橡膠林土壤微生物碳代謝功能多樣性及其變化

周玉杰，李建華，張廣宇，王 寧，譚文麗，王永鵬，王春燕，曹啟民

（1. 海南省農(nóng)墾科學(xué)院，海南 ?？?570206；2. 海南省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，海南 海口 570311）

土壤微生物是土壤的重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)的分解者，它積極參與生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，在維持生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能方面起著極其重要的作用，研究土壤微生物群落功能多樣性是理解生態(tài)系統(tǒng)過程的核心內(nèi)容之一［1］。隨著全球生態(tài)系統(tǒng)CO2氣體濃度的持續(xù)升高，如何減少碳釋放及增強(qiáng)固碳能力成為當(dāng)前人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。而土壤是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最大的碳庫(kù)，同時(shí)也是最活躍的碳庫(kù)之一，土壤微生物影響著土壤有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化，是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的“關(guān)鍵”和“動(dòng)力”［2］，但兩者之間的相互作用復(fù)雜而微妙，土壤微生物與土壤碳循環(huán)以及其他生態(tài)服務(wù)功能之間的關(guān)系及相互作用機(jī)制一直以來(lái)都是土壤生態(tài)學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。開展土壤微生物碳代謝功能多樣性研究，將有利于推進(jìn)微生物介導(dǎo)的土壤生態(tài)系統(tǒng)乃至整個(gè)陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)機(jī)制及其他生態(tài)服務(wù)功能研究。

我國(guó)自1904年開始引種橡膠樹以來(lái)，經(jīng)過長(zhǎng)期的艱苦奮斗，打破了橡膠樹種植的傳統(tǒng)禁區(qū)，形成了海南、云南、廣東三大主要植膠區(qū)。橡膠樹成為我國(guó)熱帶地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物，橡膠林生態(tài)系統(tǒng)已成為較大的人工生態(tài)系統(tǒng)之一，橡膠林對(duì)維持區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)平衡發(fā)揮著重要的作用。但我國(guó)的第一代橡膠林基本上都是在自然植被的土地上建立起來(lái)的，橡膠樹作為多年生喬木，在長(zhǎng)期大規(guī)模替代自然植被背景下，隨著時(shí)間的不斷推移，是否對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響？在實(shí)際研究工作當(dāng)中，土壤生態(tài)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的微生物往往被忽視。

土壤微生物對(duì)不同碳源利用能力的差異，是描述土壤微生物群落特征的一個(gè)重要指標(biāo)，土壤微生物群落功能多樣性可反映群落總體的動(dòng)態(tài)變化。以往土壤微生物功能多樣性的測(cè)定方法主要有磷脂脂肪酸法 （PLFA）［3］和基于PCR的分子生物學(xué)分析方法［4］，但這兩種方法技術(shù)要求高，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)靈活性較差，又難以在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量樣品處理?；谔即x的 Biolog-ECO 技術(shù)為微生物群落功能多樣性定量研究提供了一種靈敏度高、分辨性強(qiáng)、更加簡(jiǎn)便快捷的方法，該方法已廣泛應(yīng)用于不同土壤類型、不同植被物種下土壤及不同管理策略下的農(nóng)業(yè)土壤微生物群落功能多樣性研究中［5-8］。因此，我們以海南大豐農(nóng)場(chǎng)6個(gè)不同林齡橡膠林樣地為研究對(duì)象，運(yùn)用Biolog-ECO技術(shù)對(duì)橡膠林土壤微生物群落碳代謝功能多樣性進(jìn)行研究，分析橡膠林土壤微生物群落碳代謝功能多樣性在割膠前后的變化，以及對(duì)不同林齡橡膠林土壤微生物群落碳代謝功能多樣性的差異，為橡膠林土壤生態(tài)系統(tǒng)健康提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究區(qū)域位于海南省瓊中黎族苗族自治縣大豐農(nóng)場(chǎng)。該區(qū)域?yàn)闊釒ШＱ蠹撅L(fēng)氣候，年平均溫度22.8℃，最冷月平均氣溫為 16～18℃，年平均降雨量2 278 mm。試驗(yàn)選取林齡5、10、13、18、25、30年常規(guī)栽培橡膠林作為試驗(yàn)樣地，位于 19°14′～19°16′E、109°44′～109°45′N，海拔 175～207 m，每個(gè)樣地面積 1 hm2。橡膠樹栽培品系為PR107，株行距3 m×7 m。各樣地的立地條件、栽培管理措施和割膠制度基本一致。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品采集時(shí)間為割膠前（5月）和割膠后（11月）。在每個(gè)林齡橡膠林樣地內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)采樣點(diǎn)，采集0～20 cm土層土壤，充分混合，迅速裝入樣品袋并置于冰塊上，土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后去掉植物根系和石塊，放入4℃恒溫冰箱內(nèi)低溫保存。

