液質(zhì)聯(lián)用測定飼料中的沙丁胺醇萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅

鄧艷芹　吳國順　倪楊帆　劉銘　劉斌　李紅萍

摘 要：本試驗對沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺3種β-興奮劑在飼料中的提取方法及其檢測的色譜條件、質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化。樣品經(jīng)乙酸-甲醇提取，混合型陽離子交換SPE小柱凈化后，采用HPLC-MS/MS檢測分析。3種目標(biāo)化合物的檢出限為0.005 mg/kg，定量限為0.02 mg/kg。加標(biāo)回收率為70.2%～118.1%，5次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.6%～8.1%。本試驗所建立的前處理方法和儀器分析方法，不僅節(jié)省了檢測時間，同時獲得較好的回收率和精密度，可用于飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅殘留的測定。

關(guān)鍵詞：沙丁胺醇；萊克多巴胺；鹽酸克倫特羅；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；飼料

中圖分類號：S816.17 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161132090

鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺屬于β-興奮劑，常被非法用于肉用動物的養(yǎng)殖以提高瘦肉率，通過聚集在動物可食用組織中而對人的組織器官產(chǎn)生毒副作用。開展飼料及飼料添加劑的檢測是從食品安全源頭進行控制的有效手段，對相關(guān)檢測方法的研究具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器為賽默飛TSQ quantum Access MAX液質(zhì)聯(lián)用；固相萃取柱（Agela公司，Cleanert PCX-SPE）。萊克多巴胺、沙丁胺醇和鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所（100ug/ml），根據(jù)需要用2%（v/v）冰乙酸稀釋至合適濃度。HPLC級甲醇和乙腈（J.T.Baker）。甲酸銨、氨水為分析純，冰乙酸為優(yōu)級純，甲酸為色譜純。用水符合GB/T6682-2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》的規(guī)定。

1.2 樣品前處理

按GB/T14699.1規(guī)定方法采樣約1.5kg，以四分法縮減至200g。用橡皮錘對樣品進行粉碎，過40目篩后充分混勻，裝入磨口瓶中備用。稱取配合飼料5g（濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料1g），精確至0.0001g，置于250mL具塞三角瓶中，加入25mL甲醇- 0.1M冰乙酸（80：20，v/v）的提取液，蓋緊塞子，振蕩提取30 min，定性濾紙過濾。

取1mL提取液濾液于5mL試管中，置50℃水浴中以氮氣吹至近干。同時將SPE柱固定于SPE減壓凈化系統(tǒng)上，依次用1mL甲醇和1mL去離子水對SPE柱活化平衡。向樣品試管中加入1mL2%（v/v）冰乙酸，漩渦振蕩后全部加到小柱上，控制過柱速度低于1mL/min（每分鐘不超過20滴）。上樣結(jié)束后，分別用1mL0.9%（v/v）鹽酸和1mL甲醇淋洗SPE柱。加入1mL氨化甲醇（25%氨水：甲醇，1：10，v/v）對柱上的目標(biāo)化合物進行洗脫，洗脫速度不超過1 mL/min。收集洗脫液后，氮氣吹干，用1.00mL2%（v/v）冰乙酸充分溶解混勻，0.22um濾膜過濾后待分析。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：HaloTM C18 3.0×100mm，2.7um；柱溫：20℃；流速：200uL/min；進樣量：10uL；流動相：0.73%甲酸銨+0.1%甲酸水溶液（A），甲醇（B），梯度洗脫條件為：0.5min 98%A +2%B；1.5min 70%A +30%B；3min 60%A +40%B；3.5min 30%A +70%B；平衡7.5min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子模式，噴霧電壓3500V，毛細管溫度400℃，鞘氣35 arb，輔助氣5 arb，選擇反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（SRM）。3種化合物的選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子（碰撞能量）為：沙丁胺醇240、166（12）、222（7）；鹽酸克倫特羅277、132（26）、203（15）、259（7）；萊克多巴胺302、121（24）、164（16）、284（12）。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

