除應(yīng)用在人體組織樣品分析外，還常應(yīng)用于植物組織化學(xué)成分的原位檢測，如新鮮毒參、吳茱萸、曼陀羅和顛茄組織表面生物堿的檢測[32,41]，衰老植物組織中葉綠素降解產(chǎn)物的快速鑒別和空間分布分析[42]，蔥屬物種表型區(qū)分和揮發(fā)性硫化物分析[43]等。此外，長春花、番茄、馬鈴薯和香菜等葉子表面特異性化學(xué)成分的直接DESI-MS表征[44]，對(duì)鑒定品種差異、研究植物生長過程受到害蟲或病原體攻擊時(shí)代謝物的變化等具有重要指導(dǎo)意義。

1.2 表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜技術(shù)(DAPCI-MS)

圖1 4種不同工作方式的表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜(DAPCI-MS)的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of four types of desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry(DAPCI-MS)

表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜技術(shù)(DAPCI-MS)是一種對(duì)表面痕量物質(zhì)進(jìn)行直接電離的質(zhì)譜技術(shù)[12-13]，具有比早期的DESI-MS技術(shù)更高的靈敏度。DAPCI-MS技術(shù)的主要特點(diǎn)包括：①靈敏度高，選擇性好，基體耐受性強(qiáng)；②直接分析包括粉末在內(nèi)的各種固體、液體樣品；③易于小型化，適宜與質(zhì)譜、淌度譜等聯(lián)用；④可用空氣或水蒸氣為試劑，對(duì)樣品表面無污染；⑤對(duì)弱極性和非極性物質(zhì)的檢測能力較ESI/DESI高；⑥可直接進(jìn)行質(zhì)譜成像，靈敏度高，準(zhǔn)確度好。4種不同工作形式的DAPCI-MS原理示意圖見圖1。目前，該技術(shù)已應(yīng)用在不同品種茶(如綠茶、烏龍茶和茉莉花茶)[45]和蔬菜表面痕量氨基甲酸酯殘留[46]的高通量分析、豬肉新鮮度評(píng)價(jià)[47]和羊肉真假鑒別[48]，不同產(chǎn)地干海參[14]、硫磺熏蒸八角[49]和樟樹化學(xué)型的判別[50]，土豆泥中痕量可卡因[51]和蘿卜根中芥子堿的檢測[52]，不同地方蜂膠樣品的快速鑒別[53]，臍橙果皮中香氣成分、糖類和黃酮類物質(zhì)等的分析[54]。上述研究不僅證明DAPCI-MS技術(shù)有望為植物組織中活性成分分析和食品品質(zhì)監(jiān)管提供一種技術(shù)支撐，而且進(jìn)一步推動(dòng)了常壓質(zhì)譜技術(shù)在植物學(xué)研究中的應(yīng)用價(jià)值。此外，基于DAPCI離子源改進(jìn)的液體輔助表面解吸常壓化學(xué)電離源(LA-DAPCI)具有較高的離子化效率，適合復(fù)雜基體樣品的質(zhì)譜成像研究[55]。

