貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)選及抑菌活性研究

王 燕,張志琪,徐紅穎,張 爽,王飛娟,蘇文香

(1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院,陜西咸陽(yáng) 712046;2.陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710062;3.內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010070)

貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)選及抑菌活性研究

王 燕1,張志琪2,徐紅穎3,張 爽1,王飛娟1,蘇文香1

(1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院,陜西咸陽(yáng) 712046;2.陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710062;3.內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010070)

采用水蒸氣蒸餾法對(duì)貫葉連翹花中揮發(fā)油進(jìn)行提取,以揮發(fā)油提取率為響應(yīng)值,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響提取工藝的參數(shù)(浸泡時(shí)間、提取時(shí)間和料液比)進(jìn)行考察,并利用三因素三水平響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)法確定了貫葉連翹花中揮發(fā)油的最優(yōu)提取工藝,即浸泡時(shí)間19 h,液固比9∶1 mL/g,提取時(shí)間10 h,該條件下貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取率為1.03 mL/100 g,與理論值1.10 mL/100 g僅相差2.73%。同時(shí)測(cè)試了該揮發(fā)油的抑菌活性,其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為9、10、12 mm,表明貫葉連翹花中揮發(fā)油有一定的抑菌活性。

貫葉連翹花,揮發(fā)油,水蒸氣蒸餾提取法,響應(yīng)曲面法,抑菌活性

貫葉連翹(HypericumperforatumL.)為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物,藥用歷史達(dá)兩千年之久,具有清熱利濕、疏肝解郁、抑菌止血等功效[1-2]。貫葉連翹含有多種活性成分如蒽醌類和黃酮類等,在抗抑郁、鎮(zhèn)痛、抗氧化等方面具有廣譜的藥理活性,研究亦表明金絲桃屬植物中揮發(fā)油均具有明顯的抗菌作用[3-4],因此貫葉連翹的抑菌等活性疑與含有的揮發(fā)油成分相關(guān)。

關(guān)于揮發(fā)油的提取、分析及應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)[5],目前已有關(guān)于貫葉連翹全草和地上部分揮發(fā)油的化學(xué)成分和藥理作用研究,且不同方法和不同藥源揮發(fā)油的提取效率、化學(xué)組成、含量和藥效等有所差異[6-7]。貫葉連翹花中含有豐富的揮發(fā)油,而關(guān)于花中揮發(fā)油的提取與抑菌活性研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。

水蒸氣蒸餾法具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)約成本、產(chǎn)品純度高及無(wú)有機(jī)溶劑殘留等特點(diǎn)[8-9],廣泛用于揮發(fā)油的提取研究。本研究擬采用該方法對(duì)貫葉連翹花中揮發(fā)油進(jìn)行提取,結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)法對(duì)工藝過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化,以提高產(chǎn)率;同時(shí)對(duì)貫葉連翹花中揮發(fā)油抑菌活性進(jìn)行研究,為貫葉連翹花資源在日用、食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)提供有力的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貫葉連翹花 購(gòu)自陜西漢中勉縣,經(jīng)陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院生藥學(xué)教研室雷國(guó)蓮教授鑒定,清洗后晾干、粉碎至40目,避光陰涼處保存,備用;無(wú)水乙醚和無(wú)水硫酸鈉等 均為國(guó)產(chǎn)分析純;LB培養(yǎng)基 蛋白胨10 g,酵母浸粉5 g,NaCl 10 g,加水至1000 mL,固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g,于121 ℃滅菌20 min。

9FZ-15B型多用粉碎機(jī) 富強(qiáng)機(jī)械制造有限公司;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器 陜西泰康生物科技有限公司;FA2204B型電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;YXQ-LS-50S型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海訊博實(shí)業(yè)有限醫(yī)療公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取方法 稱取20 g粉碎的貫葉連翹花于合適的圓底燒瓶中,加入一定量的蒸餾水密封,浸泡一定時(shí)間后,連接揮發(fā)油提取器和冷凝管,置于集熱式恒溫磁力攪拌器上,于125 ℃油浴加熱一定時(shí)間。揮發(fā)油提取完全后,以無(wú)水乙醚收集揮發(fā)油,并加入少量無(wú)水硫酸鈉(以不結(jié)晶為宜),蒸發(fā)乙醚可得到一定量亮黃色油狀液體，揮發(fā)油提取得率計(jì)算如下:

R=V/m×100

式中，R為揮發(fā)油提取得率,mL/100 g;V:揮發(fā)油體積,mL;m:藥材質(zhì)量,g。

1.2.2 揮發(fā)油提取的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 浸泡時(shí)間的影響 按照1.2.1揮發(fā)油提取方法,當(dāng)液固比為10∶1 mL/g,提取時(shí)間為12 h的條件下,研究不同浸泡時(shí)間(6、10、14、18、22、26 h)對(duì)貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的影響。

1.2.2.2 液固比的影響 按照1.2.1揮發(fā)油提取方法,當(dāng)浸泡時(shí)間為18 h,提取時(shí)間為12 h的條件下,研究不同液固比(4∶1、7∶1、10∶1、13∶1、16∶1、19∶1 mL/g)對(duì)貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的影響。

