光誘導細胞色素b5還原反應(yīng)及機理的光譜學研究

唐 乾，黃 婷，宮婷婷，曹洪玉，王愛玲，王立皓，鄭學仿

1.大連大學生命科學與技術(shù)學院，遼寧 大連 116622 2.大連大學環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622 3.遼寧省生物有機化學重點實驗室,大連大學，遼寧 大連 116622

引 言

電子的有效和受控運動是生物學的主要調(diào)控機制之一，對生物體的存在至關(guān)重要[1]。電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(electron transfer,ET)在生物系統(tǒng)功能中起著關(guān)鍵的作用[2-4]。例如，在光合作用中心，光子激發(fā)和隨后的電荷轉(zhuǎn)移是生命過程的驅(qū)動力。

細胞色素b5(Cytochrome b5，Cyt b5)是一種與膜結(jié)合約18.6 KD的低分子蛋白，由約133個氨基酸殘基組成，主要在高等動物肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中富集，其功能主要是在電子傳遞中傳遞電子，例如，Cyt b5可以接受來自NADPH-細胞色素P450還原酶[5-6]和NADH-細胞色素b5還原酶[7]的電子，并且可以將它們轉(zhuǎn)移到許多電子受體蛋白質(zhì)，兩者都是氧化還原受體。如細胞色素c和天然受體[8]，細胞色素P450[9]，血紅蛋白[10]，高鐵肌紅蛋白等。這種電子傳遞一直是廣泛研究的課題，但Cyt b5協(xié)助電子傳遞的具體機制尚未完全闡明。光還原似乎可以闡明蛋白質(zhì)內(nèi)的電子傳遞途徑。許多學者通過光激發(fā)輻射樣品測定其紫外-可見吸收光譜，研究血紅素蛋白和金屬卟啉的光還原反應(yīng)。國外文獻報道大多集中在外源供體不存在的情況下，血紅素蛋白(如細胞色素c和細胞色素P450)的光還原。周華偉等[11-12]發(fā)現(xiàn)光誘導metMb還原的機理為光誘導分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，光照還原程度因入射光波長而異，低溫、堿性有利于metMb的光照還原。Bartocci等聲稱血紅素軸向配體通過提供一個電子并將其轉(zhuǎn)移到血紅素鐵中，使鐵原子還原。但Ozaki等觀察到鐵配體電荷轉(zhuǎn)移帶的光激發(fā)不誘導光還原。有研究認為，芳香族氨基酸，特別是色氨酸，是有助于電子的轉(zhuǎn)移[13]。有報道研究了Cyt c光還原的波長依賴性，在芳香族氨基酸吸收的光子能量范圍內(nèi)測定固定波長254 nm的光還原效率。然而，從該數(shù)據(jù)中并未得出光還原效率的波長依賴性是否遵循Cyt c中色氨酸和酪氨酸的光學吸收。共振拉曼光譜同樣可用于研究血紅素蛋白質(zhì)光還原，但血紅素光還原的詳細機制仍然是難以捉摸的。

Cyt b5的代謝功能和結(jié)構(gòu)特性已經(jīng)被廣泛研究，但是關(guān)于這種細胞色素改變氧化態(tài)的機制的實驗信息卻很少。因此本實驗運用紫外-可見吸收、熒光和圓二色光譜法系統(tǒng)地研究了溶液中不同的紫外定波長、pH、氨基酸、谷胱甘肽對Cyt b5光照還原的影響，以闡明Cyt b5還不能用傳統(tǒng)提出的機制去解釋的光還原機制。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：含牛肝微粒體細胞色素b5水溶性片段基因質(zhì)粒由美國西北大學Hoffman教授惠贈；蛋清溶菌酶和Ampicillin(購于Sigma公司)；BL21-DE3感受態(tài)細胞(購于寶生物有限公司)；酵母提取物和蛋白胨(購于OXOID公司)；DEAE SepharoseTMCL 6B(購于GE公司)、SephadexTMG-100(購于Amersham公司)、其他試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