除上述DESI-MS技術(shù)和DAPCI-MS技術(shù)之外，ND-EESI-MS，LTP-MS，AFAI-MS和DART-MS等技術(shù)也可實(shí)現(xiàn)組織樣品表面分析物的快速分析。例如，Chen等[56]利用ND-EESI-MS技術(shù)分析了無需解凍的冷凍肉類和不同成熟度水果的鑒定等，結(jié)果表明ND-EESI-MS技術(shù)能夠有效地獲取與組織樣品相關(guān)的化學(xué)成分信息，其原理示意圖見圖2。LTP-MS技術(shù)可直接分析水果和蔬菜表面農(nóng)殘[10]，以及烘焙咖啡豆品質(zhì)相關(guān)的化合物[57]；AFAI-MSI技術(shù)可分析化合物的空間分布、追蹤它們在整體組織中的生物轉(zhuǎn)化情況[16]，再帕爾等[58]利用AFAI-MSI技術(shù)通過分析磷脂類物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了分子水平上乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)和乳腺導(dǎo)管原位癌(DCIS)的識(shí)別。此外，再帕爾等[59]還利用AFADESI-MSI技術(shù)在52例肺癌組織樣品中發(fā)現(xiàn)了病理學(xué)診斷可參考的潛在生物標(biāo)志分子包括磷脂、氨基酸、膽堿、多肽、肉堿等，并用這些生物標(biāo)志物獲得了快速、無需標(biāo)記的病理學(xué)圖像，通過AFADESI-MSI技術(shù)也實(shí)現(xiàn)了給藥大鼠組織切片中抗失眠藥物N6-羥芐腺苷(NHBA)及其內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的分析[60]；同樣地，利用DART-MS技術(shù)可直接分析水果皮表面的外源性化學(xué)物質(zhì)[61]和姜黃中具有藥用價(jià)值的姜黃素[15]等，這些結(jié)果表明，新型直接質(zhì)譜分析技術(shù)在藥用植物或食品原料的質(zhì)量控制、臨床診斷等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖2 中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜(ND-EESI-MS)分析冷凍肉類組織樣品的原理示意圖[56]Fig.2 Schematic illustration of neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry(ND-EESI-MS) analyzed frozen meat tissue samples[56]

圖3 內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜(iEESI-MS)分析組織樣品的原理示意圖[63]Fig.3 Schematic illustration of internal extractive electrospray ionization mass spectrometry(iEESI-MS) analyzed tissue samples[63]

2 直接質(zhì)譜分析整體組織樣品

相比于傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)(包括ESI-MS，LC-MS，CE-MS等)分析組織樣品，可分析復(fù)雜組織樣品表面的新型常壓直接質(zhì)譜技術(shù)(包括DESI-MS，DAPCI-MS，LTP-MS，ND-EESI-MS，AFAI-MS，DART-MS等)由于無需復(fù)雜樣品處理過程，可顯著提高分析效率。但這些技術(shù)存在分析過程中組織樣品中的有效成分直接暴露在空氣中會(huì)發(fā)生降解、失活等問題。針對(duì)這些問題，基于前期研究的工作基礎(chǔ)，本課題組于2013年提出了一種在不破壞樣品的前提下直接獲取凝聚態(tài)整體組織樣品(如動(dòng)植物組織)內(nèi)部化學(xué)信息的內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(iEESI-MS)[62-64]，該技術(shù)萃取、分離、電噴霧電離3個(gè)過程在時(shí)間與空間上緊密相連，能直接獲取整體組織樣品3-D體積內(nèi)的分子信息，其原理示意圖見圖3。

