中藥對雞致病性大腸埃希菌的體外抑菌試驗

張召興,李蘊(yùn)玉,常超越,張香齋,史秋梅,張艷英,吳同壘,張志強(qiáng), 賈青輝,李佩國

(河北科技師范學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，河北秦皇島 066604)

中藥對雞致病性大腸埃希菌的體外抑菌試驗

張召興,李蘊(yùn)玉,常超越,張香齋,史秋梅,張艷英,吳同壘,張志強(qiáng), 賈青輝*,李佩國*

(河北科技師范學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，河北秦皇島 066604)

為研究25種中藥對秦皇島地區(qū)雞致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli)地方流行株QH1(O78)、QH2(O89)、QH4(O1) 的體外抑菌效果，以E.coli標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922作為質(zhì)控菌株。利用水提法制備中藥藥液，使終濃度為1 g/mL；用平板瓊脂打孔法和改良微量二倍稀釋-平板法分別測定25種中藥的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明,金銀花、黃連、烏梅、五味子4種中藥對雞致病性E.coli地方株極度敏感,抑菌圈直徑在20.3 mm～22.7 mm之間，其MIC在15.65 mg/mL～31.25 mg/mL之間；其他藥物對雞致病性E.coli地方株有不同程度的敏感性,為雞致病性E.coli地方株中藥防治提供理論基礎(chǔ)。

雞; 致病性大腸埃希菌；中藥；體外抑菌試驗

雞大腸桿菌病是由致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli) 引起雞急性的、局部或者全身性的疾病，對不同日齡雞有很強(qiáng)的致病性，尤其是胚胎雞和雛雞[1]。雞致病性E.coli的血清型眾多復(fù)雜，不同區(qū)域流行的血清型不同，其致病力也不同[2-3]。該菌分布廣泛，是重要的人獸共患致病菌，引起人和多種動物感染[4]。長期不合理的使用抗生素，導(dǎo)致動物性食品藥殘量增高，E.coli耐藥性增強(qiáng)且呈現(xiàn)多重耐藥，E.coli的耐藥菌株可以通過動物和食品，直接或者間接傳給人類，嚴(yán)重影響人類的健康[5-6]。

中藥屬于天然藥物，具有低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性、抗菌、消炎、抗炎癥損傷、抗內(nèi)毒素、綠色等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。中藥的多種有效成分及生物活性物質(zhì)對病原菌、內(nèi)毒素具有直接或者間接殺滅及清除作用，在動物體通過多種途徑或者多個靶點(diǎn)作用調(diào)整機(jī)體的平衡狀態(tài)，改善動物機(jī)體免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等的功能，增強(qiáng)機(jī)體吞噬細(xì)胞吞噬功能，增加機(jī)體免疫球蛋白含量，從而提高動物機(jī)體特異或者非特異免疫力[9-10]。許多研究證實(shí)，中藥具有抗菌、增強(qiáng)免疫力、抗E.coli內(nèi)毒素及消除E.coli耐藥質(zhì)粒的作用[11-12]。中藥作為抗菌藥物使用，可以降低動物體內(nèi)藥物殘留，減少耐藥性的產(chǎn)生。

本試驗對從秦皇島地區(qū)分離的雞致病性E.coli的地方流行株進(jìn)行體外抑菌試驗，篩選出對雞致病性E.coli的地方流行株敏感的中藥，為雞致病性E.coli的地方流行株中藥的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 秦皇島地區(qū)分離的雞致病性E.coli地方流行株QH1(O78)、QH2(O89)、QH4(O1)及標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室保存。

1.1.2 試劑及儀器 黃連、金銀花、肉豆蔻、訶子等25種中藥，購自秦皇島民樂醫(yī)藥有限公司；Nutrient Ager培養(yǎng)基、NB，北京奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；10 g/L紅四氮唑、96孔細(xì)菌培養(yǎng)板均，美國Corning公司產(chǎn)品；1510型全波長酶標(biāo)儀，德國Thermo公司生產(chǎn)產(chǎn)品；DHP-9082型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技儀器有限公司產(chǎn)品；RH小型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司產(chǎn)品；QE-10A型500g裝高速中藥粉碎機(jī)、WK-150型超微粉碎機(jī)，青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司產(chǎn)品；5804R型臺式高容量離心機(jī)，德國EPPENDOR公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備與計數(shù) 將QH1(O78)、QH2(O89)、QH4(O1)及標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC2922的菌種復(fù)蘇，37℃震蕩培養(yǎng)，每隔2 h，用全波長酶標(biāo)儀在波長 600 nm測定其OD值，確定細(xì)菌的對數(shù)生長期。利用平板菌落計數(shù)法進(jìn)行菌落計數(shù)[13]，取其對數(shù)生長期細(xì)菌，用滅菌的PBS洗滌3次(6 000 r/min 5 min)加入等量的500 mL/L甘油混勻分裝，置-80℃保存12 h后，取其中的10-5、10-6、10-73個稀釋度，置37℃培養(yǎng)12 h～16 h后進(jìn)行計數(shù)，每株菌做3個重復(fù)取其平均值。

