陜西省部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型全基因組的遺傳變異分析

徐麗美，付明哲，何亞鵬，許信剛，于三科，張 琪

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

陜西省部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型全基因組的遺傳變異分析

徐麗美，付明哲，何亞鵬，許信剛，于三科*，張 琪*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為了解陜西省豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的遺傳變異情況，根據(jù)GenBank登錄的PCV2全基因組序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，從陜西省部分地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)疑似PCV2感染的病豬采集病料9份，應(yīng)用PCR擴(kuò)增PCV2的全基因，其中6份為陽(yáng)性，并對(duì)擴(kuò)增的6個(gè)PCV2全基因組序列進(jìn)行測(cè)序和序列分析?；驕y(cè)序表明，PCV2基因組全長(zhǎng)為1 767 bp；對(duì)6株病毒序列進(jìn)行同源性比較，6個(gè)毒株全基因之間核苷酸同源性為98.3%～100%，與GenBank上已發(fā)表的國(guó)內(nèi)外毒株全基因組比較，同源性為96.3%～97.8%；與近幾年陜西株比較發(fā)現(xiàn)基因變異程度不穩(wěn)定，與2013年分離株(KX352154.1)同源性最高，2015年分離株(KX352159.1)次之，反而與2014年分離株(KX068219.1)最低；對(duì)6個(gè)毒株的ORF1和ORF2基因進(jìn)行同源性比較，6個(gè)毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分別為98.1%～100%和98.2%～100%，與GenBank上已發(fā)表的國(guó)內(nèi)外參考株ORF1和ORF2基因進(jìn)行同源性比較，同源性分別為97.6%～99.8%和91.5～96.0%。陜西省流行的PCV2基因組較為保守，變異不大，同源性很高。

豬圓環(huán)病毒2型；全基因；序列分析

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)可引起感染豬的食欲下降,精神萎靡,喜臥、不愿走動(dòng),最典型癥狀是后肢及會(huì)陰等區(qū)域的皮膚會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則的紅紫斑或丘珍,有吋亦會(huì)在背部等地方出現(xiàn)。豬群感染PCV2后,會(huì)導(dǎo)致整體免疫力下降并與該地流行的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、豬皮炎及腎病綜合癥(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、豬繁殖障礙(Porcine reproductive failure)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease syndrome,PRDC)、豬增生性壞死性肺炎(Porcine necrotizing pneumonia,PNP)、豬先天性震顫(Porcine congenital tremor，PCT)等多種疾病有關(guān)[1-5]，造成養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。PCV2為單股環(huán)狀DNA分子，無(wú)囊膜，全基因1 767 bp或1 768 bp，編碼589個(gè)氨基酸殘基，基因組結(jié)構(gòu)有11個(gè)開放閱讀框(ORF1-ORF11)。有研究認(rèn)為，目前除ORF1、ORF2與ORF3的功能研究較為清楚外，其他ORF的功能尚不十分透徹[6]。其中已知ORF1和ORF2是PCV2最大的兩個(gè)開放閱讀框，ORF1具有高保守性，而ORF2變異性較高[7]，分別編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白和Rep′以及病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Cap[8-9]。同一血清型不同毒株的核酸序列同源性大于90%，非常保守，PCV對(duì)于環(huán)境的抵抗力與耐受性在研究其致病機(jī)理和免疫防控方面有重要作用[2，10-12]。自1991年在加拿大報(bào)道了首例PMWS以來(lái)，該病現(xiàn)已在世界各地都有報(bào)道，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，加之，雖然PCV2的滅活苗在部分國(guó)家已經(jīng)上市，但免疫成效未知，而且成本較高，所以還未廣泛使用，因此，必須加大對(duì)豬圓環(huán)病毒的關(guān)注。了解不同地區(qū)PCV2毒株間的遺傳差異，對(duì)了解PCV2的流行變異情況并采取有效的預(yù)防控制措施具有重要意義。豬圓環(huán)病毒不同分離株的遺傳變異分析對(duì)疫苗研究、致病機(jī)理研究具有基礎(chǔ)作用，本文對(duì)陜西省部分地區(qū)檢測(cè)到的PCV2測(cè)序，并進(jìn)行遺傳變異分析，旨在了解陜西地區(qū)PCV2的遺傳變異情況，為PCV2的流行病學(xué)調(diào)查提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 從陜西省楊陵、寶雞、隴縣、榆林、漢中、戶縣等地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)表現(xiàn)有嚴(yán)重呼吸困難、皮膚有紫紅色斑塊的疑似PCV2感染的病死仔豬，采集肺臟、脾臟作為病料。經(jīng)過(guò)檢測(cè)得PCV2陽(yáng)性樣品6份，分別命名為YL-4、BJ-11、LX-12、YUL-14、HZ-X、HX-L。