1.3 土壤微生物功能多樣性測(cè)定

取樣后48 h內(nèi)采用含有31種碳源的Biolog-ECO微平板培養(yǎng)技術(shù)測(cè)定土壤微生物群落碳代謝功能多樣性。具體方法為：稱取新鮮土樣5.00 g，加入45 mL無(wú)菌水后在搖床上振蕩30 min，然后將土壤樣品稀釋至10-3，再?gòu)闹腥?50 μL該懸浮液接種到Biolog-ECO 微平板的每一個(gè)孔中，1 h內(nèi)測(cè)定第一次吸光值，最后將接種的微平板放在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)216 h，每隔24 h采用BIOLOG讀數(shù)儀（BIOLOG，Hayward，USA）測(cè)定各孔在750 nm和590 nm 波長(zhǎng)下的光吸收值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)Biolog-ECO 微平板的孔數(shù)變化和每孔顏色變化的程度與土壤微生物群落功能密切相關(guān)。根據(jù)相關(guān)研究文獻(xiàn)的方法［9］，測(cè)試板孔中溶液吸光值平均顏色變化率（AWCD），計(jì)算方法為：

式中，C為每個(gè)培養(yǎng)基孔的光密度值，R為對(duì)照孔的光密度值，n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)，Biolog-ECO 微平板n為31。

采用培養(yǎng)至72 h的Shannon-Wiener指數(shù)表征土壤中微生物群落多樣性，McIntosh指數(shù)表征土壤中微生物群落豐富度。

式中，Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與所有反應(yīng)孔相對(duì)吸光值總和的比值，即；ni為第i孔的相對(duì)吸光值（C-R）。

根據(jù)有關(guān)Biolog-ECO微平板培養(yǎng)時(shí)間對(duì)微生物相關(guān)數(shù)據(jù)分析的影響研究結(jié)果［10］，以及本研究中各樣地土壤微生物的AWCD增長(zhǎng)曲線圖，多樣性指數(shù)選擇AWCD值處于快速增長(zhǎng)時(shí)（72 h）的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用EXCEL2003計(jì)算土壤微生物AWCD值及多樣性指數(shù)，DPS7.05進(jìn)行方差分析，SPSS19.0進(jìn)行主成分分析，Canoca4.5軟件進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物AWCD值及變化

AWCD值可作為衡量微生物群落整體活性的有效指標(biāo)，AWCD值的變化速率和最終達(dá)到值反映了土壤微生物群落利用碳源的能力。AWCD值越大，表明微生物的碳代謝活性越高，利用碳源的能力越強(qiáng)。培養(yǎng)0～24 h，各樣地土壤微生物AWCD值變化均較小，培養(yǎng)24～72 h土壤微生物AWCD值快速增長(zhǎng)，培養(yǎng)72 h后增長(zhǎng)速度減慢并一直延續(xù)到144 h，培養(yǎng)144 h 后增長(zhǎng)速率趨于平穩(wěn)（圖1）。

圖1 橡膠林土壤微生物AWCD增長(zhǎng)曲線

培養(yǎng)至72 h 的AWCD值，除林齡5年橡膠林割膠前后差異不明顯外，林齡10、13、18、25、30年橡膠林5月份均高于11月份。不同林齡橡膠林AWCD值在割膠前后的變化不同。割膠前（5月）林齡10、30年橡膠林極顯著高于林齡5、18、25年橡膠林，林齡13年橡膠林極顯著高于林齡18年橡膠林，其他林齡橡膠林間差異不顯著；而割膠后（11月）AWCD值以林齡5年橡膠林最高，其次為林齡8年和25年橡膠林，林齡10、13、30年橡膠林較低。其中林齡5年橡膠林顯著高于林齡25年橡膠林，極顯著高于林齡10、13、25、30年橡膠林；林齡18年和25年橡膠林極顯著高于林齡10、13、30年橡膠林（圖2）。

