水熱法合成氮、鈷雙摻雜的熒光碳點及其性能研究

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系， 福州 350004；2. 福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心， 福州 350002)

傳統(tǒng)的量子點(Quantum dots，QDs)，由于其極小的粒徑而產(chǎn)生尺寸效應(yīng)和量子限域效應(yīng)，被激發(fā)以后能發(fā)射熒光，因此被廣泛應(yīng)用于分析檢測、光學(xué)成像方面。但是傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點如CdSe/ZnS型量子點，由于含有重金屬元素而具有一定的毒性，可能會對細(xì)胞與環(huán)境產(chǎn)生危害，從而限制了它的應(yīng)用。碳點(carbon dots，CDs)是以碳元素為前體，比以往的量子點更安全，對生物分子的干擾小，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的量子點而被應(yīng)用到光學(xué)成像[1]、生物醫(yī)學(xué)[2]及分析檢測[3]領(lǐng)域。

2004年Xu[4]等在制備單壁碳納米管過程中，首次發(fā)現(xiàn)了一種具有熒光性能的碳納米顆粒。2006年Sun[5]等首次采用激光刻蝕法制備粒徑為5 nm左右的碳點，該法可通過調(diào)節(jié)激光器脈沖能量和時間來調(diào)控碳點的大小，但需要昂貴的實驗儀器且量子產(chǎn)率較低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)[6]。2008年Zhao等[7]在水溶液中用電化學(xué)氧化石墨棒的方法制備熒光碳點。2009年Zhu等[8]用微波法合成熒光碳點，該方法簡便、經(jīng)濟。2010年Zhang等[9]以L-抗壞血酸為碳源利用水和乙醇的混合液為溶劑，在密閉的反應(yīng)釜中加熱一定時間來制備碳點，由于設(shè)備簡單且條件可控，從而實現(xiàn)碳點熒光發(fā)射的調(diào)控。

近年來，科學(xué)家們希望找到制備較為簡便，造價更為低廉的方法來制備性能優(yōu)異的碳點，并將其成功應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、光電學(xué)、生命科學(xué)[10-12]等領(lǐng)域。最近研究表明[13]碳點的粒徑與表面特征對其性質(zhì)有至關(guān)重要的影響。小粒徑的碳點比表面積大，表面發(fā)光位點也較多。因此小粒徑的碳點發(fā)光強于大粒徑的碳點，進一步表明碳點發(fā)光是與表面相關(guān)的。另外，表面含有大量含氧基團如(羥基、羧基等)的碳點具有良好的水溶性且易于實現(xiàn)進一步功能化，良好的水溶性是納米材料表現(xiàn)出低毒性[14]的首要條件。本實驗以能同時提供C、N、Co元素的VB12為合成前驅(qū)體，采用一步水熱法制備水溶性熒光碳點，通過紫外-可見吸收光譜(UV-vis)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、X射線光電子能譜(XPS)表征可知所制備的碳點表面含有大量羧基。最后，實驗采用肝癌細(xì)胞(Hep G2)通過Cell counting kit 8(簡稱CCK-8)實驗法測定碳點的細(xì)胞毒性。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

維生素B12：sigma公司；2-氨基吡啶：上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液：海克龍Hyclone公司；PB緩沖液：0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，用NaOH溶液和H3PO4調(diào)至不同的pH緩沖液；PBS緩沖液：分別稱取KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加蒸餾水約800 mL ，用濃鹽酸調(diào)pH至7.4后定容到1 L。3-(4，5-二甲基噻唑-2) 2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液：0.0075 g MTT，用1.5 mL DMSO溶解；透析袋，上海綠鳥有限公司。上述試劑如無特別說明，均為分析純。

YZ-HR-25ML反應(yīng)釜，北京巖征生物科技有限公司；UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司；F-4600型熒光分光光度計，日本日立公司；Nicolet 380 紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技；Tecnai G2 F20場發(fā)射透射電子顯微鏡，美國 FEI 公司；LabRAM HR800激光共聚焦拉曼光譜儀，法國Horiba Jobin Yvon公司；Thermo ESCALAB 250XI 電子能譜儀，美國賽默飛世爾科技；BS110S電子分析天平，美國Sartorius 公司；Neofuge 23R臺式高速冷凍離心機，上海力新儀器有限公司；pHS-3E型精密酸度計，上海雷磁儀器廠；Multiskan Mk3全自動酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技。

