EZR、NF2基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)※

朱雪玲，沈國平，鞏海鳳，李正娥，王榮華，馬榮華，李筱月，蘇占海#

(1.青海大學(xué)研究生院；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部；3.青海紅十字醫(yī)院；4.青海大學(xué)附屬醫(yī)院消毒供應(yīng)中心；5.青海省人民醫(yī)院，青海 810001)

EZR基因的編碼產(chǎn)物為埃茲(Ezrin)蛋白，該蛋白在正常胃粘膜及腎臟、腸組織中均有表達(dá)[1]，常定位于細(xì)胞皺褶、細(xì)胞偽足、微絨毛、卵裂溝及收縮環(huán)[2]，與細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞生存、粘附、遷移及侵襲有關(guān)[3]。當(dāng)細(xì)胞粘附、遷移及侵襲能力改變時(shí)，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。有研究表明，Ezrin蛋白在乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤及胰腺癌中高表達(dá)[5]。NF2基因又稱神經(jīng)纖維瘤Ⅱ型基因，是一個(gè)抑癌基因，其編碼產(chǎn)物為默林(Merlin)蛋白，該蛋白有十多個(gè)亞型，以Merlin-1和Merlin-2為主，其中Merlin-1的氨基端和羧基端可形成首尾相連的結(jié)構(gòu)，具有腫瘤抑制作用[6-7]。有研究表明，NF2基因突變或缺失會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤、腦膜瘤、室管膜瘤、雙側(cè)前庭神經(jīng)瘤等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生[8]。此外，NF2基因突變還與肺癌、間皮瘤、黑色素瘤、腎透明細(xì)胞癌等非神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生有關(guān)[9-12]。有研究表明，不同腫瘤組織中Merlin蛋白表達(dá)量的變化是不同的，如在非小細(xì)胞肺癌、原發(fā)性肝癌中Merlin蛋白高表達(dá)[13-14]，而在乳腺癌、多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中低表達(dá)[15-16]。目前關(guān)于EZR基因在胃癌中表達(dá)量變化的研究結(jié)果并不一致，張俊會(huì)和張汀榮采用原位雜交、免疫組化法分別檢測胃癌中ezrin mRNA及蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示胃癌中ezrin表達(dá)減低[17-18]，而馬洪宇等的研究認(rèn)為胃癌中其表達(dá)增加[19-20]。有關(guān)NF2基因在胃癌中表達(dá)的研究較少，主要采用免疫組化法進(jìn)行檢測，尚未有在轉(zhuǎn)錄水平檢測胃癌中NF2基因表達(dá)的報(bào)道。本研究采用RT-PCR、Western blot法從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測EZR、NF2基因在胃癌細(xì)胞BGC-823和正常胃粘膜細(xì)胞GES-1中的表達(dá)，探討EZR、NF2基因的表達(dá)與胃癌發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

以購自武漢普諾賽生命科技有限公司的正常胃粘膜細(xì)胞株GES-1作對(duì)照組細(xì)胞株、胃癌細(xì)胞株BGC-823作實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株。

1.2 試劑與儀器

1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；Hepes緩沖液、青霉素/鏈霉素雙抗、1×PBS緩沖液、0.25%胰酶-EDTA消化液、Tween 20(北京索萊寶，中國)；胎牛血清(Thermo，美國)；組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、6×DNA Loding Buffer(北京天根，中國)；50×TAE緩沖液、瓊脂糖(上海生工，中國)；總蛋白提取試劑盒(南京凱基，中國)；Briford法蛋白定量試劑盒、丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒、SDS-PAGE電泳液、Western轉(zhuǎn)膜液、ECL發(fā)光液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的二抗(上海碧云天，中國)；5×蛋白上樣緩沖液(北京普利萊，中國)；脫脂奶粉(內(nèi)蒙古伊利，中國)；兔抗人merlin、ezrin、β-actin單抗(abcam，美國)。細(xì)胞培養(yǎng)箱、Nano Drop 2000(Gene Company，美國)；低溫冷凍離心機(jī)(eppendrof，德國)；DYY-7C型電泳儀(北京六一，中國)；瓊脂糖凝膠電泳成像儀(Azure biosystem，美國)；TY-80型脫色搖床(江蘇金壇，中國)；酶標(biāo)儀、普通PCR擴(kuò)增儀、SDS-PAGE電泳槽、Western轉(zhuǎn)膜儀(Bio Rad，美國)；Fusion Solo化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Vilber，法國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.2 細(xì)胞中總RNA的提取及cDNA模板制備