圖2 不同林齡橡膠林土壤微生物AWCD值

2.2 土壤微生物碳代謝功能多樣性指數(shù)

2.2.1 割膠前后土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)變化 割膠前林齡10、13、30年橡膠林Shannon-Wiener指數(shù)極顯著高于割膠后，林齡5、18、25年橡膠林間割膠前與割膠后的Shannon-Wiener指數(shù)差異不明顯。McIntosh指數(shù)除林齡5年橡膠林外，其他林齡橡膠林間割膠前McIntosh指數(shù)均極顯著高于割膠后（圖3）。

圖3 不同林齡橡膠林土壤微生物Shannon-Wiener指數(shù)

2.2.2 不同林齡橡膠林土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)變化 割膠前Shannon-Wiener指數(shù)以林齡30年橡膠林最高，林齡18年橡膠林最低，林齡5、10、13、25年橡膠林間差異不顯著。McIntosh指數(shù)以林齡30年橡膠林最高，林齡5年橡膠林最低，林齡10、13、18、25年橡膠林間差異不顯著（圖3、圖4）。

割膠后Shannon-Wiener指數(shù)以林齡5年橡膠林最高，林齡13年橡膠林最低，林齡10、18、25、30年橡膠林間差異不顯著。McIntosh指數(shù)以林齡5年橡膠林最高，其次為林齡18年和25年橡膠林，林齡10、13、30年橡膠林較低（圖3、圖4）。

圖4 不同林齡橡膠林土壤微生物McIntosh指數(shù)

2.3 橡膠林土壤微生物對(duì)碳源的利用及變化

2.3.1 橡膠林土壤微生物對(duì)碳源的利用 對(duì)31種碳源的利用情況進(jìn)行主成分分析，其中前3個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為86.077%，說明主成分1、2、3是變異的主要來(lái)源。3個(gè)主成分的特征值分別為15.649、7.663、1.976，貢獻(xiàn)率分別為50.480%、4.720%和6.373%（圖5）。

圖5 橡膠林土壤微生物利用碳源的主成分分析

通過計(jì)算31種碳源的綜合得分，可以看出橡膠林土壤微生物群落利用D-甘露醇、腐胺、苯乙胺、R-羥丁酸及衣康酸能力較強(qiáng)（綜合得分＞0.5），而對(duì)環(huán)式糊精、吐溫80、甘氨酰-L-谷氨酸、α-D乳糖、肝糖、D-木糖和赤蘚糖醇利用能力較差，綜合得分低于平均水平（圖6）。

圖6 橡膠林土壤微生物利用31種碳源的綜合得分

土壤微生物對(duì)不同類型碳源的利用能力程度，有助于更全面地了解土壤微生物群落功能特性［11-12］。將Biolog-ECO微平板上的31種碳分為糖及衍生物類（Carbohydrates）、氨基酸類（Amino acids）、羧酸類（Carboxylic acids）、酚酸類（Phenolic acids）、多聚物類（Polymers）和胺類（Amines）六大類型［13］。CCA分析表明，橡膠人工林土壤微生物群落對(duì)胺類、羧酸類、氨基酸類和糖及衍生物類碳源利用能力較強(qiáng)，而對(duì)酚酸類和多聚物類碳源的利用能力較差（圖7）。

2.3.2 橡膠林土壤微生物利用碳源變化 通過主成分分析，計(jì)算橡膠林土壤微生物群落利用碳能力的綜合得分，可以看出割膠前橡膠林土壤微生物群落利用碳的能力要高于割膠后。不同林齡橡膠林土壤微生物群落在割膠前后利用碳源的變化也不同，割膠前為林齡30年＞10年＞25年＞13年＞18年＞5年，而割膠后為林齡5年＞18年＞25年＞30年＞13年＞10年（圖8）。