iEESI-MS的具體工作方式如下：作為ESI通道的石英毛細(xì)管一端與微量進(jìn)樣針相連，另一端平行插入組織樣品內(nèi)部，但石英毛細(xì)管尖端不露出，插入組織樣品內(nèi)部的石英毛細(xì)管前端距離樣品前端約2 mm，樣品前端距離質(zhì)譜入口約5～6 mm。帶有一定電壓的萃取溶劑經(jīng)ESI通道以一定流速導(dǎo)入到組織樣品內(nèi)部，對(duì)組織樣品內(nèi)部的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行選擇性萃取，在電場的作用下，含有待測物的微小帶電液滴朝著質(zhì)譜口定向移動(dòng)并在樣品尖端形成電噴霧，所形成的帶電液滴隨后去溶劑化，獲得氣態(tài)待測物離子，進(jìn)入質(zhì)譜儀分析。iEESI-MS技術(shù)主要包括以下特點(diǎn)：①iEESI無需輔助氣體；②iEESI將溶劑直接導(dǎo)入到組織樣品內(nèi)部，萃取過程發(fā)生在整體組織樣品內(nèi)部，待測物絕對(duì)量大，靈敏度比表面分析高；③iEESI使用的溶劑可方便地進(jìn)行更換，并根據(jù)需要有針對(duì)性的選擇，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的選擇性萃取，方法的萃取效果較明顯，離子化過程可控性強(qiáng)；例如對(duì)不同成熟度草莓內(nèi)部具有生物活性、能顯現(xiàn)草莓成熟度的天竺葵色素分子分析發(fā)現(xiàn)，隨著iEESI-MS分析時(shí)間的增加，草莓尖端顏色逐漸變淺(見圖4)，說明草莓組織內(nèi)部的天竺葵色素分子被萃取[62]。④iEESI電離過程是一種特定條件下小體積范圍內(nèi)的色譜分離過程與電噴霧過程的綜合體現(xiàn)，既具有分離作用，也有電噴霧的效果；⑤iEESI-MS實(shí)驗(yàn)所需樣品耗量少，實(shí)驗(yàn)過程可根據(jù)樣品質(zhì)地等實(shí)際情況進(jìn)行取樣，如樣品形狀可以為小三角形薄片、小圓錐體、矩形等；⑥iEESI操作簡單，分析速度快，易于與小型質(zhì)譜儀聯(lián)用。目前，該技術(shù)已在植物代謝組學(xué)研究(如草莓成熟機(jī)制、吊蘭發(fā)病機(jī)理研究、銀杏葉品種鑒別)，食品安全(肉質(zhì)食品中痕量瘦肉精成分的快速篩查、蔬菜水果新鮮度和保鮮期的預(yù)測)，臨床診斷(尋找腫瘤分子標(biāo)志物、快速判斷臨床手術(shù)過程癌變組織是否切除完全)等方面進(jìn)行了初步應(yīng)用研究。

圖4 隨著iEESI-MS分析時(shí)間的增長，成熟草莓尖端顏色的改變[62]Fig.4 Color change of a ripe strawberry with the time prolongation of an iEEI process[62]time(A-C):0,2.5,6 min

2.1 iEESI-MS在植物代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用

植物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)中的一個(gè)重要組成部分，將為植物的生理代謝研究提供重要的科學(xué)依據(jù)[65]。當(dāng)然，對(duì)植物代謝組學(xué)進(jìn)行研究，首先要從分子水平上獲得植物組織(特別是活體組織)內(nèi)部的分子信息。利用iEESI-MS技術(shù)在無需任何樣品預(yù)處理?xiàng)l件下能直接獲取整體組織內(nèi)部分子信息的獨(dú)特性能，對(duì)不同成熟度的草莓、不同生理狀態(tài)的吊蘭及不同品種的銀杏葉[62]、不同產(chǎn)地臍橙表皮組織與果肉組織[66]、新鮮蘆筍莖塊與干燥蘆筍莖塊等進(jìn)行直接iEESI-MS分析，快速獲得組織內(nèi)部氨基酸、糖類、生物堿、黃酮、色素等多種化學(xué)成分。這些結(jié)果表明，iEESI-MS技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)植物組織樣品內(nèi)部化學(xué)成分的快速分析，也可從分子層次上很好地識(shí)別由植物生理狀態(tài)變化造成組織內(nèi)部代謝組分的變化。蘆筍作為一種高檔蔬菜，人們一般只摘取其嫩莖部分進(jìn)行食用，導(dǎo)致在鮮銷、深加工過程產(chǎn)生大量的根莖，基本以廢棄物的方式進(jìn)行處理。而通過對(duì)新鮮蘆筍莖塊與干燥蘆筍莖塊進(jìn)行直接iEESI-MS分析發(fā)現(xiàn)，利用廢棄莖塊加工制得的干燥莖塊，其內(nèi)部具有消除疲勞、減肥、利尿等特殊功效的營養(yǎng)成分含量甚至高于新鮮蘆筍莖塊。這種變廢為寶的做法，不僅實(shí)現(xiàn)了蘆筍的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更改善了人們的健康[67]。這些結(jié)果表明，iEESI-MS技術(shù)不僅可給食源性植物組織樣品的分析提供一種可靠的質(zhì)譜分析新方法，而且對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有一定的指導(dǎo)意義。