取富集度達(dá)80%的正常胃粘膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞BGC-823，去除舊的培養(yǎng)基，以1×PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入2 mL 0.25%胰酶-EDTA消化液，消化3 min左右，加入10 mL完全培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打細(xì)胞使其均勻懸浮，取3 mL細(xì)胞懸液分兩次于1.5 mL無RNA酶的離心管中離心(4℃，1000r/min)5 min，除培養(yǎng)基，加入1.5 mL 1×PBS緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，以去除殘余的培養(yǎng)基。按組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒的操作步驟提取兩株細(xì)胞中的總RNA。利用Nano Drop 2000測定RNA的濃度及純度(A260/280在1.8～2.0之間提示RNA的純度較高)。同時(shí)，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。RNA完整驗(yàn)證圖見圖1。將純度較高、完整性良好的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20 ℃保存。

圖1RNA完整性驗(yàn)證圖

Figure1RNAintegrityverification

1.3.3 目的基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容確認(rèn)內(nèi)參基因β-actin上游引物序列為5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′，下游引物序列為5′-GGAACCGCTCATTGCCAATG-3′，目的片段大小為496 bp[21]。EZR基因的上游引物序列為5′-TAGAGGCTGACCGTATGGCT-3′，下游引物序列為5′-TGTGCTGCCACTCTTCAACTT-3′，擴(kuò)增片段大小為178 bp[22]。NF2基因上游引物序列為5′-CCCCAGTGTTCACAAGCG-3′，下游引物序列為5′-CAGTCTGTTCTCAGGGTCATA-3′，目的片段大小為289 bp[22]。引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 30 s，Tm 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min(NF2、EZR基因的Tm為56℃，內(nèi)參基因β-actin的Tm為58℃)。PCR反應(yīng)體系見表1。以2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，應(yīng)用Fusion軟件測定各組目的基因及內(nèi)參基因PCR電泳圖的灰度值。

表1 PCR反應(yīng)體系

Table 1 The PCR reaction system

1.3.4 細(xì)胞中總蛋白的提取及蛋白定量檢測

按照每1 mL Lysis Buffer中加入10 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑、10 μL 100 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的比例配制4 mL裂解液，混勻，置冰上備用。棄去富集度為80%的正常胃粘膜細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞BGC-823中的舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的1×PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，向各培養(yǎng)瓶中加入2 mL裂解液，置于脫色搖床上震蕩30 s后，置冰上靜置4 min，重復(fù)5次，使細(xì)胞充分裂解，將所得液體和沉淀移入預(yù)冷的2 mL離心管中離心(4℃，12000r/min)10 min，吸取得到的上清液即為細(xì)胞總蛋白。采用Briford法測定蛋白樣品的濃度后，分裝保存于-80 ℃冰箱。

1.3.5 Western blot蛋白表達(dá)檢測

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄水平目的基因表達(dá)的檢測

以反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增情況。目的基因及內(nèi)參基因擴(kuò)增條帶清晰，目的條帶大小吻合，提示擴(kuò)增成功，見圖2?；叶戎捣治鼋Y(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄水平EZR基因在胃癌細(xì)胞BGC-823中的表達(dá)量為1.46±0.39，正常胃粘膜細(xì)胞GES-1中的表達(dá)量為0.69±0.28，EZR基因在BGC-823、GES-1中的表達(dá)量存在差異(P<0.05)，EZR基因在BGC-823中的表達(dá)量高于GES-1。NF2基因在BGC-823中的表達(dá)量為1.46±0.48，GES-1中的表達(dá)量為0.65±0.25，該基因在兩株細(xì)胞中的表達(dá)量存在差異(P<0.05)，其在BGC-823中表達(dá)量較GES-1中的表達(dá)量高，見表2。