3 結(jié)論與討論

3.1 橡膠林土壤微生物活性及利用碳源類型

在培養(yǎng)0～168 h內(nèi)，橡膠林土壤微生物AWCD值隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致，即 AWCD 值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)呈現(xiàn)出微生物常規(guī)生長(zhǎng)曲線［14-15］。

圖7 橡膠林土壤微生物利用碳源類型CCA排序

橡膠林土壤微生物群落利用D-甘露醇、腐胺、苯乙胺、R-羥丁酸及衣康酸的能力較強(qiáng)，而利用環(huán)式糊精、吐溫80、甘氨酰-L-谷氨酸、α-D乳糖、肝糖、D-木糖和赤蘚糖醇的能力較差?？偟膩?lái)看，橡膠林土壤微生物群落對(duì)羧酸類、氨基酸類、胺類和糖及衍生物類利用能力較強(qiáng)，而對(duì)酚酸類和多聚物類的利用能力較差。這與其他天然次生林和人工林利用碳的類型基本一致，以往研究即得出土壤微生物利用率最高的是糖類、氨基酸類和羧酸［16-17］，并認(rèn)為糖類、氨基酸類和羧酸類是區(qū)分土壤微生物群落功能多樣性最主要和最敏感的碳源［18］。

圖8 橡膠林土壤微生物利用碳源的綜合得分

3.2 割膠對(duì)橡膠林土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響

除林齡5年橡膠林外，林齡10、13、18、25、30年橡膠林割膠前的AWCD值均高于割膠后；割膠前Shannon-Wiener指數(shù)和McIntosh指數(shù)均以林齡30年橡膠林最高；割膠后Shannon-Wiener指數(shù)和McIntosh指數(shù)均以林齡5年橡膠林最高；不同林齡橡膠林土壤微生物群落利用碳能力割膠前為林齡30年＞10年＞25年＞13年＞18年＞5年，而割膠后為林齡5年＞18年＞25年＞30年＞13年＞10年。說明割膠前橡膠林土壤微生物AWCD值、多樣性指數(shù)和碳源利用能力要高于割膠后，割膠導(dǎo)致處于膠乳生產(chǎn)期的林齡10、13、18、25、30年橡膠林土壤微生物碳代謝功能多樣性下降，而林齡5年橡膠林由于尚未割膠，其土壤微生物功能多樣性未受到割膠的影響，因此在割膠后林齡5年橡膠林的土壤微生物功能多樣性要高于其他林齡橡膠林。割膠降低了土壤微生物群落的活性和碳代謝功能多樣性，其可能與割膠致使土壤養(yǎng)分大量流失有關(guān)，以往研究即認(rèn)為土壤微生物群落功能多樣性與土壤養(yǎng)分密切相關(guān)［19-21］。

土壤微生物的活性和功能多樣性降低是反映土壤生態(tài)系統(tǒng)質(zhì)量和人類活動(dòng)脅迫效應(yīng)的重要生態(tài)指標(biāo)［22］。健康土壤是橡膠樹正常生長(zhǎng)的保證，而土壤微生物多樣性則是維持土壤健康和土壤質(zhì)量的關(guān)鍵。因此，提高土壤微生物群落的活性和功能多樣性，可以提高土壤肥力和結(jié)構(gòu)，從而提高橡膠林的經(jīng)濟(jì)效益。建議根據(jù)不同林齡橡膠林的特點(diǎn)進(jìn)行膠林土壤培肥改良，為土壤微生物創(chuàng)造良好的生長(zhǎng)環(huán)境，以改善橡膠林土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)橡膠林的可持續(xù)生產(chǎn)能力；同時(shí)重視橡膠林土壤微生物功能多樣性的研究，揭示橡膠人工林土壤生態(tài)系統(tǒng)“植物—土壤—微生物”三者之間的關(guān)系，為橡膠林生態(tài)系統(tǒng)健康以及土壤生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)機(jī)制研究提供理論支撐。

［1］張其水，俞新妥. 杉木連栽林地營(yíng)造混交林后土壤微生物的季節(jié)性動(dòng)態(tài)研究［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)，1990，10（2）：121-126.

［2］鄭華，歐陽(yáng)志云，方志國(guó)，等. Biolog-ECO在土壤微生物群落功能多樣性研究中的應(yīng)用［J］.土壤學(xué)報(bào)，2004，41（3）：456-461.