2.2 熒光碳點的制備

首先精密稱取0.1355 g VB12，緩慢加入50 mL去離子水，配制成2 mmol/L的紅色透明溶液，存放在50 mL玻璃瓶中，4 ℃冷凍避光保存。移取10 mL上述溶液于25 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)襯中，于烘箱中反應(yīng)并控制一定的水熱溫度與時間進行合成碳點。反應(yīng)結(jié)束后，待溶液自然冷卻至室溫，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至11.0后于25 ℃ 12000 r條件下離心10 min除去大顆粒物質(zhì)，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液在轉(zhuǎn)速10000 r/min下的超濾管(截留分子量為3 kd)超濾30 min。取超濾管下層分子量< 3kd的液體得到顆粒較為澄清溶液即為氮、鈷雙摻雜的碳點固體。

2.3 熒光量子產(chǎn)率的測定

熒光量子產(chǎn)率(fluorescent quantum yield)的測定是以2-氨基吡啶為參比物質(zhì)，通過測量碳點和2-氨基吡啶的稀溶液在碳點最佳激發(fā)波長下所得的積分熒光強度和該激發(fā)波長下的吸光度值(吸光度值應(yīng)小于0.1)。其計算公式為：

ΦX=ΦST*(GradX/GradST)*(ηX2/ηST2)

其中，ФX為待測物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，ФST為已知參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；GradX和GradST分別表示待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強度與吸光度作圖工作曲線的斜率；ηX和ηST分別表示待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的折光系數(shù)，0.1 mol/L 2-氨基吡啶的熒光量子率為60%，0.1 mol/L 硫酸水溶液和碳點水溶液的折光系數(shù)相同，均為 1.33。

2.4 碳點的細(xì)胞毒性研究

碳點具有較好的生物相容性和低細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性用Hep G2細(xì)胞通過CCK-8分析測定。CCK-8試劑中含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它可被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物。用全自動酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定其吸光度，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而作為碳點細(xì)胞毒性判斷依據(jù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 水熱溫度的影響

水熱法是在密封的壓力容器中，提供一個在常壓下無法達(dá)到的特殊物理化學(xué)環(huán)境，使前驅(qū)體在反應(yīng)系統(tǒng)中生成核結(jié)晶[15]。提高反應(yīng)溫度或延長反應(yīng)時間均可以促進VB12的碳化[16]。

首先對水熱反應(yīng)溫度進行考擦，實驗中發(fā)現(xiàn)較低溫度(160和180℃)下合成的碳點溶液放置在 305 nm紫外燈下觀察，所發(fā)出的熒光十分微弱。當(dāng)溫度升高至200～250℃后，熒光強度明顯增大?？梢娝疅釡囟葘μ键c的合成起著至關(guān)重要的作用，且高溫有利于碳點的快速生成。圖1為VB12溶液在200～250℃條件下水熱4 h制備得到碳點溶液的熒光光譜圖。其中插圖為碳點溶液在紫外燈照射下的圖片。由圖看出，碳點發(fā)藍(lán)色熒光，當(dāng)溫度由180℃升到 250℃時，其熒光強度不斷增強，發(fā)射波長無明顯變化。這可能是因為在較高的反應(yīng)溫度下制備的碳點其表面的氧化程度越高，帶了更多的缺陷發(fā)光位點。通過計算不同溫度(180～250℃)、4 h條件下合成碳點的熒光量子產(chǎn)率，在高溫250℃下熒光量子產(chǎn)率達(dá)8.16%(見表1)。