1.2.2 中藥藥液的制備 利用水提法制備中藥藥液，取各中藥稱量100 g，用普通粉碎機(jī)粉碎過100目篩，再用超微粉碎機(jī)粉碎過300目篩，稱重加入5倍～8倍蒸餾水浸泡1 h，煮開后文火煎煮0.5 h左右，共煮2次合并藥液，12層紗布過濾、離心、濃縮原藥液量，使終濃度為1 g/mL即每毫升含原生藥1 g。分裝，調(diào)整pH為7.3，121℃高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 中藥體外抑菌圈直徑的測定 參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]報道的平板瓊脂打孔法，確定中藥體外抑菌圈直徑。將對數(shù)期菌液的濃度調(diào)至到108CFU/mL，取0.1 mL均勻進(jìn)行涂板，待菌液完全被吸收，用直徑為6 mm打孔器，進(jìn)行打孔、酒精燈封孔，每孔內(nèi)加滿1 g/mL中藥液體，對照孔加入等量PBS。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h～16 h，測量抑菌圈直徑，每種藥物重復(fù)3次，取其平均值。參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑≥20 mm為極敏，20 mm>抑菌直徑≥15 mm為高敏，15 mm>抑菌直徑≥10 mm為中敏，10 mm以下為低敏。

1.2.4 中藥最小抑菌濃度(MIC)的測定 利用96孔細(xì)菌培養(yǎng)板采用改良微量二倍稀釋-平板法確定中藥最小抑菌濃度(MIC)[16-17]。在96孔細(xì)菌培養(yǎng)板的第1、12孔每孔加200 μL滅菌水(在培養(yǎng)過程中防止水分蒸發(fā)影響結(jié)果)，在第2～11孔每孔加入100 μL滅菌水，第2孔加入100 μL中藥藥液(1 g/mL)，混合均勻后取100 μL以此類推稀釋到第9孔后棄100 μL，第2～11孔每孔加入100 μL 2×NB，第10孔不加藥為陽性對照孔，第11孔不接菌為陰性對照孔，在第2～10孔每孔加入10 μL對數(shù)期的菌液(108CFU/mL)，每孔中加入細(xì)菌指示劑10 g/L的紅四氮唑5 μL，每種藥物3個重復(fù)。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顏色變紅說明有細(xì)菌生長，結(jié)果為該中藥對細(xì)菌最小抑菌濃度。用無菌棉簽分區(qū)劃線法將個稀釋不同梯度的試驗菌液接種于普通培養(yǎng)基上，每種藥物3個重復(fù)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h～16 h。無菌生長的區(qū)域為該藥的最小的抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果

2.1 中藥體外抑菌圈直徑的結(jié)果

由表1可知，雞致病性E.coli分離株QH1(O78)、QH2(O89)、QH4(O1)，3株分離菌株均對金銀花、黃連、烏梅、五味子4種藥物極度敏感；分離株QH1(O78)對肉豆蔻、五倍子、訶子等7種藥物高度敏感，分離株QH2(O89)對肉豆蔻、白頭翁、五倍子、黃芩4種藥物高度敏感；分離株QH4(O1)對肉豆蔻、白頭翁、五倍子等5種藥物高度敏感；分離株QH1(O78)對夏枯草、紫花地丁、秦皮3種藥物中度敏感，分離株QH2(O89)對連翹、夏枯草、紫花地丁等6種藥物中度度敏感，分離株QH4(O1)對黃芩、秦皮、連翹等7種藥物中度度敏感；其余的藥物對致病性E.coli臨床分離株QH1(O78)、QH2(O89)、QH4(O1)及標(biāo)準(zhǔn)菌株均沒有效果。

2.2 中藥最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果

由表2可知，雞致病性E.coli分離株QH1(O78)對金銀花、黃連、烏梅、五味子4種藥物的MIC在15.65 mg/mL～31.25 mg/mL之間，對肉豆蔻、白頭翁、五倍子6種藥物的MIC在62.5 mg/mL～125 mg/mL之間，分離株QH2(O89)對金銀花、黃連、烏梅、五味子4種藥物的MIC均是31.25 mg/mL，對肉豆蔻、白頭翁、五倍子6種藥物的MIC在62.5 mg/mL～125 mg/mL之間，分離株QH4(O1)對金銀花、黃連的MIC均是31.25 mg/mL，對肉豆蔻、五倍子、白頭翁5種藥物的MIC在62.5 mg/mL～125 mg/mL之間；分離株QH1(O78)、QH2(O89)、QH4(O1)均對秦皮、紫花地丁、夏枯草、當(dāng)歸4種藥物效果較差，MIC在250 mg/mL～500 mg/mL之間；3株分離株及標(biāo)準(zhǔn)菌株對其余的藥物均沒有效果。

表1 中藥對雞致病性E.coli地方株體外抑菌試驗

注：注：“-”無敏感性。

Note："-"No sensitivity.

