貉源致病性沙門氏菌的分離鑒定與藥敏試驗分析

肖麗榮，李巧玲，張召興，龐洪澤，張文舉，吉志新，賈青輝，史秋梅

(河北科技師范學院河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北 秦皇島，066600)

沙門氏菌抗原性復雜、血清型多樣、臨床癥狀和病理變化多變，且多與病毒性疾病或其他細菌性疾病并發(fā)，該菌可以通過直接或間接方式進行傳播，給畜牧業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[1，2]。貉的沙門氏菌病又稱為副傷寒，是由沙門氏桿菌感染而引起的急性及慢性傳染病，癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱和腹瀉，體質(zhì)量迅速減輕，脾臟顯著腫大和肝臟的病變，且經(jīng)常出現(xiàn)母獸流產(chǎn)現(xiàn)象，呈地方性暴發(fā)流行[3]?？股厥欠乐紊抽T氏菌主要的手段，在養(yǎng)殖過程中不合理的使用抗生素，導致出現(xiàn)耐藥菌和多重耐藥現(xiàn)象，其耐藥譜也越來越廣[4]。2017年5月中旬，秦皇島市某養(yǎng)貉場發(fā)現(xiàn)斷奶前后40～60日齡幼貉突然發(fā)病，有的呈現(xiàn)急性死亡。為了確定貉急性死亡的病原菌，分離1株病原菌，被鑒定沙門氏菌，該菌具有很強的致病性，因此對該分離菌株進行藥敏試驗，以期為該地區(qū)貉源沙門菌病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

秦皇島市某養(yǎng)貉場40～60日齡幼貉約1 000只，發(fā)病率為5.0%，死亡率為2.7%，對送檢的病死幼貉剖檢，無菌采取病死貉的肝臟組織，進行分離鑒定。

1.2 主要試劑與儀器

普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、SS培養(yǎng)基、質(zhì)量濃度為70 g/L的綿羊脫纖血液瓊脂、革蘭氏染色液試劑盒(引自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；藥敏紙片(引自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司)；ID32E腸道菌鑒定試條(引自法國梅里埃公司)； DL2000 Marker，2×Taq Marker Mix，樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒(均引自北京康為世紀生物科技有限公司)。常規(guī)儀器與試劑均由本實驗室提供。

1.3 試驗動物

體質(zhì)量約20 g的昆明系小鼠10只，引自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.4 病原的分離純化

無菌采集病死幼貉的肝臟組織，接種于質(zhì)量濃度為70 g/L的綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，挑取優(yōu)勢單個菌落接種于SS瓊脂培養(yǎng)基上。挑取優(yōu)勢菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，挑取單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h，并革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.5 病原菌生化試驗

按照ID32E腸道菌鑒定試劑條說明書操作，用ATB自動生化鑒定系統(tǒng)進行生化試驗。

1.6 病原菌的16S rRNA PCR檢測

將細菌純培養(yǎng)產(chǎn)物按照樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，根據(jù)細菌16S rRNA序列設計的通用引物(由北京生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成)，對細菌的16S rRNA基因片段進行PCR擴增。PCR擴增反應體系為50 μL：2×Taq Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL,ddH2O 19 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取出5 μL擴增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為10 g/L瓊脂糖凝膠中，150 V電泳20 min，觀察PCR擴增產(chǎn)物的條帶，將PCR產(chǎn)物送北京生工進行序列測定，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進行同源性比較分析。

1.7 致病性試驗

[5]的方法，對實驗組小鼠腹腔接種菌液濃度為1×108CFU/mL，每只小鼠接種0.2 mL；對照組接種等量的營養(yǎng)肉湯作為陰性對照。接種12 h后，觀察7 d，記錄發(fā)病及死亡情況，對于死亡的小鼠剖檢，無菌取其肝臟組織分離并鑒定。

1.8 藥敏試驗

按照美國臨床檢驗標準委員會推薦的標準K- B紙片法進行操作和結(jié)果判斷[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病死貉剖檢結(jié)果

剖檢變化可見(圖1 )，病死貉肝臟出血，切面外翻；脾臟多數(shù)高度腫脹，呈黑紅色或暗褐色，被膜下出血；腎臟呈灰紅色或帶有淡黃色，被膜下見點狀出血；腸系膜淋巴結(jié)腫大，質(zhì)地柔軟，呈灰紅色或灰色。

