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    葛根素對(duì)IL—1β?lián)p傷大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞一氧化氮及一氧化氮合成酶的影響

    2017-03-09 18:34:54楊洋劉勇
    云南中醫(yī)中藥雜志 2017年2期
    關(guān)鍵詞:葛根素一氧化氮骨性

    楊洋+劉勇

    摘要:目的 觀察葛根素(Pue)對(duì)IL-1β?lián)p傷大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞一氧化氮的影響。 方法 取雌性10日齡大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨作體外細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)后軟骨細(xì)胞隨機(jī)分成正常組、L-1β組、地塞米松組、Pue50組、Pue100組、Pue200組等6組。后5組分別加入IL-1β(5 μg/L)10 μmol、IL-1β(5 μg/L)10 μmol +地塞米松10-9 mol、IL-1β(5 μg/L)10 μmol +Pue50 μmol/L、IL-1β(5 μg/L)10 μmol+ Pue100 μmol/L、IL-1β(5 μg/L)10 μmol+Pue200 μmol/L,使用南京建成生物工程研究所的一氧化氮(NO)試劑盒和一氧化氮合成酶(iNOS)試劑盒檢測(cè)NO含量和iNOS活性。 結(jié)果 6組軟骨細(xì)胞的NO含量(μmol/L)分別為1.351、12.162、4.054、9.459、6.757、5.405,后4組與IL-1β組比較有明顯差異(P<0.05),且隨著劑量上升(50、100、200 μmol/L),軟骨細(xì)胞分泌的NO的含量越少。6組軟骨細(xì)胞的iNOS含量(U/mL)分別為0.535、1.069、0.713、1.069、0.891、0.713,后4組與IL-1β組比較有明顯差異(P<0.05),且隨著劑量上升(50、100、200 μmol/L),iNOS活性越低。 結(jié)論 葛根素是一良好的NO清除劑,其通過(guò)降低iNOS活性,減少NO生成,以達(dá)到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的目的,為防止骨性關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:葛根素;軟骨細(xì)胞;IL-1β;iNOS活性;NO含量

    中圖分類號(hào):R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1007-2349(2017)02-0083-03

    【Abstract】Objective: To observe the effect of puerarin on nitric oxide (NO) of articular chondrocytes in rats with IL-1β-induced injury. Methods: Chondrocytes were isolated from female 10-day-old rats and cultured in vitro. The chondrocytes were randomly divided into a normal group, a L-1β group, a dexamethasone group, a Pue50 group, a Pue100 group and a Pue200 group. The latter five groups were respectively given (5 μg/L) 10 μmol, IL-1 β (5 μg/L) 10 μmol+dexamethasone 10 μmol, IL-1 β (5 μg/L) 10 μmol/L, 10 μmol+Pue 100 μmol/L and 10 μmol+Pue 200 μmol/L of IL-1β (5 μg/L) and NO kit and iNOS kit made by Nanjing Jiancheng Biology Engineering Institute were used to detect NO content and iNOS activity. Results: The NO content (μmol/L) of chondrocytes of the six groups was 1.351, 12.162, 4.054, 9. 459, 6.757 and 5. 405 respectively. There were significant differences between the latter four groups and IL-1β group (P<0.05) (50 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L). With the rising of dose(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L), the content of NO produced by chondrocytes decreased. The iNOS content (U/mL) of the six groups of chondrocytes was 0.535, 1.069, 0.713, 1. 069, 0.891and 0.713 respectively. The iNOS content of the latter four groups were significantly different from those of IL-1β group (P<0.05). With the rising of the dose (50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L), the activity of iNOS became lower. Conclusion: Puerarin is a good NO scavenger, which can protect the articular chondrocytes by lowering iNOS activity and decreasing NO production, which provides a theoretical basis for preventing osteoarthritis.

