肝組織學評估在非酒精性脂肪性肝病臨床研究及實踐中的作用

蔣麗娜， 趙景民

(解放軍第三〇二醫(yī)院 病理診斷與研究中心， 北京 100039)

肝組織學評估在非酒精性脂肪性肝病臨床研究及實踐中的作用

蔣麗娜， 趙景民

(解放軍第三〇二醫(yī)院 病理診斷與研究中心， 北京 100039)

肝活組織檢查是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，尤其是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)診斷的"金標準"，盡管肝穿刺檢查存在有創(chuàng)性、取樣和評價誤差等局限性，但在NAFLD/NASH臨床試驗研究及新藥臨床試驗中，肝組織學評價是研究隊列患者入組、主要治療終點和(或)次要治療終點評價的主要評價指標，具有其他方法目前尚不可替代的作用。NAFLD/NASH的組織學評價系統(tǒng)主要包括Brunt系統(tǒng)、美國NASH臨床研究網(wǎng)絡評分系統(tǒng)、歐洲SAF/FLIP評分系統(tǒng)和兒童NAFLD組織學評分系統(tǒng)，在臨床實踐和研究中應選擇適合的組織學評分系統(tǒng)。

非酒精性脂肪性肝病; 活組織檢查, 針吸; 評價研究

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種常見的慢性肝病[1]，西方國家NAFLD的患病率為17%～36%[2]，在我國為15%～30%[3]。NAFLD包括一系列肝臟疾病，即非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及NASH導致的肝硬化和NAFLD/NASH相關性肝細胞癌[4-7]。歐洲肝病學會(EASL)將NAFLD細分為非酒精性脂肪肝，即單純性脂肪肝，伴輕度炎癥的脂肪肝和早期NASH[即無或輕度(F0～F1)肝纖維化]；NASH肝纖維化，包括具有顯著(≥F2)或進展期(≥F3)肝纖維化；NASH導致的早期或肯定的肝硬化(F4)以及肝細胞癌。目前，臨床實踐中肝活組織檢查是診斷NAFLD，尤其是NASH的“金標準”，不但能夠明確診斷，而且能夠評價炎癥活動度和纖維化程度，評估病情，預測疾病進展。在NAFLD/NASH臨床研究和新藥試驗中，鑒于目前影像學檢查尚難以評價肝臟炎癥壞死程度，實驗室檢查缺乏特異性血清學診斷標志等，肝穿組織學評價具有重要的地位和作用。目前國際上用于NAFLD/NASH組織學評價系統(tǒng)的適用人群、組織學評價指標、計分方法等存在差異，針對不同的研究目的和研究對象，選擇合適的NAFLD/NASH組織學評價系統(tǒng)尤為重要。本文著重對肝活組織檢查在NAFLD/NASH臨床管理和試驗研究中的地位及應用進行評述。

1 肝穿刺活組織檢查在臨床實踐中的適應證及局限性

肝穿刺活組織檢查在明確NAFLD/NASH診斷方面具有不可替代的地位，能夠確定NAFLD的嚴重程度(分級和分期)，為治療和預后提供指導；能夠用于NASH自然史研究，明確NASH導致的隱匿性肝硬化。需要注意的是，肝硬化階段脂肪變性可因脂肪“耗盡”而不易見[8-10]。

關于NAFLD患者肝穿刺適應證的問題,美國肝病學會(AASLD)NAFLD診治指南中有5項推薦建議:(1)具有NASH和進展期肝纖維化高風險的NAFLD患者，推薦行肝穿刺檢查(推薦強度1, 證據(jù)級別B);(2)伴有代謝綜合征或需要通過NAFLD纖維化評分確定NASH及進展期肝纖維化的高?；颊?推薦強度1, 證據(jù)級別B)，應行肝穿刺活組織檢查[11];(3)疑似NAFLD患者合并其他慢性肝病，推薦肝穿刺活組織檢查進行診斷與鑒別診斷(推薦強度1, 證據(jù)級別B)[12];(4)疑似NAFLD兒童患者，臨床診斷不明或存在多種診斷，或應用潛在肝毒性藥物進行治療前，推薦進行肝穿刺檢查(推薦強度1, 證據(jù)級別B);(5)兒童患者NASH藥物治療之前，推薦首先行肝穿刺活組織檢查以明確NASH診斷(推薦強度2, 證據(jù)級別C)[13]。EASL、歐洲糖尿病研究學會和歐洲肥胖癥研究學會NAFLD診治指南中推薦肝活組織檢查的建議與AASLD指南中的建議基本相同[14]。