2.2 分離菌株形態(tài)特征與培養(yǎng)特性結(jié)果

在SS瓊脂培養(yǎng)基上生長出圓形光滑、邊緣整齊、較扁平、無色但中心稍發(fā)黑的菌落，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長出圓整、光滑、稍隆起、淺灰白色的菌落，在血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征與在普通營養(yǎng)瓊脂的一致，不溶血。涂片染色鏡檢，革蘭染色呈散在、兩端鈍圓的直桿菌。

2.3 分離菌株的生化特性鑒定結(jié)果

分離菌株氧化酶，尿素酶，VP，苯丙氨酸和色氨酸脫氨酶，脂肪酶，DNA酶，丙二酸鹽利用，吲哚等試驗為陰性；酒石酸鹽利用、賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、精氨酸雙水解酶、硫化氫等試驗陽性。經(jīng)ATB自動生化儀鑒定分析系統(tǒng)檢測分析，鑒定結(jié)果為沙門氏菌，評定結(jié)果合格率為99.9%。

2.4 分離菌株的16S rRNA測序

用16S rRNA的通用引物進行PCR擴增，分離菌株擴增出大約為1 492 bp的目的條帶(圖2)。將測序結(jié)果與GenBank基因序列數(shù)據(jù)庫中基因序列進行比對，與已發(fā)表的沙門氏菌的基因序列同源性為100%，確定了分離菌株為沙門氏菌。

圖1 病貉病理剖檢結(jié)果

圖2 貉源致病性沙門氏菌的分離菌株16S rRNA PCR擴增結(jié)果

2.5 致病性試驗結(jié)果

實驗組小鼠在攻毒24 h后出現(xiàn)死亡，將死亡小鼠剖檢后，無菌采集肝臟組織進行分離鑒定，結(jié)果顯示，分離到了沙門氏菌，對照組小鼠健康存活。表明分離菌株具有致病性。

2.6 藥敏試驗結(jié)果

通過藥敏試紙片檢測結(jié)果顯示，該分離菌株對頭孢曲松、頭孢拉定、大觀霉素、新霉素、替米考星等5種藥物高度敏感；對恩諾沙星、氧氟沙星、阿米卡星、磺胺間甲氧嘧啶、諾氟沙星等5種藥物中度敏感；對氟苯尼考、阿莫西林、氨芐西林、乙酰甲喹、環(huán)丙沙星、慶大霉素、多西環(huán)素、鏈霉素、林可霉素等9種藥物耐藥(表1)。

表1 貉源致病性沙門氏菌的分離菌株藥敏試驗結(jié)果

注：R為耐藥，I為中介，S為敏感。

3 討 論

沙門氏菌是革蘭氏陰性、無莢膜、周身鞭毛、能運動的需氧或兼性厭氧的短桿菌[7，8]。沙門氏菌病又名副傷寒，是各種動物由沙門菌屬細菌引起的疾病總稱，臨床上多變現(xiàn)為敗血癥和腸炎，也可使妊娠動物發(fā)生流產(chǎn)。腸道沙門氏菌是一種人畜共患病病原菌，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，對毛皮動物養(yǎng)殖行業(yè)造成了嚴重的危害[5]。沙門氏菌病的最大危害是垂直傳播，部分妊娠母貉感染沙門氏菌可引起流產(chǎn)或產(chǎn)出死胎，其余的產(chǎn)出病貉或帶菌貉。這些病貉或帶菌貉的分泌物和排泄物中含有大量病菌，污染飼料、飲水等，從而傳播給健康幼貉導致發(fā)病死亡。沙門氏菌攜帶多種毒力因子，如脂多糖、腸毒素、細胞毒素等，相關(guān)研究表明了這些毒力基因與致病性密切相關(guān)。需要進一步研究沙門氏菌毒力基因致病機理。本次試驗的藥敏試驗結(jié)果顯示，該分離菌株對頭孢曲松、頭孢拉定、大觀霉素、新霉素、替米考星等5種藥物高度敏感，對其他藥物都有不同程度的耐藥性。與陳思等[4]報道的貉源沙門氏菌對頭孢曲松、頭孢拉定、大觀霉素等藥物敏感一致。與李建軍等[9]報道的有差異性，可能與分離的地區(qū)和血清型有關(guān)。

參考文獻：

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