表2 中藥對雞致病性E.coli地方株的MIC

注：“-”無敏感性。

Note："-" No sensitivity.

3 討論

中藥富含多種天然的活性物質(zhì)成分，主要包括有機(jī)酸、生物堿、黃酮類化合物、活性多糖類、苷類、蒽醌類、揮發(fā)油、活性多糖等[18]。中藥所含這些活性物質(zhì)不僅對病原體有直接殺滅作用，還可以間接通過調(diào)節(jié)整個動物機(jī)體系統(tǒng)的平衡狀態(tài) ，使機(jī)體提高自身的免疫力起到抗菌的作用[8-9,19]。相關(guān)研究證明黃連中的小檗堿、五味子中的鞣酸、金銀花中的綠原酸等是主要抗菌活性物質(zhì)，主要的抗菌機(jī)理通過抑制細(xì)菌的生長代謝[20-22]。

本試驗對3個不同血清型的雞致病性E.coli地方流行株篩選出金銀花、黃連、烏梅、五味子4種極度敏感藥物。與張賽奇等[16]報道的15種中草藥對 豬源E.coliO101型體外抑菌試驗方法一致。張慧等[23]報道了金銀花、黃連對禽類大腸埃希菌體外抑菌效果最好，與本試驗結(jié)果一致。張賽奇等[14,16]報道了豬源E.coliO8型、O101體外抑菌試驗結(jié)果與本試驗存在一定的差異性。向雙云等[24]報道8種中草藥其中魚腥草、艾葉、五味子等對大腸埃希菌K88高度敏感。褚秀玲等[25]報道了烏梅、蘆薈、白頭翁對雞致病性E.coliO78抗菌活性較好，其余藥物存在敏感性。同一血型不同區(qū)域其敏感性也不同，不同血清的E.coli，感染的宿主(雞、豬)不同，對中藥敏感性也存在一定的差異性，中藥對E.coli的敏感性與血清型、區(qū)域、感染宿主有一定相關(guān)性。與中藥生長環(huán)境及所含的有效抑菌活性物質(zhì)、濃度有關(guān)，也與中藥的制備工藝有關(guān)，在制備中藥藥液過程中由于高溫滅菌也會破壞一些有效的成分，從而影響了試驗結(jié)果。

本研究對秦皇島地區(qū)分離的雞致病性E.coli地方流行株篩選出極度敏感的中藥，為進(jìn)一步研發(fā)復(fù)方中藥制劑防治雞致病性E.coli提供理論依據(jù)。

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Antibacterial Effects of Chinese Herbal Medicines on Pathogenic Escherichia coli in Chickens in Vitro

ZHANG Zhao-xing,LI Yun-yu,CHANG Chao-yue,ZHANG Xiang-zhai,SHI Qiu-mei,ZHANG Yan-ying,WU Tong-lei,ZHANG Zhi-qiang,JIA Qing-hui,LI Pei-guo

(KeyLaboratorryofPreventiveVeterinaryMedicineinHeibeiProvince,HebeiNormalUniversityofScienceandTechnology,Qinhuangdao,Hebei,066604,China)

In this study,theinvitroantibacterial effects of 25 Chinese herbal medicines on the local epidemic strains of pathogenicEscherichiacoliisolated from chickens in Qinhuangdao area were analyzed.The Chinese medicine solutions were prepared by the water extracting,and the concentration of the solution was diluted to 1 g/mL.The diameter of the inhibition zone was measured by the agar diffusion plate method.The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by modified trace dilution method and plate method.The results showed that the local strains of pathogenicE.coliwere extremely sensitive to 4 kinds of Chinese medicines,such asLonicerajaponica,Coptischinensis,PrunusmumeandSchisandrachinensis.The MIC of 4 kinds of extremely effective Chinese medicines were from 15.65 to 31.25 mg/mL;Other drugs had different degrees of sensitivities to the local strains of pathogenicE.coli.In conclusion,four kinds of Chinese medicines had good antibacterial effects on the local strains of pathogenicE.coliand it provided a theoretical basis on prevention and control of the local strains of pathogenicEscherichiacoliby Chinese medicines.

chicken;pathogenicEscherichiacoli; Chinese herbal medicine;invitroantibacterial test

2016-07-30

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊崗位項目(HBCT2013090203)；河北省研究生創(chuàng)新資助項目(2016-2017)；河北省科技支撐計劃項目(12220412D)

張召興(1988-)，男，河北威縣人，碩士研究生，主要從事動物病原微生物及其防控研究。*通訊作者

S852.612;S853.74

A

1007-5038(2017)03-0063-05