本試驗先后比較了50mL離心管和250mL三角瓶振蕩提取的效果，后者提取的效率較高，費時較少，不需要多次抽提、離心和定容，直接過濾后即可進行下步凈化操作。這是因為在振蕩時，三角瓶中提取溶劑和樣品的接觸面積較大，從而提高了提取效率，可以避免多次離心的操作，使整個提取過程節(jié)省了較多時間。

本試驗對文獻報道的2種提取液即磷酸-甲醇溶液和乙腈進行了比較（牛晉陽等，2010；劉彩云，2008；李擁軍等，2011）。試驗發(fā)現(xiàn)乙腈提取的雜質(zhì)較少，但是回收率較低。采用磷酸-甲醇提取液時回收率較好，但是磷酸在提取過程中的殘留不僅會對儀器的檢測系統(tǒng)產(chǎn)生污染，同時還可能通過基質(zhì)效應(yīng)來影響檢測方法的靈敏度和選擇性。本試驗采用乙酸代替磷酸，發(fā)現(xiàn)其提取效率較高，且避免了磷酸殘留對儀器的不良影響，最終確定采用甲醇- 0.1M冰乙酸（80：20，v/v）作為提取液。

2.2 液相色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

比較了乙腈和甲醇2種不同的有機相，經(jīng)過反復(fù)實驗確定采用甲醇-甲酸銨水溶液體系對檢測響應(yīng)值和效果沒有不良影響，同時基于乙腈毒性較大且價格昂貴，綜合考慮后選擇甲醇-甲酸銨水溶液體系作為流動相。通過優(yōu)化梯度洗脫條件，使3種化合物的出峰時間從7.55～13.77min縮短至5.04～8.30min，每個樣品分析時間從25min縮短至15min，且峰型更佳（圖略）。利用質(zhì)譜掃描收集3種化合物的母離子和子離子信息，確定適合定量分析的特征離子對，并對離子源參數(shù)和碰撞、傳輸參數(shù)進行了優(yōu)化，響應(yīng)值較好。

2.3 方法靈敏度、精密度及回收率

在空白飼料中添加3種目標(biāo)化合物，以各物質(zhì)的特征離子色譜峰信噪比S/N>3為方法檢出限，S/N>10為定量限。飼料樣品中3種目標(biāo)化合物的檢出限為0.005mg/kg，定量限為0.02 mg/kg。在空白飼料中添加0.1mg/kg的3種目標(biāo)化合物進行5次重復(fù)回收率試驗，3種化合物的加標(biāo)回收率在70.2%～118.1%之間，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在7.6%～8.1%之間。

3 小結(jié)

本文對沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺3種β-興奮劑在飼料中的提取方法及其檢測的色譜條件、質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化。所建立的前處理方法節(jié)省了大量的樣品前處理時間，且操作更為簡便，回收率較高。通過色譜條件優(yōu)化，不僅節(jié)省了檢測時間，同時用廉價且毒性相對較小的甲醇流動相代替乙腈，對檢測的結(jié)果影響不大。根據(jù)儀器的型號和性能對化合物的質(zhì)譜分析條件進行優(yōu)化，提高了3種化合物的檢測靈敏度和精密度。

參考文獻

[1]牛晉陽，龐宇，姚欣樂.液質(zhì)法測定豬肉中十種β-興奮劑殘留[J].食品科學(xué)，2010，31（8）：241-244.

[2]劉彩云.UPLC/MS-MS測定飼料中的萊克多巴胺[J].飼料工業(yè)，2008，29（16）：60-62.

[3]李擁軍，熊文明，何鳳芹，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

測定飼料中3種β-興奮劑[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011， 38（24）：

90-92.

[4]顧亮，丁磊.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A[J].化學(xué)分析計量，2012，21（1）：37-39.

[5]珀金埃爾默儀器（上海）有限公司.利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅[J].食品安全導(dǎo)刊，2011（5）：42-43.