肝活組織檢查的主要局限性在于其有創(chuàng)性、取材誤差及觀察者主觀差異。肝活組織檢查樣本大小對于組織學診斷的準確性至關重要，在臨床實踐中不可忽視。合格的樣本長度至少1.6 cm，寬度1.2 mm～1.8 mm，包含≥10個匯管區(qū)，該樣本量相當于肝臟的1/50 000。組織樣本應置于10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，嚴格按照病理標準作業(yè)程序進行樣品處理?；救旧椒ò℉E染色、Masson三色染色、Gordon-Sweets網(wǎng)狀纖維染色，必要時行鐵/銅染色、d-PAS染色、免疫組織化學染色等。

2 NAFLD的組織學特征

脂肪變性是NAFLD的常見的組織學病變，表現(xiàn)為肝腺泡3區(qū)為主的不同程度的大泡性脂肪變性、小泡性脂肪變性和大、小泡混合性脂變。小葉炎癥(lobular inflammation, LI)是NASH的基本組織學特征之一，包括局灶性炎癥壞死、肝細胞凋亡、炎癥細胞浸潤、脂性肉芽腫/微型肉芽腫和炎性衛(wèi)星灶等。通常在成人NASH中LI比匯管區(qū)炎癥(portal inflammation, PI)更明顯，若存在顯著的PI和淋巴細胞聚集、廣泛的界面炎以及豐富的漿細胞浸潤時，應與其他慢性肝病鑒別。需要強調(diào)的是，肝細胞氣球樣變是NASH的必備組織學特征。

脂性肉芽腫/微型肉芽腫是由成簇的Kupffer細胞圍繞在凋亡的肝細胞或脂滴周圍形成的肉芽腫結構。上皮樣或干酪樣肉芽腫不是NASH的組織學特征，應與其他肝臟疾病進行鑒別診斷。Mallory-Denk小體(Mallory-Denk body, MDB)在NASH病例中較酒精性肝病中少見，泛素蛋白是MDB免疫染色標記，Masson三色染色MDB呈藍色或綠色。15%～55%的NASH患者中，網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞和肝細胞內(nèi)可出現(xiàn)少量鐵沉積。

成人和兒童NAFLD之間存在一些差異[15]。在兒童NASH中，肝細胞脂變不僅限于肝腺泡1區(qū)為主的大泡性脂變，有時匯管區(qū)周圍脂變或全小葉脂變可較明顯，PI也較成人NASH表現(xiàn)明顯，疾病進展有時較成人NASH更為迅速。

NASH肝纖維化，通常呈現(xiàn)于肝腺泡3區(qū)，表現(xiàn)為竇周、細胞周的網(wǎng)格狀纖維化。NASH早期竇周或細胞周纖維化較纖細，隨著疾病的進展，肝腺泡3區(qū)竇周纖維化愈加致密，Masson三色染色或膠原染色能較好顯示纖維化分布及程度。橋接纖維化是進展期NASH肝纖維化的特征，包括中央靜脈-中央靜脈、中央靜脈-匯管區(qū)、匯管區(qū)-匯管區(qū)橋接纖維化。肝纖維化進一步發(fā)展，可導致肝小葉結構重建，最終可能發(fā)生早期和明確的肝硬化。

近年來，慢性HBV感染與NAFLD的關系引起了人們的關注。流行病學資料[16-19]顯示，慢性HBV感染NAFLD的發(fā)生率為16.3%～37.6%。組織學上，大泡性肝細胞脂肪變性和竇周纖維化是NASH的組織學特征，而彌漫性界面炎和明顯的匯管區(qū)炎癥是慢性乙型肝炎的組織學特征。有報道[20]血清HBV DNA水平與NAFLD呈負相關，有關HBV與肝細胞脂變之間的相互作用機制尚待闡明。