2.2 iEESI-MS在食品分析中的應(yīng)用

質(zhì)譜技術(shù)在食品安全中也具有重要應(yīng)用，近年來隨著“瘦肉精”事件的發(fā)生，食品安全問題引起了人們的高度恐慌。因此，建立一種在分子水平上快速、準(zhǔn)確檢測肉質(zhì)食品中痕量“瘦肉精”的方法，對(duì)保障食品安全、人體健康具有重大意義。通過對(duì)大眾日常消費(fèi)的豬肉等組織樣品進(jìn)行直接iEESI-MS分析發(fā)現(xiàn)，iEESI-MS技術(shù)可快速檢測到豬肉中痕量克倫特羅(Clenbuterol)、丙卡特羅(Procaterol)等，有望成為動(dòng)物組織樣品中痕量瘦肉精成分快速、高通量篩查的可靠技術(shù)[68]。通過對(duì)生姜以及不同品種、不同加工方式處理的蒜瓣組織進(jìn)行直接iEESI-MS分析發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)可快速獲取組織內(nèi)部生物化學(xué)信息和識(shí)別蒜瓣組織中代謝組分的變化[62,69]。iEESI-MS通過對(duì)4種紅辣椒腐敗過程中組織內(nèi)部膽堿、果糖和蔗糖等主要成分的連續(xù)監(jiān)測，繪制了膽堿或果糖與蔗糖相對(duì)豐度比值的代謝衰減曲線，從而為預(yù)測辣椒的新鮮度、保鮮期和其它蔬菜水果的品質(zhì)保障提供了技術(shù)參考[70]。

2.3 iEESI-MS在臨床診斷分析中的應(yīng)用

上述iEESI-MS技術(shù)除廣泛應(yīng)用在植物代謝組學(xué)研究、食品安全方面，它的獨(dú)特性能在臨床診斷中也極具吸引力。直接質(zhì)譜技術(shù)真正意義上應(yīng)用于臨床樣品分析是1997年，De Nollin等[71]運(yùn)用傅立葉變換激光微探針質(zhì)譜(Fourier transform laser microprobe MS，F(xiàn)T LMMS)技術(shù)分析體內(nèi)植入物周邊炎性組織，證實(shí)人體內(nèi)植入物周邊的炎癥組織中金屬鈦的含量增加。然而，F(xiàn)T LMMS技術(shù)較適用于金屬離子等性質(zhì)穩(wěn)定的成分，不適合組織樣品中其他物質(zhì)的檢測。例如胎盤中乙酰膽堿的定性和定量分析，需要采用色譜等分離技術(shù)將待測物組分分離后才可進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜檢測，耗時(shí)較長[72]。

圖5 iEESI-MS分析不同組織的化學(xué)指紋譜圖[73]Fig.5 iEESI-MS analysis of different tissues[73]A.lung cancer tissues,B.lung cancer normal tissues

近年來，隨著生物組織內(nèi)復(fù)雜機(jī)理過程研究的深入和電離技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)出多種直接分析離體生物組織樣品的直接質(zhì)譜技術(shù)。如：以磷脂類物質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度高、種類多為目標(biāo)，對(duì)不同溶劑體系下的癌癥組織與癌旁組織進(jìn)行直接iEESI-MS分析，得到CH3OH-H2O(30∶70，體積比)是適合直接獲取不同生物組織樣品(包括食管癌、豬肺等)內(nèi)部磷脂類物質(zhì)的最佳溶劑體系，從而建立了一種無需破壞、研磨即可獲取生物組織樣品內(nèi)部磷脂類物質(zhì)的質(zhì)譜學(xué)新方法[73]。利用CH3OH-H2O(30∶70，體積比)作萃取溶劑，對(duì)肺癌癌癥組織與癌旁組織進(jìn)行直接iEESI-MS分析發(fā)現(xiàn)，癌癥組織(圖5A)與癌旁組織(圖5B)的化學(xué)指紋譜圖存在明顯差異(圖5)，這說明iEESI-MS可快速辨別出癌癥組織與癌旁組織在分子層次上的差異，該結(jié)果在尋找潛在腫瘤分子標(biāo)志物、快速判斷臨床手術(shù)過程癌變組織是否切除完全和進(jìn)一步探究癌癥發(fā)病機(jī)制等方面具有廣闊應(yīng)用前景[63,73]。