1.1.2 主要試劑 血液/組織/細(xì)胞提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；2×TaqMasterMix、DNA MarkerDL 2 000，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PCV2的全基因，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)覆蓋全基因的1對(duì)特異性引物。上游引物F1 5′-CCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3′；下游引物R1 5′-CCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3′，擴(kuò)增PCV2長(zhǎng)度為1 767 bp的全基因。引物由Invitrogen上海貿(mào)易有限公司合成，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒基因組DNA的提取 取肺臟和脾臟于病料研磨器中，研磨勻漿后，于-20 ℃/37 ℃反復(fù)凍融3次，取200 μL凍融過(guò)的懸浮液，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取病毒基因組DNA，提取的DNA置 -20 ℃保存，備用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 以提取的病毒基因組DNA 6 μL為模板，總體積50 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增全基因組。PCR反應(yīng)參數(shù)為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.4 序列測(cè)定 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳，經(jīng)檢驗(yàn)有6個(gè)陽(yáng)性毒株，將這6株陽(yáng)性毒株的PCR產(chǎn)物送于上海英俊生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.5 序列比對(duì)分析 利用DNA Star-MegAlign軟件和Blast比對(duì)6個(gè)毒株全基因組序列并與Gen-Bank已收錄的國(guó)內(nèi)外PCV2毒株進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建核苷酸同源性分析表和遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCV2全基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以提取病料的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到了6個(gè)相應(yīng)的目的片段，大小均為1 767 bp，大小與預(yù)期片段一致(圖1)。

2.2 全基因序列同源性分析

應(yīng)用DNA Star-MegAlign分析軟件對(duì)6株P(guān)CV2的全基因核苷酸進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見圖2。6個(gè)分離毒株全基因均有1 767個(gè)核苷酸，編碼589個(gè)氨基酸。6個(gè)毒株之間核苷酸同源性為98.3%～100%。與GenBank上已發(fā)表的國(guó)內(nèi)外分離株比較，同源性為96.3%～97.8%，其中與英國(guó)分離株(AY484416.1、AY651850.1)同源性為96.8%～97.1%；與中國(guó)分離株(KJ599673.1、KX068222.1、KC515025.1、GQ911590.1、HQ395046.1)同源性為96.3%～97.8%；與日本分離株(KR054744.1)同源性為97.0%～97.7%；與陜西最近幾年分離株比較發(fā)現(xiàn)和分離株(KX352154.1)同源性最高，可達(dá)98.9%～99%，與分離株(KX068219.1)同源性低，為97.1%～97.6%。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～6. PCV2擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1-6.PCR products of PCV2

圖1 PCV2全基因PCR擴(kuò)增

Fig.1 Amplification of PCV2 complete gene by PCR

圖2 PCV2全基因核苷酸同源性分析

2.3 全基因遺傳進(jìn)化樹分析

應(yīng)用DNA Star-MegAlign生物分析軟件完成PCV2全基因的遺傳進(jìn)化樹，由進(jìn)化樹可以看出(圖3)，這6株分離株均在同一個(gè)進(jìn)化分支上，其中LX-12和YUL-14遺傳關(guān)系最近，這與PCV2全基因核苷酸同源性分析中得到的結(jié)果100%相一致，而與中國(guó)分離株(KC515025.1)關(guān)系最遠(yuǎn)；這6株分離株均與(KX352154.1)陜西分離株進(jìn)化關(guān)系近。