3 NAFLD/NASH的組織學評分

NAFLD/NASH的組織學評價目前常用的有4個定量評分系統(tǒng)。Brunt系統(tǒng)是NASH最基本的評分系統(tǒng)，該系統(tǒng)僅適用于成人NASH；美國NASH臨床研究網(wǎng)絡(NASH-CRN)評分系統(tǒng)適用于成人和兒童NAFLD，特別適用于臨床試驗研究或藥物驗證組織學評價；歐洲SAF/FLIP評分系統(tǒng)適用于成人NAFLD；兒童NAFLD組織學評分系統(tǒng)專門針對兒童NAFLD[21-25]。

在上述4個NAFLD/NASH組織學評分系統(tǒng)中，組織學活動度的分級主要包括脂肪變性、炎癥和氣球樣變。在NASH-CRN評分系統(tǒng)中，NASH活動度(NAS)是脂肪變性、小葉炎癥和氣球樣變積分的總和，代表組織學炎癥壞死程度，但每種病變未加權評分，NAS主要用于評估NASH的病變程度，常用于臨床研究及藥物臨床試驗研究中的肝組織學評價。纖維化分期從0期到4期，在NASH-CRN中，肝纖維化1期又細分為1a(肝腺泡3區(qū)竇周纖細的纖維化)、1b(肝腺泡3區(qū)竇周較致密的纖維化)和1c(匯管區(qū)周圍纖維化)，1a與1b是纖維化分期的遞進關系，而1c與1a、1b是早期NASH肝纖維化分布部位的不同。在歐洲肝病指南中，將≥F2定義為顯著的肝纖維化,≥F3為進展期纖維化，F(xiàn)4是早期和明確的肝硬化。在SAF /FLIP評分系統(tǒng)中，SAF是脂肪變性、炎癥活動度和纖維化程度的加權計分，在臨床實踐中，SAF評分是NAFLD/NASH診斷的一個較好的評價參數(shù)，較NAS評分系統(tǒng)具有可重復性好、準確性高的優(yōu)點，推薦用于臨床NAFLD/NASH組織學診斷。NASH-CRN系統(tǒng)因其病變活動度及纖維化分期較為細致，推薦用于NASH臨床研究和新藥臨床試驗中的組織學評價。鑒于兒童NASH中PI通常較成人顯著，為此在兒童評分系統(tǒng)中強調(diào)PI評分(0～2分)。需要指出的是，NAFLD/NASH組織學診斷與評價不完全依據(jù)評分系統(tǒng)，需要結合組織學特征、臨床、實驗室資料等綜合判斷或評價。

4 NAFLD/NASH組織學評價在臨床研究或新藥試驗中的應用

AASLD、EASL指南均指出肝活組織檢查是NAFLD/NASH臨床試驗的重要工具之一。臨床試驗中，NAFLD/NASH組織學評價的地位主要體現(xiàn)在對NAFLD/NASH入組病例進行明確診斷與鑒別診斷,以及初始治療終點和(或)次要治療終點的療效評價方面。

在Elafibranor治療NAFLD隨機雙盲臨床試驗研究IIb期中[26]，分設低劑量和高劑量的Elafibranor治療組，以及安慰劑對照組。主要治療終點和次要治療終點主要是組織學改善。采用NASH-CRN評分系統(tǒng)進行組織學評價。主要治療終點的評價為NASH逆轉[NASH組織學逆轉，包括氣球樣變消失(0分)，小葉炎癥消失或持續(xù)的輕度LI(0或1分)，組織學診斷為單純脂肪肝或單純脂肪肝伴輕度炎癥]且無纖維化進展[纖維化進展是指纖維化分期(評分)增加)]。次要治療終點的評價是與基線水平相比NAS評分降低2分或以上，即脂肪變、肝細胞氣球樣變、炎癥和纖維化組織學評分有所降低。該研究結果顯示，高劑量Elafibranor治療組(120 mg/d，治療1年)組織學上NASH炎癥活動度緩解，纖維化程度未加重。

