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    載紫杉醇聚合物膠束的制備工藝優(yōu)化

    2017-03-09 08:05:36魏淑明范清英
    關(guān)鍵詞:載藥偶聯(lián)藥量

    魏淑明, 范清英, 宋 煜

    紫杉醇(paclitaxel,PTX)是首個(gè)從天然植物中分離出來(lái)的抗癌藥,在臨床上廣泛應(yīng)用于卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等[1-3]。但由于PTX在水中的溶解度極低(<1 μg/mL)[4],導(dǎo)致其口服吸收差,且PTX在體內(nèi)不能專一作用于腫瘤細(xì)胞,對(duì)正常細(xì)胞也有殺傷毒性。目前國(guó)內(nèi)上市應(yīng)用的均為注射劑,常用制劑Taxol?采用聚氧乙烯蓖麻油和無(wú)水乙醇助溶,增加溶解度的同時(shí)也帶來(lái)了毒性、高敏性等不良反應(yīng)[5],從而使臨床治療受到限制。近年新上市的PTX新制劑,較傳統(tǒng)注射劑Taxol?雖能降低或去除過(guò)敏反應(yīng)、減小藥物毒副作用,但在提高腫瘤靶向性及耐受劑量方面仍表現(xiàn)不足。因此,制備合適的載體,增加PTX的溶解度,改善靶向性,降低給藥系統(tǒng)的毒性,是需要解決的問(wèn)題。

    普通納米藥物載體可以在一定程度上提高藥物的水溶性,并通過(guò)EPR效應(yīng)靶向于腫瘤細(xì)胞,但在實(shí)際應(yīng)用中到達(dá)靶位的效果并不理想。若能結(jié)合腫瘤特異性靶向策略,則藥物靶向腫瘤的能力能進(jìn)一步提高。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)是一種對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高親和性的天然高分子材料,可以與癌細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體如CD44蛋白結(jié)合,因而HA及其衍生物被廣泛用于抗腫瘤藥的靶向遞送體系的研究中,在增加藥物溶解度及提高靶向性上具明顯優(yōu)勢(shì)[6]。甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)為甘草的主要成分,具有抗病毒、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種的藥理學(xué)活性[7],同時(shí),Negishi等證實(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜組分中含有大量GA特異結(jié)合位點(diǎn)[8],使得GA及其衍生物具有肝靶向性[9]。可以推測(cè),以HA與GA兩者結(jié)合的GA(HSG)偶聯(lián)物載體若能順利包載PTX制納米膠束制劑,在體內(nèi)遞送中可以利用EPR效應(yīng)的被動(dòng)靶向、腫瘤細(xì)胞CD44受體和GA受體發(fā)揮協(xié)同主動(dòng)靶向等多種靶向機(jī)制來(lái)增加PTX在腫瘤部位尤其是肝的靶向蓄積作用,從而提高治療指數(shù),減少不良反應(yīng)。筆者以HSG偶聯(lián)物為載體材料,制備載PTX的PTX/HSG聚合物膠束,優(yōu)化HSG偶聯(lián)物對(duì)PTX的載藥能力,并考察其穩(wěn)定性。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1試劑 HSG偶聯(lián)物(實(shí)驗(yàn)室自制);透析袋(批號(hào):151220,上海市綠鳥(niǎo)科技發(fā)展有限公司);PTX原料藥(批號(hào):902-1308001,福建南方制藥股份有限公司);PTX標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):100382-201603,純度99.9%,中國(guó)食品藥品檢定研究院);水為蒸餾水;其它試劑均為分析純。

    1.1.2儀器 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-2D,寧波市芝生物科技股份有限公司);激光粒徑測(cè)定儀(NICOMPTM380ZLS,美國(guó)Santa Barbara公司);高效液相色譜儀(LC-20AT,日本島津公司);雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1901,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);透射電子顯微鏡(H7650,日本日立公司)。