    【Key words】puerarin, chondrocyte, IL-1β, iNOS activity, NO content

    骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的,以關(guān)節(jié)軟骨變性為其特征的慢性骨關(guān)節(jié)病。研究表明OA時(shí)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及滑膜內(nèi)一氧化氮(NO)水平明顯升高[1],NO通過(guò)抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白多糖的合成,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨逐漸粗糙而發(fā)生退變[2]。NO是由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)催化生成的,而其中誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)與OA關(guān)系密切。iNOS表達(dá)較高時(shí)則能催化NO水平持續(xù)升高。葛根素(Puerarin,Pue)是中藥葛根的提取物,也是葛根的主要有效成份之一,在上一部分實(shí)驗(yàn)中證實(shí)葛根素可以保護(hù)IL-1β?lián)p傷的軟骨細(xì)胞,并促進(jìn)其增殖?,F(xiàn)在筆者根據(jù)葛根素的作用和OA的發(fā)病機(jī)制,來(lái)探討葛根素對(duì)IL-1β?lián)p傷軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制:可能是通過(guò)降低iNOS活性從而減少NO的合成來(lái)達(dá)成的。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料及設(shè)備 SPF級(jí)10日齡大鼠(武漢同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)、生物倒置顯微鏡(重慶光電儀器總公司)、752紫外分光光度計(jì)(上海民怡儀器儀表有限公司)、臺(tái)式離心機(jī)(Heal Force)、微型漩渦混合器(上海凌儀實(shí)業(yè)有限公司)、恒溫水浴鍋(武漢金寶華科技有限公司)、移液槍(上海佳安分析儀器廠)。

    1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、胰蛋白酶(Amresco公司)、II型膠原酶(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、重組大鼠白介素-1β(rratIL-1β,PeproTech公司)、地塞米松磷酸鈉注射液(Solarbio公司)、葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)、無(wú)鈣鎂磷酸緩沖液(PBS)、一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(南京建成生物工程研究所)。

    1.3 軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代 取SPF級(jí)10日齡大鼠,脫頸處死后,在無(wú)菌條件下取出髖膝關(guān)節(jié)處的軟骨組織塊,于超凈工作臺(tái)內(nèi)置入含10%雙抗的PBS培養(yǎng)皿中,清洗一遍,再用不含雙抗的PBs清洗三遍。然后將軟骨組織塊移入EP管,向EP管中滴入2-3滴PBS,然后用眼科剪將組織塊剪至約1 mm3大小。將EP管中的PBS吸出,加入0.2%Ⅱ型膠原酶使組織塊處于懸浮狀態(tài),置于37℃條件下消化過(guò)夜。消化完成后,將EP管在振蕩器上振蕩2 min,使消化下來(lái)的細(xì)胞從組織中離散。離心棄上清,取出下層細(xì)胞加入盛10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后更換培養(yǎng)液,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,以后隔2天更換1次培養(yǎng)液,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿單層的80%-90%左右后進(jìn)入傳代培養(yǎng)。

    達(dá)到傳代條件后,將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸棄,用PBS沖洗2遍,加入0.25%胰蛋白酶2 mL消化5 min左右,在倒置顯微鏡下見細(xì)胞變圓后,立即棄去消化液終止消化,加入含血清的培養(yǎng)液沖洗、吹打,使細(xì)胞懸浮起來(lái),根據(jù)需要調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度分瓶接種于新的培養(yǎng)瓶中。置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)分組 ①正常軟骨細(xì)胞組;②IL-1β組,按濃度5 μg/L加入IL-1β10 μmol;③IL-1β(5 μg/L)10 μmol +地塞米松(10-9 mol/L);④、⑤、⑥IL-1β(5 μg/L)10 μmol +葛根素50、100、200 μmol/L。

    1.5 實(shí)驗(yàn)方法 取生長(zhǎng)良好的傳代軟骨細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化,用培養(yǎng)液配制成濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,每孔加200 μL,置于37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。待培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后,分別加入含IL-1β和藥物的培養(yǎng)基,共設(shè)6組,每組3孔。培養(yǎng)24 h后用南京建成生物工程研究所的NO試劑盒和iNOS試劑盒檢測(cè)NO含量和iNOS活性,具體操作方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均由SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料采用(x±s)表示,2組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn),P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 NO含量的檢測(cè) IL-1β能損傷軟骨細(xì)胞,增加NO的釋放量,同正常組比較有顯著差異性(P<0.01)。地塞米松和葛根素均能顯著減少NO的生成,而葛根素減少NO的生成呈劑量依賴性,劑量越高,分泌的NO越少,見表1。

    2.2 iNOS活性的檢測(cè) IL-1β?lián)p傷軟骨細(xì)胞后增強(qiáng)了iNOS的含量,同正常組相比差異有意義(P<0.05),地塞米松和葛根素均能顯著降低iNOS的含量(P<0.05),而葛根素降低iNOS的含量呈劑量依賴性,劑量越高,iNOS含量越低,表明葛根素能降低iNOS活性,同時(shí)葛根素劑量越高,iNOS活性越低,見表2。