(M：Marker；E：EZR；N：NF2；A：Actin；1：GES-1；2：BGC-823)

圖2BGC-823和GES-1中EZR/NF2mRNA的表達(dá)圖

Figure2TheexpressionofEZR/NF2mRNAinBGC-823andGES-1cells

Table 2 The expression of EZR/NF2 mRNA in BGC-823 and GES-1 cells(±s)

2.2 翻譯水平目的基因表達(dá)的檢測

Western blot結(jié)果顯示，Ezrin蛋白和Merlin蛋白在胃癌細(xì)胞BGC-823和正常胃粘膜細(xì)胞GES-1中均有表達(dá)，見圖3?；叶戎捣治鼋Y(jié)果顯示，Ezrin蛋白在BGC-823中的表達(dá)量為1.48±0.29，在GES-1為0.77±0.13，Ezrin蛋白在BGC-823和GES-1中的表達(dá)量存在差異(P<0.05)，其在BGC-823中的表達(dá)量比在GES-1中的表達(dá)量高。Merlin蛋白在胃癌細(xì)胞BGC-823中的表達(dá)量為1.43±0.41，在正常胃粘膜細(xì)胞GES-1中的表達(dá)量為0.70±0.16，Merlin蛋白在BGC-823和GES-1中的表達(dá)量存在差異(P<0.05)，其在BGC-823中的表達(dá)量高于GES-1中的表達(dá)量，見表3。

A：Ezrin B：Merlin C：Actin

圖3BGC-823和GES-1中ezrin/merlin蛋白的表達(dá)圖

Figure3TheexpressionofEzrin/MerlinproteininBGC-823andGES-1cells

Table 3 The expression of Ezrin/Merlin protein in BGC-823 and GES-1 cells(±s)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，EZR基因在胃癌細(xì)胞及正常胃粘膜細(xì)胞均有表達(dá)，且在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)量增加，這與史榮亮等人在5株不同胃癌細(xì)胞株及胃癌組織中的研究結(jié)果一致[19-20，23]，提示ezrin表達(dá)與胃癌的發(fā)生有關(guān)。但與張俊會(huì)和張汀榮的研究結(jié)果不一致，提示Ezrin的表達(dá)雖然與胃癌發(fā)生有關(guān)，但其在胃癌中的表達(dá)量不一定增加，胃癌的發(fā)生可能還與Ezrin生物學(xué)活性的增強(qiáng)有關(guān)，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

抑癌基因NF2位于22號(hào)染色體，其編碼產(chǎn)物Merlin與4.1蛋白家族的其他成員Ezrin、根蛋白(Radxin)、膜突蛋白(Moesin)具有相似的結(jié)構(gòu)，不同的是Merlin的羧基末端不具有與肌動(dòng)蛋白(F-actin)相結(jié)合的區(qū)域，而在其氨基末端存在與actin結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，可與其他4.1蛋白家族成員結(jié)合調(diào)節(jié)其活性[24]。此外Merlin蛋白還可通過與cdc42、Rac1、PI3K等分子相互作用調(diào)節(jié)PI3K/mTOR/Akt、Hippo等信號(hào)途徑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖能力，發(fā)揮其腫瘤抑制作用[25]。有研究表明Merlin的高表達(dá)與原發(fā)性肝癌、非小細(xì)胞肺癌、子宮頸鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌等腫瘤的發(fā)生有關(guān)[13-14，21，26]。本研究在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平檢測胃癌細(xì)胞中Merlin的表達(dá)，結(jié)果顯示，Merlin在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常胃粘膜細(xì)胞，與前期我們采用免疫組化法檢測青海藏族胃癌組織中Merlin蛋白表達(dá)的結(jié)果相同，提示Merlin的表達(dá)與胃癌的發(fā)生有關(guān)。此外我們前期的研究表明，Merlin蛋白在青海藏族胃癌中表達(dá)量的變化與胃癌的分化程度、組織學(xué)分型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，本研究的結(jié)論是在細(xì)胞水平上得出的，并未分析Merlin的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，要將研究結(jié)果推廣還需大量收集胃癌組織結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行進(jìn)一步分析，為胃癌的早期診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)提供可靠依據(jù)。

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