    1.2方法

    1.2.1包封率和載藥量的測(cè)定

    1.2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 精密稱取適量PTX標(biāo)準(zhǔn)品,甲醇溶解、配制溶液,按照《中國(guó)藥典》2015年版附錄中紫外分光光度法,以甲醇為空白溶液,在200~500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

    1.2.1.2色譜條件 色譜柱:Diamonsil?Platisil ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(75∶25,V/V);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):227 nm;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:30 ℃。

    1.2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取PTX 10 mg置于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,得200 μg/mL的儲(chǔ)備液。逐步稀釋配制濃度分別為20,10,5,2,1,0.5 μg/mL的PTX溶液,0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣,按1.2.1.2項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,記錄峰面積A。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),濃度(C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程。

    1.2.1.4回收率 配制高、中、低(20,5,0.5 μg/mL)3種濃度的PTX標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入偶聯(lián)物,按1.2.1.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率。

    1.2.1.5精密度 配制高、中、低濃度(分別為20,5,0.5 μg/mL)的PTX標(biāo)準(zhǔn)溶液,在同1天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次及連續(xù)5 d進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度。

    1.2.1.6供試品溶液的制備及包封率和載藥量測(cè)定 將PTX/HSG聚合物膠束溶液3 000 r/min離心15 min,得上清液過(guò)濾,取濾液100 μL置10 mL容量瓶中用甲醇稀釋至刻度,過(guò)0.45 μm濾膜,取續(xù)濾液按1.2.1.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定并計(jì)算載入膠束中的PTX量。按以下公式計(jì)算包封率(encapsulation efficiency,EE)、載藥量(drug loading,DL):

    1.2.2載藥工藝考察

    1.2.2.1載藥方法篩選

    1.2.2.1.1直接溶解法 精密稱取18 mg的HSG偶聯(lián)物于西林瓶中,加蒸餾水3 mL溶解,加入PTX藥物粉末10 mg,在磁力攪拌器上劇烈攪拌15 min,然后于冰浴下探頭超聲30 min后用蒸餾水透析過(guò)夜。透析袋中倒出膠束溶液,3 000 r/min離心15 min,上清液過(guò)0.8 μm濾膜過(guò)濾,即得PTX/HSG聚合物膠束溶液。

    1.2.2.1.2乳化法 精密稱取18 mg的HSG偶聯(lián)物于西林瓶中,加蒸餾水3 mL溶解,逐滴滴加濃度為25 mg/mL的PTX的二氯甲烷溶液400 μL于上述載體溶液中,在磁力攪拌器上劇烈攪拌15 min,然后于冰浴下探頭超聲30 min后室溫敞口攪拌過(guò)夜,膠束溶液3 000 r/min離心15 min,上清液過(guò)0.8 μm濾膜過(guò)濾,即得PTX/HSG聚合物膠束溶液。

    1.2.2.1.3透析法 精密稱取18 mg的HSG偶聯(lián)物于西林瓶中,加蒸餾水3 mL溶解,逐滴滴加濃度為25 mg/mL的PTX的乙醇溶液400 μL于上述載體溶液中,在磁力攪拌器上劇烈攪拌15 min。然后于冰浴下探頭超聲30 min后用蒸餾水透析過(guò)夜。透析袋中倒出膠束溶液,3 000 r/min離心15 min,上清液過(guò)0.8 μm濾膜,即得PTX/HSG聚合物膠束溶液。

    1.2.2.2藥載比的篩選 通過(guò)1.2.2.1項(xiàng)實(shí)驗(yàn),在得出最適合的載藥方法的情況下,暫設(shè)載體濃度為6 mg/mL,超聲時(shí)間為30 min,考察HSG∶PTX (w/w)比例分別1.8∶1,1.6∶1,1.3∶1,1∶1時(shí)HSG偶聯(lián)物的載藥情況,篩選出最佳藥載比。

    1.2.2.3載體濃度的影響 固定其他變量,考察不同載體濃度(4,6,8 mg/mL)對(duì)HSG偶聯(lián)物増溶PTX的影響。

    1.2.2.4超聲時(shí)間的影響 固定其他變量,考察不同超聲時(shí)間(20,30,40,50 min)對(duì)HSG偶聯(lián)物載藥能力的影響。