圖3 PCV2全基因核苷酸序列進(jìn)化樹

2.4 ORF1基因序列同源性分析

利用DNA Star-MegAlign生物分析軟件對(duì)6株P(guān)CV2的ORF1基因核苷酸同源性分析,結(jié)果見圖4，6個(gè)毒株的ORF1基因長(zhǎng)度為945個(gè)核苷酸，編碼315個(gè)氨基酸。6個(gè)毒株ORF1之間核苷酸同源性為98.1%～100%，與GenBank上已發(fā)表的國(guó)內(nèi)外分離株比較，同源性為97.6%～99.8%，其中與美國(guó)分離株(AF055391.1)同源性為98.4%～99.0%，與英國(guó)分離株(AY484413.1)的同源性為97.9%～98.6%，與澳大利亞分離株(AY754019.1、AY754022.1)的同源性為97.9%～99.0%，與加拿大分離株(EF394779.1、EU747085.1)的同源性為97.6%～98.2%，與德國(guó)分離株(HQ231328.1)的同源性為97.8%～98.2%，與中國(guó)分離株(FJ644562.1、FJ870973.1、KR149370.1、KU041850.1)的同源性為97.8%～99.8%。

2.5 ORF1基因遺傳進(jìn)化樹分析

應(yīng)用DNA Star-MegAlign生物軟件完成PCV2 ORF1基因的遺傳進(jìn)化樹，從ORF1基因的遺傳進(jìn)化樹可以看出(圖5)，這6株里面的BJ-11、LX-12、YUL-14、HX-L分離株的ORF1基因在同一個(gè)進(jìn)化分支上，其中LX-12和YUL-14同源遺傳關(guān)系最近，這與PCV2全基因核苷酸同源性分析中得到的結(jié)果100%相一致，而與加拿大分離株(EF394779.1、EU747085.1)和英國(guó)分離株(AY484413.1)、中國(guó)南京分離株(FJ644562.1)的遺傳遠(yuǎn)近關(guān)系一樣。

圖4 ORF1基因核苷酸同源性分析

2.6 ORF2基因序列同源性分析

通過(guò)生物分析軟件對(duì)6株P(guān)CV2的ORF2基因核苷酸同源性分析，結(jié)果見圖6，6個(gè)毒株的ORF2基因長(zhǎng)度為702個(gè)核苷酸，編碼234個(gè)氨基酸。6個(gè)毒株之間核苷酸的同源性為98.2%～100%，與GenBank上已發(fā)表的國(guó)內(nèi)外分離株比較，同源性可達(dá)91.5%～95.7%，其中與英國(guó)分離株(AY484413.1)的同源性達(dá)到94.8%～95.7%，與澳大利亞分離株(AY754019.1、AY754022.1)同源性為92.0%～95.5%，與加拿大分離株的同源性可達(dá)94.4%～95.3%，與德國(guó)分離株(HQ231328.1)的同源性為94.6%～95.4%，與中國(guó)分離株(AY146992.1、FJ644932.1、HM003569.1、KU041850.1)同源性可達(dá)91.5%～96.0%。

2.7 ORF2基因遺傳進(jìn)化樹分析

用DNA Star-MegAlign生物軟件完成PCV2 ORF2基因的遺傳進(jìn)化樹，從ORF2基因的遺傳進(jìn)化樹可以看出(圖7)，這6株里面的BJ-11、YL-4、HX-L分離株的ORF2基因遺傳關(guān)系最近，LX-12和YUL-14的ORF2基因遺傳關(guān)系最近，這與PCV2全基因核苷酸同源性分析中得到的結(jié)果均為100%相一致，而HZ-X分離株與上面的5株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國(guó)臺(tái)灣分離株(AY146992.1)的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，其次是與澳大利亞分離株(AY754022.1)。

圖5 ORF1核苷酸序列進(jìn)化樹

3 討論

近年來(lái)，PCV2在美國(guó)、歐洲等一些國(guó)家和地區(qū)廣泛存在并蔓延。我國(guó)于2000年首次報(bào)道后，國(guó)內(nèi)有關(guān)PCV2的報(bào)道持續(xù)不斷，該病呈現(xiàn)全球性流行趨勢(shì)，PCV2滅活疫苗雖已在少數(shù)國(guó)家地區(qū)上市，但效果目前并不很明確，并且由于成本較高，對(duì)于整個(gè)養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)還很難使用疫苗進(jìn)行預(yù)防，這對(duì)該病的防控造成了很大難度。通過(guò)對(duì)不同地區(qū)的PCV2毒株的序列分析、比對(duì)，可了解該病毒的遺傳、進(jìn)化及流行情況，對(duì)疫苗研究、致病機(jī)理研究具有重要意義。