儀器：V-560紫外-可見分光光度計(日本Jasco公司)；RF-6000熒光分光光度計(日本島津公司)；J-810型圓二色譜儀(日本Jasco公司)。

1.2 方法

(1)細胞色素b5蛋白溶液的獲得[14]。

轉(zhuǎn)化(將含Cyt b5外源基因質(zhì)粒通過熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21-DE3感受態(tài)細胞中)→篩選陽性克隆(選取在含Amp+的LB固體培養(yǎng)基上生長的紅色菌落)→菌體培養(yǎng)和收集(含Amp+的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)20～24 h后，4 ℃、5 000 r·min-1、10 min離心收集菌體備用)→蛋白獲取(菌體經(jīng)溶菌酶和超聲裂解、透析、DEAE-CL-6B和Sephadex G-75柱層析、最后收集、濃縮)→純度鑒定，最終得到純度在96%以上的Cytb 5蛋白濃縮液→-196 ℃液氮保存。Cyt b5濃度測定：根據(jù)摩爾消光系數(shù)ε412=117 mM-1·cm-1[14]，采用朗博-比爾定律進行定量分析。

(2)UV-Vis吸收光譜

Cyt b5溶解于pH7.4，0.05 mol·L-1的PB緩沖液進行測定。還原態(tài)Cyt b5溶液為加入0.25 mol·L-1Na2S2O4獲得。掃描波長：220～700 nm，掃描速率：200 nm·min-1，取三次實驗平均結(jié)果等。

(3)熒光光譜測定

Cyt b5溶解于pH 7.4，0.05 mol·L-1的PB緩沖液進行測定。掃描波長范圍：290～450 nm，掃描速率：200 nm·min-1，累計三次取平均結(jié)果。

(4)圓二色譜(CD)

Cyt b5溶解于pH 7.4，0.05 mol·L-1的PB緩沖液進行測定。掃描范圍：190～250 nm，光徑：1 mm，掃描速度：50 nm·min-1，取3次平均結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cyt b5的UV-Vis吸收光譜

Cyt b5蛋白電子傳遞功能的完成通過其活性中心的血紅素中心鐵的價態(tài)變化來實現(xiàn)，實驗結(jié)果見圖1。Cyt b5-FeⅢ的特征吸收峰波長為412，532和560 nm，還原態(tài)的Cyt b5-FeⅡ的特征吸收峰波長423，527和556 nm。實驗前對Cyt b5進行UV-Vis光譜表征(圖1)，可知樣品Cyt b5主要以氧化態(tài)形式存在。光譜顯示了350～700 nm范圍內(nèi)的三個吸收帶，412，560和532 nm。隨后用Na2S2O4還原，產(chǎn)生紅線所示的吸收光譜。還原形式的Soret帶紅移11 nm，Q波段峰強度增加峰位置發(fā)生移動，在527和556 nm處形成兩個吸收峰，說明以氧化態(tài)形式存在的Cyt b5被還原。

圖1 細胞色素b5的紫外-可見吸收光譜Fig.1 Stationary absorption spectra of completely oxidized (black)and completely reduced (red)Cyt b5

2.2 Cyt b5光照還原與化學還原的UV-Vis吸收光譜比較

圖2(a)和(b)為氙燈分出的280 nm單色光照射Cyt b5溶液的紫外-可見吸收光譜。隨著光照時間延長，Cyt b5的Soret帶412 nm處吸收峰強度逐漸降低并紅移到421 nm處，其Q帶532和560 nm處吸收峰強度降低，最終在527和556 nm形成新吸收峰，同時在416和546 nm附近出現(xiàn)兩個等吸收點。與圖3中的結(jié)果比較可發(fā)現(xiàn)Cyt b5在280 nm氙燈光照后吸收光譜圖與化學還原后的譜圖變化趨勢一致。向Cyt b5樣品中加入不同濃度的Na2S2O4溶液，充分反應(yīng)2 min后UV-Vis光譜表明，Cyt b5樣品412 nm處的特征吸收峰強度隨著Na2S2O4溶液濃度的增加而逐漸降低并紅移至423 nm[圖3(a)]，其Q帶532和560 nm處的特征吸收峰逐漸增強[圖3(b)]。當加入過量Na2S2O4時，其Q帶527和556 nm吸收峰不斷增強，最終在416和546 nm附近出現(xiàn)兩個等吸收點。UV-Vis光譜表明在室溫條件下光照Cyt b5可產(chǎn)生與上述化學還原過程類似現(xiàn)象。光照還原Soret帶峰位置未達最終還原態(tài)423 nm，歸因于少量的蛋白質(zhì)發(fā)生變性。即使在光還原Cyt b5中加入還原劑Na2S2O4其峰強度仍然比直接化學還原Cyt b5的還原峰強度要小(數(shù)據(jù)未列出)。