此外，利用iEESI-MS技術(shù)對(duì)不同外界刺激下的活體蒜瓣組織內(nèi)部蒜氨酸水解酶的反應(yīng)活性進(jìn)行直接在線監(jiān)測，結(jié)果表明該方法不僅可在盡可能保持組織生理狀態(tài)完整的條件下實(shí)時(shí)監(jiān)測蒜氨酸水解酶在多種外界刺激下的應(yīng)激活性，而且還可在線獲取組織內(nèi)部酶促反應(yīng)體系中底物和反應(yīng)產(chǎn)物含量的動(dòng)態(tài)變化信息，有望成為在分子層次理解酶促反應(yīng)機(jī)制的新型工具[64]。

3 直接質(zhì)譜分析在活體分析中的應(yīng)用

呼吸氣體攜帶大量與疾病、代謝、臟器狀況等相關(guān)的生物標(biāo)志物分子，且呼出氣體檢測具有無損、快速、采樣方便且非侵入性、不涉及個(gè)人隱私等優(yōu)勢，在臨床醫(yī)學(xué)、分析檢測等研究領(lǐng)域備受關(guān)注[74-76]。由于呼出氣體中代謝物的含量極低，對(duì)檢測儀器的靈敏度有較高的要求。電噴霧萃取電離質(zhì)譜技術(shù)(EESI-MS)具有靈敏度好、分析速度快、基體耐受強(qiáng)、便于活體分析等優(yōu)點(diǎn)，從而為人體呼吸氣體中揮發(fā)性、非揮發(fā)性化合物的檢測提供了可靠的技術(shù)支撐[77-79]。此外，EESI-MS技術(shù)還能通過呼出氣體中化學(xué)成分的變化來監(jiān)測人體服用藥物在體內(nèi)的代謝過程。Gamez等[80]利用EESI-MS技術(shù)監(jiān)測了丙戊酸(VPA)在體內(nèi)的代謝情況，研究結(jié)果表明EESI-MS技術(shù)在臨床診斷、代謝組學(xué)研究中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。除EESI-MS技術(shù)應(yīng)用于呼出氣體分析外，Garcia-Gomez等[81]利用二次離子高分辨質(zhì)譜技術(shù)(SESI-HRMS)分析了人體呼出氣體中的20多種色氨酸代謝物。Kumar等[82]利用SIFT-MS技術(shù)對(duì)210例呼吸氣體樣品(包括食管癌、胃癌患者、健康人)中的揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪酸、酚、醛類化合物在一定程度上可作為食管癌、胃癌患者呼出氣體中潛在的標(biāo)志物分子。Ghimenti等[83]通過熱解吸氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(TD-GC-MS)成功檢測了醫(yī)院工作人員呼出氣體中的代表性污染物七氟醚和異丙醇，并將該技術(shù)應(yīng)用于其它外源性化合物揮發(fā)性代謝物的分析，以試圖對(duì)工作人員的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考依據(jù)。此外，通過分析手術(shù)過程使用電刀、超聲刀、激光刀等手術(shù)器械產(chǎn)生的氣溶膠(煙霧、電刀廢氣)來實(shí)時(shí)鑒定人體組織成分的快速汽化電離質(zhì)譜(REIMS，也稱智能刀)，該技術(shù)可直接對(duì)生物組織進(jìn)行快速分析，避免了樣品在處理過程的損失及繁瑣的提取、純化工作[84]。表1為直接質(zhì)譜技術(shù)在組織樣品及活體分析中的部分應(yīng)用。