1.2.2.3 提取時(shí)間的影響 按照1.2.1揮發(fā)油提取方法,當(dāng)浸泡時(shí)間為18 h,液固比為10∶1 mL/g的條件下,研究不同提取時(shí)間(3、6、9、12、15、18 h)對(duì)貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取浸泡時(shí)間(A)、液固比(B)和提取時(shí)間(C)三個(gè)因素為影響揮發(fā)油提取率的主要因素,以-1、0和1分別表示因素的高中低三個(gè)水平。按照響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)方法(RSM)進(jìn)行因素水平安排和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與因素水平Table 1 Variables and levels of RSM

1.2.4 揮發(fā)油抑菌活性研究 采用濾紙片法初步測(cè)定水蒸氣蒸餾法提取的貫葉連翹花的揮發(fā)油對(duì)不同菌種(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)的活性,即將菌種接種到液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)。取100 μL菌懸液于9 cm平板上涂布均勻,向平板中央打3 mm的孔,向孔內(nèi)滴加5 μL揮發(fā)油,對(duì)照板加5 μL滅菌水,置于培養(yǎng)箱中(37 ℃,24 h)。觀察菌種的生長(zhǎng)情況并進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄,測(cè)量抑菌圈的直徑,重復(fù)3次[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SE)進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 浸泡時(shí)間對(duì)貫葉連翹花揮發(fā)油提取率的影響 考察浸泡時(shí)間對(duì)貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)浸泡時(shí)間低于10 h時(shí),揮發(fā)油提取率相對(duì)較低;隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng)至18 h時(shí),揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì);隨后隨著時(shí)間的增加,揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因可能是剛開(kāi)始時(shí),藥材組織細(xì)胞尚未充分膨脹,當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)18 h時(shí),藥材組織細(xì)胞膨脹,加速了細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的速率,促進(jìn)了揮發(fā)油的提取。揮發(fā)油得率下降的原因,也可能與實(shí)驗(yàn)過(guò)程溫度較高和實(shí)驗(yàn)季節(jié)的環(huán)境溫度偏高,揮發(fā)油分子運(yùn)動(dòng)速率加快易于散失到空氣中相關(guān)。因而選18 h為合適的浸泡時(shí)間。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effect of soaking time on yield of Hypericum perforatum L. flowers volatile oil

2.1.2 液固比對(duì)貫葉連翹花揮發(fā)油提取率的影響 由圖2可知,隨著液固比的增加,揮發(fā)油提取率增大,液固比為10∶1 mL/g時(shí)提取率最大;當(dāng)繼續(xù)增加液固比,揮發(fā)油提取率出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì),即溶劑(水量)的變化對(duì)揮發(fā)油提取率有一定影響。原因可能為水量少不能充分浸泡藥材原料,隨著水量的增加,藥材與水充分接觸,提取率增加;但當(dāng)加水量過(guò)多,加熱時(shí)溶液沸騰原料和揮發(fā)油沾壁,影響提取效果。因此,最適液固比選為10∶1 mL/g。

圖2 液固比對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effect of solvent to material ratio on yield of Hypericum perforatum L. flowers volatile oil

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)貫葉連翹花揮發(fā)油提取率的影響 從圖3可以看出,當(dāng)提取時(shí)間為3～9 h時(shí),貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取率出現(xiàn)快速增加的趨勢(shì),9 h時(shí)提取率達(dá)到最大值,這與提取剛剛開(kāi)始時(shí),由于溶劑與物料中揮發(fā)油濃度不同導(dǎo)致的擴(kuò)散驅(qū)動(dòng)力增大有關(guān);當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,提取率的變化趨勢(shì)較為平緩,即揮發(fā)油基本提取完全,這可能與提取貫葉連翹花中揮發(fā)油的過(guò)程,溶液體系達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡而致?lián)]發(fā)油提取率變化不大有關(guān)。說(shuō)明9 h是理想的揮發(fā)油提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of Hypericum perforatum L. flowers volatile oil

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 二次回歸模型方程的建立及方差分析 以貫葉連翹花中揮發(fā)油的提取率為考察指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)浸泡時(shí)間、液固比和提取時(shí)間等三個(gè)因素按照響應(yīng)曲面法三因素三水平,五個(gè)中心點(diǎn)的方法,即十七個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果,見(jiàn)表2。

經(jīng)過(guò)擬合的三元二次回歸方程為:

Y=-2.61125+0.093750A+0.14425B+0.42792C+1.25000E-003 AB+4.30556E-003AC-6.66667E-004BC-3.95833E-003A2-8.20000E-003B2-0.026667C2

二次方程回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 貫葉連翹花中揮發(fā)油提取工藝響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 RSM design arrangement and corresponding of volatile oil yield