圖2 Cyt b5光照前后的UV-Vis吸收光譜圖(a):光照前；(b):光照后Fig.2 UV-Vis absorption spectra of Cyt b5 with/without irradiation at 280 nm(a):Before illumination；(b):Upon illumination ccyt b5=5×10-6 mol·L-1

圖3 Cyt b5化學還原的UV-Vis吸收光譜(a):含有連二亞硫酸鈉的Q帶吸收峰；(b):連二亞硫酸鈉濃度從a→e的光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectra of chemical reduction for Cyt b5 with sodium dithionite(a):The absorption spectra of chemical reduction for Cty b5 in soret band with sodium dithionite; (b):The obsorption spectra of chemical reduction for Cty b5 in Q band with sodium dithionite ccyt b5=3×10-6 mol·L-1,from a to e,cNa2S2O4=0,3,6,9,12×10-6 mol·L-1,respectively

2.3 不同定波長對Cyt b5光還原的影響

愛因斯坦光子理論闡述：光能量與波長呈反比；而物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，會吸收不同波長的光。為了探究波長對Cyt b5光照還原的影響，實驗選用氙燈分出的不同定波長(254，280，412和423 nm)照射Cyt b5溶液25 min。經(jīng)不同波長光照射后，Cyt b5的Soret帶412 nm處特征吸收峰強度均降低并紅移，其Q帶527和556 nm處的特征吸收峰有明顯增強。在不同的波長光照射下，隨著光照時間延長527和556 nm處吸收峰強度發(fā)生變化，但變化的趨勢不同。其中280 nm光照射時527和556 nm吸收峰強度增加的趨勢最大，即還原產(chǎn)物Cyt b5-FeⅡ最多。圖4(a—d)分別為四種波長光照射Cyt b5對還原影響程度，280 nm>254 nm，412和423 nm對光照還原沒有影響。由此說明Cyt b5被紫外光誘導還原，還原程度并非與光照射能量成正比。Cyt b5分子中有1個 Trp、4個Tyr和3個Phe殘基。280 nm光照引起的還原反應(yīng)現(xiàn)象最明顯的原因是280 nm波長光易被Trp吸收。光子被Trp大量吸收形成激發(fā)態(tài)，Trp通過激發(fā)能量傳遞至鐵卟啉基團激發(fā)態(tài)，進而引發(fā)光氧化過程。280 nm光能被大量吸收，能量比較高，因此比254 nm更有利于光照氧化。分析認為，412、423 nm不是芳香族氨基酸的特征吸收峰，能量比較低，難以激發(fā)鐵卟啉基團至激發(fā)態(tài),與Consani 等[15]提及的Trp在肌紅蛋白Trp-to-Heme能量傳遞過程中起重要作用的結(jié)論相吻合；另一方面，這些波長引發(fā)的還原速率非常慢，氧氣可能會泄露到樣品中，從而阻止蛋白質(zhì)發(fā)生光還原。

圖4 不同定波長氙燈光照Cyt b5(pH 7.4)25 min后紫外-可見吸收變化光譜圖(a):254 nm；(b):280 nm；(c):412 nm；(d):423 nmFig.4 UV-Vis absorbance change of Cyt b5 irradiated by xenon lamp at different fixed wavelengths(a):254 nm；(b):280 nm；(c):412 nm；(d):423 nm

2.4 pH對Cyt b5光還原的影響

Cyt b5蛋白在不同的pH緩沖溶液中顯示不同的價態(tài)和構(gòu)象。研究了pH為5.4，6.4，7.4，8.0和9.0緩沖溶液中的光還原情況。在pH為5.4緩沖溶液中，基線有明顯的漂移現(xiàn)象，為了分析數(shù)據(jù)的準確性，采用峰面積對pH作圖分析。如圖5(a,b)所示分別在五個不同pH條件下，280 nm光照對Cyt b5光還原的影響。光照前，560 nm處吸收峰面積隨著pH的升高而略微增加，但Soret帶的特征吸收峰位置仍在412 nm處，說明Cyt b5未發(fā)生還原反應(yīng)；光照25 min后，隨著pH由酸性到堿性的變化，Cyt b5溶液的Soret帶和Q帶的吸收峰面積逐漸增加，實驗范圍內(nèi)，即pH值越大越容易發(fā)生光還原反應(yīng)。分析認為光還原過程中會產(chǎn)生部分H+，堿性條件下OH-會中和部分H+，因此Cyt b5在偏堿性條件下易于發(fā)生光照還原。