    1.2.2.5優(yōu)化條件的驗(yàn)證 按照優(yōu)化后的處方工藝制備3批PTX/HSG載藥膠束,以包封率、粒徑等為指標(biāo)驗(yàn)證載藥工藝。

    1.2.3形態(tài)學(xué)研究 取載藥膠束溶液,滴至覆有碳支持膜的銅網(wǎng)上,停留2 min,以濾紙吸去多余溶液,滴加2%的磷鎢酸溶液負(fù)染2 min,自然干燥,透射電鏡(transmission electron micros cope,TEM)觀察PTX/HSG載藥膠束粒徑大小及粒子形態(tài)。

    1.2.4穩(wěn)定性的考察 將PTX/HSG聚合物膠束溶液置4 ℃冰箱儲(chǔ)存,10 d內(nèi)測(cè)定其粒徑、載藥量與包封率,以包封率、粒徑等為指標(biāo)判斷PTX/HSG聚合物膠束是否發(fā)生聚集。

    2 結(jié) 果

    2.1PTX檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 通過(guò)紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)掃描可得,PTX的最大吸收波長(zhǎng)為227 nm,由此確定PTX醇的色譜檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。

    2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 對(duì)不同濃度(C)的PTX溶液所得的峰面積(A)進(jìn)行線性回歸,得到回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線A=38 676C-1 387.5(r=0.999 9),結(jié)果表明,在0.5~20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好,符合定量檢測(cè)要求。

    2.3回收率及精密度 高、中、低3個(gè)濃度水平的PTX樣品的回收率與精密度良好,符合含量測(cè)定方法學(xué)要求(表1)。

    2.4載藥工藝的考察

    2.4.1載藥方法篩選 通過(guò)直溶法與乳化法制備的PTX/HSG膠束包封率低且粒徑大,使用透析法制備的載藥膠束具有較高的包封率而且粒徑與多分散指數(shù)(polydispersity index,PI)小,因此透析法是更適合HSG偶聯(lián)物載藥的方法(表2)。

    表1回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    Tab1Recovery and precision of the experimental results

    ρ理論值(μg·mL-1)平均回收率%日內(nèi)精密度RSD%日間精密度RSD%0.5100.4±1.61.61.8599.9±0.80.80.92099.9±0.20.20.2

    n=3. RSD:相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.

    表2 不同載藥方法對(duì)載藥膠束粒徑及包封率等的影響

    n=3. PI:多分散指數(shù);Zeta:Zeta電位.

    2.4.2藥載比的篩選 藥載比PTX∶HSG由1∶1.8增至1∶1.3時(shí),PTX投入量越多,載藥膠束的載藥量及包封率逐漸提高,而載藥膠束粒徑變化卻不明顯。但當(dāng)藥載比達(dá)1∶1時(shí),載藥量雖然仍在提高但包封率卻在下降,而且此時(shí)的粒徑也明顯變大,說(shuō)明HSG膠束對(duì)PTX的載藥能力已經(jīng)達(dá)到飽和。而藥載比為1∶1.3時(shí),載藥膠束有較高的載藥量與包封率。因此,綜合以上數(shù)據(jù)可以得出:藥載比PTX∶HSG=1∶1.3為最佳藥載比(表3)。

    2.4.3載體濃度的影響 載體濃度大小影響聚合物膠束的載藥量、包封率及粒徑。當(dāng)載體濃度為6 mg/mL時(shí),載藥膠束的載藥量及包封率顯著優(yōu)于其它濃度,且粒徑較小,故選擇6 mg/mL作為載藥工藝中載體的濃度(表4)。

    表3 不同藥載比對(duì)載藥膠束粒徑及包封率等的影響

    n=3. PTX:紫杉醇; HSG:透明質(zhì)酸-甘草次酸; PI:多分散指數(shù); Zeta:Zeta電位.