［3］宋風(fēng)雅，梁鵬，何其光，等. 應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)分析橡膠林土壤真菌種群動(dòng)態(tài)變化［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（6）：2469-2477.

［4］譚宏偉，楊尚東，吳俊，等. 紅壤區(qū)桉樹人工林與不同林分土壤微生物活性及細(xì)菌多樣性的比較［J］. 土壤學(xué)報(bào)，2015，51（3）：575-584.

［5］Garland J L，Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon source utilization［J］. Applied and environmental microbiology，1991，57（8）：2351-2359.

［6］Zak J C，Willing M R，Moorhead D L，et al.Functional diversity of microbial communities：a quantitative approach［J］. Soil Biology and Biochemistry，1994，26（9）：1101-1108.

［7］胡可，王利賓. BIOLOG微平板技術(shù)在土壤微生態(tài)研究中的應(yīng)用［J］. 土壤通報(bào)，2007，38（4）：819-821.

［8］董立國(guó)，蔣齊，蔡進(jìn)軍，等. 基于Biolog-ECO技術(shù)不同退耕年限苜蓿地土壤微生物功能多樣性分析［J］. 干旱區(qū)研究，2011，28（4）：630-637.

［9］鄧曉，李勤奮，侯憲文，等. 香蕉枯萎病患病與健康蕉園土壤微生物群落功能多樣性的比較研究［J］. 土壤通報(bào)，2013，44 （2）：355-362.

［10］賈夏，董歲明，周春娟. 微生物生態(tài)研究中Biolog Eco微平板培養(yǎng)時(shí)間對(duì)分析結(jié)果的影響［J］. 應(yīng)用基礎(chǔ)與工程科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，21（1）：10-19.

［11］Choi K H.Comparison of two kinds of Biolog microplates（GN and ECO）in their ability to distinguish among aquatic microbial communities［J］. Journal of Microbiological Methods，1999，36（3）：203-213.

［12］Preston-Mafham J，Boddy L，Randerson P F. Analysis of microbial community functional diversity using sole-carbon-source utilization profiles-a critique［J］. Fems Microbiology Ecology，2002，42（1）：1-14.

［13］孔濱，楊秀娟. Biolog生態(tài)板的應(yīng)用原理及碳源構(gòu)成［J］. 綠色科技，2011（7）：231-234.

［14］王洪媛，管華詩(shī)，江曉路. 微生物生態(tài)學(xué)中分子生物學(xué)方法及T-RFLP技術(shù)研究［J］. 中國(guó)生物工程雜志，2004，24（8）：42-47.

［15］范瑞英，楊小燕，王恩姮，等.黑土區(qū)不同林齡落葉松人工林土壤微生物群落功能多樣性的對(duì)比研究［J］. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（2）：63-68.

［16］胡嬋娟，傅伯杰，劉國(guó)華，等. 黃土丘陵溝壑區(qū)典型人工林下土壤微生物功能多樣性［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（2）：727-733.

［17］李小容，韋金玉，陳云，等. 海南島不同林齡的木麻黃林地土壤微生物的功能多樣性［J］. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，38（6）：608-618.

［18］鄭華，陳法霖，歐陽(yáng)志云，等. 不同森林土壤微生物群落對(duì)Biolog-GN板碳源的利用［J］. 環(huán)境科學(xué)，2007，28（5）：1126-1130.

［19］韓世忠，高人，李愛萍，等. 中亞熱帶地區(qū)兩種森林植被類型土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，26（7）：2151-2158.

［20］徐文嫻，趙從舉，朱敏捷，等. 海南島桉樹人工林土壤微生物功能多樣性特征［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（7）：65-72.

［21］字洪標(biāo)，劉敏，阿的魯驥，等. 三江源區(qū)不同建植年限對(duì)人工草地土壤微生物功能多樣性的影響. 生態(tài)學(xué)雜志，2017，36（ 4） ：978-987.

［22］李智衛(wèi)，王超，陳偉，等. 不同樹齡蘋果園土壤微生物生態(tài)特征研究［J］. 土壤通報(bào)，2011，42（2）：302-306.