圖5 不同pH條件下Cyt b5溶液光還原峰面積的變化曲線(a):412 nm處吸收峰曲線變化;(b):556 nm處吸收峰曲線變化Fig.5 Curve of irradiation reduction peak area of Cyt b5 solution under different pH conditions at 280 nm(a):The peak area changes at 412 nm;(b):The peak area changes at 556 nm

2.5 谷胱甘肽對Cyt b5光照還原的影響

谷胱甘肽(GSH)在所有生物細胞中存在，其還原性的巰基有很強的供電子能力，可參與體內(nèi)重要的氧化還原反應(yīng)。GSH的巰基有微弱的還原性，黑暗條件下不會直接與蛋白相互作用，采用氙燈280 nm光激發(fā)卟啉后，GSH開始參與反應(yīng)并對Cyt b5的還原反應(yīng)起促進作用。光照作用明顯提高了GSH的還原能力(見圖6)。GSH巰基(—SH)上的S原子帶有孤電子對，可以提供電子給FeⅢ，當Cyt b5被光照后形成激發(fā)態(tài)的高鐵血紅素輔基，電子從卟啉環(huán)轉(zhuǎn)移到中心鐵原子上形成亞鐵血紅素輔基陽離子自由基，S原子提供電子給亞鐵血紅素輔基，促進了亞鐵Cyt b5的形成。以上結(jié)果表明GSH和卟啉均非光照氧化還原過程中的氧化劑或者還原劑，類似于葉綠素光反應(yīng)過程，它們都是電子傳遞的“中間人”，整個反應(yīng)是卟啉、GSH和鐵之間的能量和電子傳遞過程，此鏈式超快電子轉(zhuǎn)移過程是在溶液中光激發(fā)鐵卟啉和GSH后進行的。

圖6 加入GSH (pH 7.4)25 min后Cyt b5的紫外-可見光譜圖a:Cyt b5未做處理;b:Cyt b5光照25 min;c:加入GSH的Cyt b5光照25 minFig.6 UV-Vis absorbance change of Cyt b5 added GSH under pH 7.4a:Cyt b5;b:Cyt b5 irradiated at 25 min; c:Cyt b5-GSH irradiated at 25 min

2.6 甲硫氨酸對Cyt b5光照還原的影響

圖7中從Soret和Q帶峰強度和峰位置可以判斷出，未加入Met時其Soret帶峰位置沒有發(fā)生明顯變化仍為412 nm，但是其峰強度有小幅度的下降，其Q帶在566 nm形成一個微弱的小峰；加入Met時其Soret帶峰位置發(fā)生明顯改變由412 nm紅移到420 nm處，其Q帶556 nm處形成一個非常明顯的還原峰。通過比較可以確定Met對光照還原有非常好的促進作用。分析認為Met在Cyt b5被光照還原過程中產(chǎn)生的·OH自由基產(chǎn)物被Met清除，進而促進了光照還原速率的提升[16]。

圖7 加入Met (pH 7.4)5 min后Cyt b5的紫外-可見光譜圖a:Cyt b5未做處理;b:暗處理30 min Cyt b5;c:光照5 min Cyt b5-GSH；d:加入Met后Cyt b5光照5 minFig.7 UV-Vis absorbance change of Cyt b5 added Met under pH 7.4a:Cyt b5;b:in dark 30 min;c:Cyt b5 irradiated at 5 min;d:Cyt b5-Met irradiated at 5 min

2.7 咪唑?qū)yt b5光照還原的影響

取2 μL 0.02 mol·L-1的咪唑溶液于2 mL Cyt b5蛋白溶液中黑暗中放置30 min，測其紫外-可見吸收光譜，發(fā)現(xiàn)譜圖基本沒有發(fā)生變化。圖8(a,b)分別為Cyt b5在光照射前后其412和556 nm處峰面積的變化圖，由圖8可知：咪唑可促進Cyt b5光還原反應(yīng)的發(fā)生。咪唑加入Cyt b5蛋白溶液后，可以作為光還原電子供體促進光照還原反應(yīng)的進行。咪唑的五元芳雜環(huán)中含有兩個間位的氮原子，與組氨酸結(jié)構(gòu)類似可結(jié)合血紅素，其1-位氮原子的未共用電子對參與環(huán)狀共軛，導致氮原子的電子云密度有所下降，從而1-位氮原子上的氫易以H+形式離去。咪唑殘基上的給電子基團對還原速率具有顯著促進作用。