    表4 不同載體濃度對(duì)載藥膠束粒徑及包封率等的影響

    n=3. HSG:透明質(zhì)酸-甘草次酸; PI:多分散指數(shù); Zeta:Zeta電位.

    2.4.4載藥超聲時(shí)間的影響 超聲時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)載藥膠束的載藥量與包封率影響并不大,但卻能影響載藥膠束的粒徑。超聲時(shí)間太短(20 min),載藥粒徑偏大。而超聲時(shí)間達(dá)30 min,至此過(guò)后延長(zhǎng)超聲時(shí)間,粒徑不再有太大變化。綜合上述結(jié)果且為節(jié)省時(shí)間,最終選擇載藥超聲時(shí)間為30 min(表5)。

    2.4.5優(yōu)化條件的驗(yàn)證 按照篩選出的最佳載藥工藝制備3批PTX/HSG載藥膠束(表6),平均載藥量為(38.63±0.42)%,平均包封率為(83.19±1.23)%,平均粒徑為(192.2±0.5)nm,重現(xiàn)性良好。

    表5 不同載藥超聲時(shí)間對(duì)載藥膠束粒徑及包封率等的影響

    n=3. PI:多分散指數(shù);Zeta:Zeta電位.

    表6 優(yōu)化條件的驗(yàn)證結(jié)果

    PI:多分散指數(shù);Zeta:Zeta電位.

    2.5形態(tài)學(xué)研究 TEM圖可以看出,PTX/HSG載藥膠束呈近球形,粒徑在190 nm左右,粒徑分布較均勻(圖1)。

    TEM:透取電鏡.圖1 PTX/HSG膠束TEM圖Fig 1 TEM image of PTX/HSG micelles

    2.6穩(wěn)定性的考察 PTX/HSG聚合物膠束10 d內(nèi)粒徑略有增加,載藥量與包封率有所降低,但未發(fā)生明顯變化(表7),說(shuō)明10 d內(nèi)PTX/HSG聚合物膠束避光4 ℃條件下在水溶液中較穩(wěn)定,膠束并未發(fā)生聚集。

    3 討 論

    包封率和載藥量是評(píng)價(jià)聚合物膠束制備工藝的重要指標(biāo)。測(cè)定包封率的關(guān)鍵就是將被包封藥物與游離藥物分離,常用的有超濾法、透析法和反透析法等[10-11]。本研究采用離心(3 000 r/min,15 min)過(guò)膜(0.8 μm微孔濾膜)的方法來(lái)分離游離PTX。由于聚合物膠束將疏水性藥物包封于其疏水內(nèi)核,在測(cè)定包封藥物時(shí)必須將藥物完全釋放出來(lái)。根據(jù)PTX和HSG載體的溶解特性,本研究采用甲醇作為破乳劑。

    表7 PTX/HSG膠束的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

    PTX:紫杉醇; HSG:透明質(zhì)酸-甘草次酸; PI:多分散指數(shù);Zeta:Zeta電位; PI:多分散指數(shù).

    聚合物膠束的載藥方法有很多,在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中,應(yīng)當(dāng)根據(jù)藥物以及聚合物的理化性質(zhì),以及制備膠束的特點(diǎn)等因素選擇合適的制備方法。因?yàn)槠渌闹苽浞椒ㄈ缁瘜W(xué)結(jié)合法與靜電作用對(duì)載體及藥物的要求比較多,這也大大限制了這兩種方法的應(yīng)用,故本研究在載藥方法的篩選中只考慮物理法。

    聚合物膠束在4 ℃的環(huán)境中短期儲(chǔ)存較穩(wěn)定,推測(cè)若長(zhǎng)期在水性環(huán)境中保存,可能發(fā)生藥物聚集、融合、藥物滲漏等,導(dǎo)致藥物穩(wěn)定性變差、貯存期短,不能滿足臨床使用對(duì)藥物制劑穩(wěn)定性的要求,而將聚合物膠束制成凍干粉可有效解決此類問(wèn)題,今后課題組將對(duì)凍干工藝進(jìn)行研究。

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