表1 直接質(zhì)譜技術(shù)在組織樣品及活體分析中的部分應(yīng)用Table 1 Direct mass spectrometry techniques and their applications in tissue samples and in vivo analysis

(續(xù)表1)

TypicaltechniqueTissuesample/ExhaledbreathAnalyteLODRSD(%)ReferenceGarlicandgingertuberAminoacids，saccharides/7 3～11 262，69RedpeppersDifferentaitionfreshnessofredpepper//70DifferentbiologicaltissuesamplesPhospholipids//73PorkmeatSalbutamol0 039ppb6～1563RawgarlicclovesEnzymaticreaction//64EESI-QTOF-MSExhaledbreathNonvolatilecompounds//78ExhaledbreathNicotine0 05fg/mL5 0079ExhaledbreathValproicacid//80SESI-HRMSExhaledbreathTryptophanpathwaymetabolites//81SIFT-MSExhaledbreathofesophagealandgastricadenocarcinomaVolatileorganiccompoundbiomarkers//82TD-GC-MSExhaledbreathSevofluraneandisopropylalcohol//83FTLMMSInflammatorytissueTitaniumoxideandmetallictitanium//71GC-MSHumanplacentaAcetylcholine//72REIMSHumantissueLipids//84

4 結(jié)論與展望

目前，直接質(zhì)譜技術(shù)已實(shí)現(xiàn)在無需樣品預(yù)處理的條件下對(duì)組織樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)、非破壞、在線分析，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了從分析組織樣品表面到分析整體組織樣品的過渡。重要的是，使組織樣品內(nèi)部小分子代謝物、大分子脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等從細(xì)胞和亞細(xì)胞水平進(jìn)行鑒定、從空間分布進(jìn)行研究成為可能，極大地拓寬了對(duì)組織樣品所揭示的不同生理過程進(jìn)行深入理解的角度和維度，預(yù)示著新型直接質(zhì)譜分析技術(shù)將成為未來生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、活體分析等領(lǐng)域發(fā)展過程中起推動(dòng)作用的關(guān)鍵技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快、能提供分子結(jié)構(gòu)信息等特點(diǎn)，解決了組織樣品內(nèi)部化學(xué)成分的定性分析問題，但由于組織樣品基質(zhì)復(fù)雜，在生物標(biāo)志物分子篩選、精準(zhǔn)定量等方面依然面臨著一定的挑戰(zhàn)。

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Direct Mass Spectrometry Techniques and Their Applications in Tissue Samples Analysis

LU Hai-yan，ZHANG Hua，XIAO Yi-po，LI Yi， GU Hai-wei， CHEN Huan-wen*

(Jiangxi Key Laboratory for Mass Spectrometry and Instrumentation,East China University of Technology,Nanchang 330013,China)

Ambient mass spectrometry has been increasingly applied in tissue sample analysis with the advantages of high sensitivity,high speed and the capability for providing molecular structure information of compounds in complex matrices.Traditionally,the time-consuming sample pretreatment procedures including homogenization,extraction and separation are inevitable for tissue sample analysis,and commonly associated with biological degradation,chemicals contamination and bioactive components loss in sample preparations.Recently,with the development of novel ambient mass spectrometry techniques,insitutissue samples analysis has become possible without sample pretreatment. The applications of ambient mass spectrometry in tissue samples analysis are mainly discussed in this review,and their impacts in different fields,such as life science,clinical medicine,food science andinvivoanalysis are prospected.

mass spectrometry;tissue sample;applications;review

2016-09-14；

2016-09-30

國家自然科學(xué)基金(21565004)；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT13054)；江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20142BCB24005，20124ACB00700)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.001

O657.63

A

1004-4957(2017)02-0152-09

*通訊作者：陳煥文，博士，教授，研究方向：質(zhì)譜分析，Tel:0971-83896370，E-mail:chw8868@gmail.com