2.2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化結(jié)果與分析 根據(jù)模型方程繪制的響應(yīng)曲面圖與標(biāo)準(zhǔn)殘差曲線等,結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4為影響貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率的因素之間交互作用的關(guān)系圖,可直觀的反映出因素交互作用對(duì)提取率的影響大小。圖4a中浸泡時(shí)間的曲線較為平緩,表明浸泡時(shí)間對(duì)提取率的影響較弱,液固比較浸泡時(shí)間對(duì)提取率的影響較強(qiáng),呈現(xiàn)先上升后減小的趨勢(shì),等高線圖反映出浸泡時(shí)間與液固比交互作用對(duì)提取率的影響較為顯著,與方差分析結(jié)果一致。圖4b中浸泡時(shí)間的曲線仍比較平緩,但隨著提取時(shí)間的增加提取率呈現(xiàn)大幅度增加,浸泡時(shí)間和提取時(shí)間的交互作用極為顯著。圖4c中,僅液固比對(duì)提取率的影響極為顯著,提取時(shí)間和交互作用對(duì)提取率無(wú)顯著性影響。從圖4可獲得因素的合理水平范圍為:浸泡時(shí)間16～19 h;液固比8∶1～12∶1 mL/g;提取時(shí)間8～10 h。

表3 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)擬合方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

注:**表示差異性極顯著(p<0.01);*表示差異性較為顯著(p<0.05)。

求導(dǎo)得到響應(yīng)曲面法優(yōu)化貫葉連翹揮發(fā)油提取工藝的條件為:浸泡時(shí)間18.50 h,液固比9.39∶1 mL/g,提取時(shí)間9.83 h,由于實(shí)際操作條件的限制,故將參數(shù)修訂為浸泡時(shí)間19 h,液固比9∶1 mL/g,提取時(shí)間10 h,該條件下貫葉連翹花中揮發(fā)油提取率達(dá)1.03 mL/100 g,與理論值1.10 mL/100 g僅相差2.73%。

2.3 揮發(fā)油的抑菌活性研究

抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),加入貫葉連翹花中揮發(fā)油的平板上形成了抑菌圈,其直徑大小見(jiàn)表4所示,即該揮發(fā)油對(duì)供試菌種:金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有一定的抑制活性,其抑菌活性大小順序?yàn)榭莶菅挎邨U菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。

表4 貫葉連翹花中揮發(fā)油對(duì)菌種的抑菌圈直徑Table 4 Antimicrobial cycle diameter of volatile oil from Hypericum perforatum L. flowers

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法對(duì)水蒸氣蒸餾法提取貫葉連翹花中揮發(fā)油的工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定的最佳工藝條件為:浸泡時(shí)間19 h,液固比9∶1 mL/g,提取時(shí)間10 h,該條件下?lián)]發(fā)油的提取率為1.03 mL/100 g,與理論值1.10 mL/100 g較為接近,則響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂捎糜谪炄~連翹花中揮發(fā)油的提取。貫葉連翹花中揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)測(cè)試中,其對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑分別為9、10、12 mm,即該揮發(fā)油對(duì)供試菌有一定的抑制作用,這與揮發(fā)油中化合物含有的羥基和不飽和鍵的存在有關(guān)。

貫葉連翹花中揮發(fā)油具有潛在的抑菌活性,與揮發(fā)油中多成分協(xié)同、多靶點(diǎn)作用的有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)貫葉連翹花中揮發(fā)油成分進(jìn)行分析和鑒定,成為本課題組下階段研究目標(biāo)。

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Extraction and antibacterial activity of volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers

WANG Yan1,ZHANG Zhi-qi2,XU Hong-ying3,ZHANG Shuang1,WANG Fei-juan1,SU Wen-xiang1

(1.Shaanxi Institute of International Trade&Commerce,Xianyang 712046,China;2.Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry,Ministry of Education,School of Chemistry and Chemical Engineering,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China;3.Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering,Hohhot 010070,China)

To study steam distillation extraction technology of volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers,the type of parameters soaking time,solvent to solid sample ratio and extraction time were investigated in single factor experiments with extraction yield of volatile oil as evaluation index. The best extraction processes were obtained with three factors and three levels of response surface methodology as follows:soaking time 19 h,solvent to solid sample ratio 9∶1 mL/g and extraction time 10 h respectively,leading to an extraction yield of volatile oil 1.03 mL/100 g,and the experimental value are basically close to the theoretical expectation value 1.10 mL/100 g,with only 2.73% deviation. Combining with the antibacterial activity tests,the antimicrobial cycle diameter of volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers were 9,10,12 mm forEscherichiacoli,StaphyloccocusaureusandBacillussubtilis,which suggested volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers has a certain antibacterial effect.

HypericumperforatumL. flowers;volatile oil;steam distillation;response surface method;antibacterial activity

2016-04-18

王燕(1982-)，女，碩士研究生，講師，主要從事天然藥物有效成分方面的研究，E-mail:370749824@qq.com。

陜西省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(15ZY034)；陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院校級(jí)課題(SMXY201631)；陜西省教育廳項(xiàng)目(16JK2031)；陜西省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2516)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)02-0273-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.044