圖1 不同合成溫度下碳點的熒光光譜

3.2 水熱時間的影響

實驗還對水熱時間對碳點熒光的影響進行了考察，選擇了一系列水熱反應(yīng)時間(見表1)。表1為不同條件下制備的碳點熒光量子產(chǎn)率。隨著反應(yīng)時間的增加，熒光強度呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。由表1可知，隨著反應(yīng)溫度的升高和反應(yīng)時間的延長，熒光量子產(chǎn)率逐漸增大。值得注意的是，當(dāng)溫度升高至250℃后，反應(yīng)1 h的熒光量子產(chǎn)率大于200℃與220℃下反應(yīng)4 h的熒光量子產(chǎn)率。此外在240℃、6 h 條件下所合成的碳點，其熒光量子產(chǎn)率為7.56%，仍然小于250℃、4 h條件下合成的碳點?？梢娚邷囟忍键c的熒光量子產(chǎn)率的提高明顯比延長反應(yīng)時間來得有效，可以在較短時間內(nèi)得到熒光效率更高的碳點，縮短反應(yīng)周期，提高反應(yīng)效率。

表1 不同條件合成碳點的熒光量子產(chǎn)率

3.3 碳點的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜

圖2A為250℃下反應(yīng)4 h合成碳點的紫外吸收光譜，從圖中可以看到碳點溶液在275 nm處有吸收峰，這是由于碳點結(jié)構(gòu)中C=C發(fā)生了π→π*躍遷所產(chǎn)生的。圖2B為碳點熒光光譜，隨著激發(fā)波長的不斷增大，碳點的熒光強度先增大后減小，發(fā)射波長隨激發(fā)波長的改變并未發(fā)生明顯變化，最大激發(fā)波長為275 nm。圖2C為碳點最佳激發(fā)波長和最佳發(fā)射波長對比圖，由圖可知碳點溶液的最佳激發(fā)波長和最佳發(fā)射波長為275 nm和380 nm，激發(fā)波長與發(fā)射波長之間存在很大的斯托克位移(105 nm)，可有效避免激發(fā)峰與發(fā)射峰的重疊，減小干擾，有利于碳點作為熒光納米探針用于分析檢測。

3.4 碳點的形貌表征

碳點水溶液呈墨綠色透明狀，且長期靜置后無明顯沉淀，可知所制備的碳點具有良好的水溶性。圖3A為碳點的高分辨透射電鏡圖，由圖可知，碳點呈規(guī)則的單分散球形，平均粒徑為3.26 nm，可均勻分散在水溶液中。晶格間距為0.26 nm，查文獻(xiàn)[15]可知與石墨的(100)晶面層間距一致(圖3B)。

圖2 碳點的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜A.碳點溶液的紫外-可見吸收光譜；B.碳點溶液的熒光光譜；C.碳點溶液的最佳激發(fā)發(fā)射波長

圖3 碳點的高分辨透射電鏡(A)和粒徑分布圖(B)

3.5 碳點的紅外表征

圖4為碳點的紅外表征圖，由圖可知，碳點在1726 cm-1處有吸收，說明有C=O的存在；在3153 cm-1處的吸收峰對應(yīng)-OH的伸縮振動峰，該峰強而鈍表明碳點表面的羥基間有氫鍵生成；1398 cm-1為C=N的伸縮振動峰；1629 cm-1為N-H的吸收峰；需要說明的是，結(jié)合1726 cm-1處的C=O峰及3153 cm-1處較寬的-OH吸收峰，說明碳點表面存在-COOH；綜上所述，可知碳點表面含有-OH、C=O、-COOH和C=N等官能團。C=N來自前驅(qū)體維生素B12中與金屬離子Co2+螯合的C=N鍵，我們可推測C=N→Co2+螯合鍵部分未遭到破壞，由此初步猜測在水熱反應(yīng)過程后，所制備的CDs中的Co2+仍以螯合物形式存在。

圖4 碳點的紅外光譜圖

3.6 碳點的X-射線光電子能譜

實驗采用X射線光電子能譜(XPS)對C-dots所含元素進行分析。圖5為碳點的X-射線光電子能譜，對圖5A中的O1S峰C1S峰N1S峰分別進行分峰擬合得到O1S(圖5B)、C1S(圖5C)、N1S(圖5D)和Co(圖5E)的高分辨圖譜。由于Na元素所致的強背景峰，使微弱的Co元素峰在總XPS圖中幾乎不可見。圖5A中的284.8 eV、397.9 eV、531.1 eV、778.6 eV分別代表C 1s、N 1s、O 1s、Co4d的結(jié)合能，由圖譜可知碳點表面含有大量的C、O和N元素，Co含量極少，這也許同前驅(qū)體VB12的元素組成(C63H88CoN14O14P)有關(guān)。