在法尼醇X受體配體奧貝膽酸治療NASH的臨床試驗研究II期(FLINT)(NCT01265498)中[27-28]，設計奧貝膽酸治療組(25 mg/d，持續(xù)72周)和安慰劑對照組，采用NASH-CRN評分系統(tǒng)進行組織學評價。主要治療終點為NAS評分下降2分或以上，無纖維化進展，完成全程治療(基線至主要治療終點)。次要治療終點是NASH緩解，NAS評分下降，肝細胞氣球樣變、脂肪變、LI、PI和纖維化的評分有下降。本研究結果顯示，奧貝膽酸治療組較安慰劑組NASH患者組織學有改善，但其長期有效性和安全性待進一步驗證。

在吡格列酮、維生素E或安慰劑治療NASH(NCT00063622)試驗[28-29]中，研究設計為NASH受試者分別用吡格列酮、維生素E和安慰劑治療96周，停止治療后再進行24周的回訪，采用了NASH-CRN評分系統(tǒng)。入組標準為確診NASH，NAS評分5分及以上；或疑似NASH，NAS評分4分，肝細胞氣球樣變至少1分。主要治療終點為：肝細胞氣球樣變評分下降≥1分；纖維化評分無增加；或NAS評分降至3分以下，或NAS評分至少降低2分，且LI或脂變至少降低1分。次要治療終點為NASH炎癥活動度整體降低，或脂變、LI、氣球樣變及纖維化評分降低，以及血清轉氨酶、人體測量指標、胰島素抵抗和脂肪分布改善。結果顯示，維生素E(800 IU/d)用于治療非糖尿病NASH成人患者優(yōu)于安慰劑組，吡格列酮(30 mg/d)治療組在主要治療終點較安慰劑組無顯著改善，但是在次要治療終點與安慰劑組相比，較患者獲益顯著。維生素E和吡格列酮治療組NASH患者中，AST和ALT水平在治療初期下降明顯 (P值均<0.001)。

5 小結

綜上所述，雖然肝活組織檢查存在有創(chuàng)性和取樣誤差等局限性，但目前仍然是診斷NAFLD/NASH的“金標準”，在臨床實踐中對指導治療和評價預后具有一定價值。NAFLD/NASH組織學分級、分期系統(tǒng)是NAFLD/NASH臨床診斷和試驗研究中的有效方法，NASH組織學診斷與評價不僅依賴評分系統(tǒng)，且要兼顧組織學特征。臨床試驗研究中，NAFLD/NASH組織學評價主要用于NAFLD/NASH入組病例明確診斷與鑒別診斷，及主要治療終點和(或)次要治療終點的組織學改善評價方面。

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Roleofhistologicalevaluationoftheliverinclinicalpracticeandresearchonnonalcoholicfattyliverdisease

JIANGLina,ZHAOJingmin.

(PathologicalDiagnosisandResearchCenter, 302HospitalofPLA,Beijing100039,China)

Liver biopsy is currently the gold standard for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), especially nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Although liver biopsy has the limitations such as invasiveness, sampling error, and evaluation error, in clinical trials of NAFLD/NASH and related new drugs, it is still used to evaluate the enrollment of patients into a cohort and primary and/or secondary endpoints and cannot be replaced by other methods. The histological evaluation systems of NAFLD/NASH mainly include Brunt system, NASH-CRN scoring system, European SAF/FLIP scoring algorithm, and pediatric NAFLD histological scoring system, and an appropriate histological scoring system should be selected in clinical practice and research.

nonalcoholic fatty liver disease； biopsy, needle; evaluation studies

R575.5

A

1001-5256(2017)12-2303-04

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.009

2017-11-15；修回日期：2017-11-24。 基金項目：首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項項目(首發(fā)2014-2-5032)；國家自然科學基金青年項目(81500450)；國家自然科學基金面上項目(81673654) 作者簡介：蔣麗娜(1984-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事分子腫瘤病理和代謝綜合征方面的研究。 通信作者：趙景民，電子信箱: jmzhao302@163.com。

引證本文：JIANG LN, ZHAO JM. Role of histological evaluation of the liver in clinical practice and research on nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(12): 2303-2306. (in Chinese)

蔣麗娜，趙景民. 肝組織學評估在非酒精性脂肪性肝病臨床研究及實踐中的作用[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(12): 2303-2306.

(本文編輯：林 姣)