圖8 加入咪唑(pH 7.4)25 min后Cyt b5的紫外-可見光譜圖(a):420 nm峰面積變化;(b):556 nm峰面積變化Fig.8 UV-Vis absorbance change of Cyt b5 added imidazole under pH 7.4(a):The peak area changes at 412 nm; (b):Area changes at 556 nm

2.8 Cyt b5光還原構(gòu)象的變化

為了進一步了解連續(xù)UV光照射對蛋白質(zhì)構(gòu)象方面的影響。圖9為280 nm照射25 min的Cyt b5前后熒光發(fā)射光譜圖。Cyt b5的333 nm是最大發(fā)射波長，主要由生色氨基酸殘基如Trp，Tyr和Phe周圍環(huán)境變化引起[16]。隨著光照時間的延長，經(jīng)280 nm單色光照射后的Cyt b5在～333 nm處的熒光發(fā)射強度降低了38%，且最大發(fā)射波長紅移到了336 nm。表明Cyt b5芳香族氨基酸的微環(huán)境發(fā)生了改變。Trp22(Trp位于蛋白一級結(jié)構(gòu)第22位)和Cyt b5的血紅素可以發(fā)生較強的能量轉(zhuǎn)移過程，Trp的疏水環(huán)境遭到破壞，親水性越強，能量越低[17]，即連續(xù)280 nm照射25 min后，Cyt b5中Trp的疏水區(qū)更加暴露于極性的水環(huán)境中。這種三級構(gòu)象的改變也可能是由于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變而引發(fā)的[18]。由紫外可見光譜的確可以發(fā)現(xiàn)Cyt b5中有部分蛋白發(fā)生變性。

圖9 Cyt b5 在280 nm光照不同時間下的熒光光譜圖a→f:0,5,10,15,20,25 min光照時間熒光譜圖變化Fig.9 Fluorescene spectra of Cyt b5 at different irradiated time at 280 nm Frome a to f,the irradiation times were 0,5,10,15,20,25 min,respectively

2.9 Cyt b5光還原二級結(jié)構(gòu)的變化

Cyt b5的CD譜(350～700 nm)能夠揭示蛋白質(zhì)二級機構(gòu)變化的信息[19]。如圖10所示208和222 nm是Cyt b5α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰，隨著光照時間的延長Cyt b5的CD譜圖發(fā)生變化，208和222 nm處負峰振幅明顯減弱，CD譜圖的峰強度發(fā)生一定變化,但是形狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯改變。部分α-螺旋轉(zhuǎn)變成β-折疊，說明隨著Cyt b5光照還原的發(fā)生，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水殘基基團的不斷暴露，與熒光光譜結(jié)果一致，光照過程導致Cyt b5二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定改變，但是整個Cyt b5的二級結(jié)構(gòu)仍以α-螺旋為主，說明光照時間內(nèi)Cyt b5蛋白未完全變性。

圖10 280 nm氙燈照射后Cyt b5的CD光譜圖光照時間從a→c:0,10,25 minFig.10 CD spectra of Cyt b5 after irradiation with xenon lamp at 280 nm From a to c,the irradiation times were 0,10,25 min,respectively

3 結(jié) 論

利用多種光譜學技術(shù)對光照射Cyt b5還原反應(yīng)的依賴性和機理進行了探究。結(jié)果表明：選定氙燈280 nm波長光照射下的Cyt b5溶液被還原，且隨著光照時間的延長，還原程度越強。選定波長280 nm光照射，偏堿性條件利于Cyt b5的還原；Met、GSH和咪唑的存在均能促進還原反應(yīng)。熒光光譜以及圓二色光譜結(jié)果表明，Cyt b5被光誘導還原后，蛋白主鏈結(jié)構(gòu)更加伸展，α-螺旋含量降低，β-折疊含量升高，但是整個Cyt b5的二級結(jié)構(gòu)仍以α-螺旋為主，說明光照時間內(nèi)Cyt b5蛋白未變性。Cyt b5被光還原的機理為從卟啉環(huán)到三價鐵的電子轉(zhuǎn)移，通過280 nm激發(fā)形成卟啉π陽離子基團和亞鐵。以上的實驗結(jié)果對于光誘導血紅素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究，具有重要的理論意義和實踐價值。