    3 討論

    骨性關(guān)節(jié)炎(OA)又稱骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)病、老年性關(guān)節(jié)炎等,是一種常見的以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬和畸形為特點(diǎn),以關(guān)節(jié)軟骨變性為其特征的慢性骨關(guān)節(jié)病。我國(guó)正在進(jìn)入老齡化社會(huì),因而老年OA的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì),是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因[3]。一般認(rèn)為OA是在力學(xué)和生物學(xué)等因素的共同作用下,由于軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(ECG)及軟骨下骨三者之間分解和合成代謝失衡,從而引起軟骨損害、滑膜炎性改變?yōu)樘攸c(diǎn)的疾病。本病發(fā)病核心是從關(guān)節(jié)軟骨退行性改變逐步累及軟骨下骨質(zhì)、滑膜、關(guān)節(jié)囊等關(guān)節(jié)重要結(jié)構(gòu)。其中關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的病理基礎(chǔ)和核心。關(guān)節(jié)軟骨由較骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成,幾乎所有的致病因素均是通過(guò)影響這二者而致病的。近年發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子、蛋白酶分泌異常,導(dǎo)致軟骨退變,是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中心環(huán)節(jié)[4]。

    一氧化氮(nitric oxide,NO)作為一種氣體自由基,其產(chǎn)生路徑有很多,其能對(duì)細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用,同時(shí)正常組織也能被NO刺激而造成損傷[5]。骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)關(guān)節(jié)軟骨會(huì)產(chǎn)生大量的NO,而NO會(huì)對(duì)軟骨產(chǎn)生有害作用,主要表現(xiàn)于對(duì)蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成與分泌的抑制。NO是由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)催化生成的,而NOS可以分為三種,分別是誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合成酶(nNOS),其中iNOS與OA關(guān)系密切。Amin等在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)iNOS高表達(dá),認(rèn)為iNOS是由特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)合成的,如IL-1β、腫瘤壞死因子、和γ-干擾素等[6]。iNOS表達(dá)較高時(shí)則能催化NO水平持續(xù)升高,而NO通過(guò)抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白多糖的合成,造成軟骨損傷,最終導(dǎo)致OA的發(fā)生[7]。

    筆者在試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),軟骨細(xì)胞在受到IL-1β刺激后iN0S活性增強(qiáng),NO生成大量增加,印證了前期的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-1β?lián)p傷的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞N0生成遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)正常組,iNOS生成也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)正常組,反映了NO體系在受到IL-1β刺激后的連鎖反應(yīng),結(jié)合前一實(shí)驗(yàn)中IL-1β?lián)p傷組軟骨細(xì)胞增殖率的降低,印證了NO體系受到IL-1β刺激后發(fā)生連鎖性的反應(yīng),通過(guò)NO損傷軟骨細(xì)胞。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,地塞米松和葛根素在一定范圍內(nèi)都有清除N0、降低iNOS活性的效應(yīng),而葛根素保護(hù)效應(yīng)呈明顯的劑量依賴性。在本實(shí)驗(yàn)中,葛根素作為良好的NO清除劑,其通過(guò)降低iNOS活性,減少NO生成,以達(dá)到保護(hù)軟骨細(xì)胞的目的,為葛根素的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]王林,王大壽,穆瓊,等.臭氧治療對(duì)家兔骨性關(guān)節(jié)炎病變及NO含量的影響[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,35(4):349-351.

    [2]王聲.一氧化氮合成酶在骨關(guān)節(jié)炎研究中的新進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2012,6(19):117.

    [3]趙錦松,李小霞.骨性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)與診斷[J].解放軍保健醫(yī)學(xué)雜志,2005,3(7):135-137.

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    [6]Amin AR,di Cesare PE,Vyas P,et al.The expression and regulation of nitric oxide synthase in human osteoarthritis-affected chondrocytes:evidence for up-regulated neuronal nitric oxide synthase[J].Exp Med.1995,182:2097-2102.

    [7]李勇光,鄭婧,高宇,等.臭氧對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)兔軟骨細(xì)胞iNOS及MMP-1表達(dá)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2012,34(6):472-473.

    (收稿日期:2016-09-18)

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