圖6 ORF2基因核苷酸同源性分析

圖7 ORF2核苷酸序列進(jìn)化樹

本研究克隆的6個(gè)毒株全基因組與曹勝波等[13]對(duì)豬圓環(huán)病毒2型豫A株的全基因組進(jìn)行的序列分析結(jié)果相符合，全基因組為1 767 bp。全基因核苷酸同源性分析，6個(gè)毒株之間的同源性為98.3%～100%，與近3年陜西株比較發(fā)現(xiàn)，與2014年分離株(KX068219.1)同源性最低，反而與2013年分離株(KX352154.1)同源性最高，說(shuō)明基因突變程度不穩(wěn)定，但陜西省PCV2的基因遺傳變異不大，非常保守；與GenBank上已收錄的國(guó)內(nèi)外毒株同源性可達(dá)96.3%～97.8%，同源性也很高，差異不大，這可能與國(guó)際之間的經(jīng)濟(jì)貿(mào)易有關(guān)系。全基因進(jìn)化樹中，6個(gè)毒株與GenBank(KC515025.1)中國(guó)廣東分離株遺傳距離最遠(yuǎn)，而與日本分離株(KR054744.1)的遺傳關(guān)系最近，推測(cè)陜西省的PCV2病毒有可能是來(lái)源于市場(chǎng)貿(mào)易，所以應(yīng)該加大對(duì)市場(chǎng)貿(mào)易貨物流動(dòng)的檢測(cè)和監(jiān)督。

從已拼接完整、正確的6個(gè)毒株的全基因組中比對(duì)出其部分基因組ORF1、ORF2，與GenBank上已收錄的國(guó)內(nèi)外毒株進(jìn)行序列分析、比對(duì)，結(jié)果ORF1基因與GenBank上已公布的國(guó)內(nèi)外分離株比較，同源性為97.6%～99.8%，ORF2基因與GenBank上已發(fā)表的國(guó)內(nèi)外分離株比較，同源性為91.5%～95.7%，表明ORF2基因的確比ORF1變異性高，與Morozov I等[7]研究結(jié)果相符，對(duì)PCV2后續(xù)疫苗研發(fā)、致病機(jī)理研究具有重要意義。

目前雖然對(duì)PCV2投入了大量人力、物力來(lái)進(jìn)行研究，但對(duì)于其致病機(jī)理、功能結(jié)構(gòu)并未完全掌握，所以PCV2一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本文針對(duì)陜西省部分地區(qū)疑似為PCV2的病豬采集病料，進(jìn)行全基因遺傳進(jìn)化分析，來(lái)補(bǔ)充陜西省PCV2的流行情況，為后續(xù)PCV2的研究奠定基礎(chǔ)。

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Genetic Variation Analysis of Complete Genome of Porcine Circovirus Type 2 in Partial Regions of Shaanxi Province

XU Li-mei,FU Ming-zhe,HE Ya-peng,XU Xin-gang,YU San-ke,ZHANG Qi

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100China)

In order to understand heredity and variation of porcine circovirus virus type 2 in Shaanxi province,according to the published complete genome sequence of PCV2 in GenBank,a pair of specific primers were designed and synthesized.The complete genes were amplified with PCR and sequenced from partial regions of Shaanxi province.The six PCV2 complete genome sequences were amplified.The six PCV2 complete genome sequences were 1 767 bp in length.The homology of nucletide sequences of the six strains were 98.3%-100%.Compared with PCV2 complete genome sequences in GenBank,the homology were 96.3%-97.8%.Compared with Shaanxi strains,the instability of gene mutation was found.The ORF1 and ORF2 of six strains had 98.1%-100% and 98.2%-100% similarities respectively. Compared with PCV2 ORF1 and ORF2 genome sequences in GenBank, the homology were 97.6%-99.8% and 91.5%-96.0%.Genes of PCV2 in Shaanxi are very conservative and similar.

Porcine circovirus type 2; complete genome; sequence analysis

2016-08-18

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-095)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(Z109021427)

徐麗美(1994-)，女，甘肅會(huì)寧人，碩士，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.2

A

1007-5038(2017)03-0022-05