3.7 pH對碳點熒光強度的影響

實驗考察pH(2.0～12.0)對碳點溶液熒光強度的影響。結(jié)果表明合成碳點在pH 2.0～5.0條件下熒光強度較高，碳點溶液的pH為1～2，碳點表面含有羧基短鏈，在酸性條件下碳點基本處于單分散狀態(tài)，熒光強度最大且穩(wěn)定。然后在pH 6.0之后，碳點熒光強度隨著pH的增大而不斷減小，這可能是由于碳點表面的羧基解離程度改變，影響了碳點的熒光強度。

3.8 CCK-8細(xì)胞毒性檢測

首先用RPM1-1640培養(yǎng)液將氮氣下保存的肝癌細(xì)胞(Hep G2)復(fù)蘇增殖并傳代，得到一定數(shù)量的細(xì)胞。用胰酶將其從培養(yǎng)基上消化下來，用RPM1-1640培養(yǎng)液配成一定濃度的細(xì)胞懸液。將肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄去上清液并用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，再在不同孔內(nèi)分別加入200 μL的12.5、25、50、100和

圖5 碳點的X-射線光電子能譜A.碳點的 XPS譜圖;B.O1S XPS譜;C.C1S XPS譜;D.N1S XPS譜;E.Co4d XPS譜

200 μg/mL 的培養(yǎng)液配制的碳點溶液，每個濃度設(shè)置5個平行孔。對照組加入200 μL的培養(yǎng)液，并設(shè)置6個空白孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出上述制備的培養(yǎng)板，棄除上清液并用PBS清洗后，往各孔中加入20 μL PBS緩沖液配制的MTT溶液和180 μL無血清的培養(yǎng)基，再次在37℃、5%CO2下培養(yǎng)4 h。最后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長處的吸光度，記錄并計算細(xì)胞存活率(ηviab)。計算公式：

ηviab=(Dsample-Dblank)/(Dcontrol-Dblank)×100%

式中：D為吸光度，下標(biāo)為sample的表示孔中加有碳點溶液。下標(biāo)為control的表示孔中未加碳點溶液，下標(biāo)為blank的表示孔中沒有加肝癌細(xì)胞。

如圖6所示，隨著碳點溶液濃度的增大，細(xì)胞存活率并未呈下降趨勢，甚至濃度達(dá)到200 μg/mL時，也沒有產(chǎn)生明顯的細(xì)胞生長抑制作用。從結(jié)果觀察到肝癌細(xì)胞在含有濃度為12.5 ～ 200 μg/mL碳點的培養(yǎng)基中的活度與空白對照組相當(dāng)，說明該碳點對肝癌細(xì)胞不但沒有毒性，還有微小的生長刺激性，可能是由于該碳點良好的水溶性與碳材料的化學(xué)惰性，使其具有極低的細(xì)胞毒性，且合成碳點中的Co2+以螯合物的形式存在，并不會對細(xì)胞產(chǎn)生生物毒性。

圖6 不同濃度CDs的細(xì)胞存活率

4 結(jié)論

本研究以VB12為合成前驅(qū)體，采用一步水熱法制備氮、鈷雙摻雜的熒光碳點，優(yōu)化水熱反應(yīng)時間和溫度對碳點熒光性能的影響，實驗發(fā)現(xiàn)250℃下反應(yīng)4 h合成的碳點熒光量子產(chǎn)率最高，可達(dá)8.16%，在紫外燈下碳點溶液呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光。合成碳點顆粒平均粒徑為3.26 nm，表面含有大量羧基，具有良好的水溶性和穩(wěn)定性。實驗考察pH對碳點熒光強度的影響，結(jié)果表明該碳點在pH2.0-5.0范圍內(nèi)熒光最強。最后實驗還進行了碳點的CCK-8細(xì)胞毒性檢測，結(jié)果表明該碳點具有極低的細(xì)胞毒性和良好生物相容性。以上所有結(jié)果表明，通過本實驗合成的氮、鈷摻雜碳點有望作為熒光納米探針應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。