夾心ELISA檢測(cè)鹿粘膜病病毒的研究

孟日增　宋嶼竹　王嘉祺　劉金華　石建平

摘 要：為探討在鹿黏膜病診斷中，采用夾心ELISA檢測(cè)方法后，取得的臨床價(jià)值。選取某鹿場(chǎng)的160份糞樣為研究對(duì)象，均進(jìn)行夾心ELISA檢測(cè)，抗體包被量100g/孔；包被液pH9.5CB；酶標(biāo)抗體稀釋度1：400倍。觀察檢測(cè)結(jié)果。本次總共有160頭樣品，有52例顯示陽(yáng)性，陽(yáng)性率為32.5%。在檢測(cè)鹿黏膜病毒時(shí)，應(yīng)用了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法，有效的彌補(bǔ)了上述檢測(cè)方法的缺點(diǎn)。研究表明，該檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，具有較高的特異性、靈敏性。且操作安全、可靠。因此，值得在臨床上大力推廣。

關(guān)鍵詞： 鹿黏膜；病毒； 夾心ELISA；研究

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.25 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161132073

鹿黏膜病處于一種鹿傳染病，癥狀表現(xiàn)為頑固性、持續(xù)性腹瀉。近年來(lái)，隨著社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，我國(guó)鹿養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。本文的目的在于探討在鹿黏膜病診斷中，采用夾心ELISA檢測(cè)方法后，取得的臨床價(jià)值。對(duì)160份鹿糞樣進(jìn)行檢測(cè)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究中，選取的材料包括這幾種。MD高免血清、 MD免疫球蛋白提取；MD酶標(biāo)抗體；MD陽(yáng)性糞樣；MD陰性糞樣；160例被檢鹿糞樣。

1.2 方法

常規(guī)篩選，找出最佳的試驗(yàn)條件。包括：抗體包被量、酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)、糞樣與酶標(biāo)抗體溫度，以及封閉劑等；進(jìn)行夾心ELISA抗體檢測(cè)時(shí)，應(yīng)用的程序?yàn)椋嚎贵w包被—洗板—封閉—加待檢樣品—加酶標(biāo)抗體—顯色—終止反應(yīng)—判定結(jié)果[1]；進(jìn)行特異性阻斷試驗(yàn)。按照1：5MD的比例，混合高免血清與陰性血清，保持4℃。隔夜后，判斷OD值的變化，以此來(lái)確定試驗(yàn)的特異性；取適量的陽(yáng)性糞樣與陰性糞樣，重復(fù)試驗(yàn)3次；對(duì)比電鏡與檢查實(shí)驗(yàn)。取適量陽(yáng)糞樣、陰性糞樣，給予2%的磷鎢酸負(fù)染，觀察結(jié)果，對(duì)比2種方法的符合率[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將上述統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)錄入到SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中，其中計(jì)數(shù)資料采取率（%）表示，組間率對(duì)比采取x2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)；對(duì)比以P<0.05表示結(jié)果差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)MDV抗原的最適條件

經(jīng)過(guò)篩選后，得出的最佳條件為：抗體包被量100g/孔；包被液pH9.5CB；酶標(biāo)抗體稀釋度1：400倍。底物顯色溫度37℃，時(shí)間20min。

2.2 特異性阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

MDV高免血清可阻斷陽(yáng)性糞樣的顯色反應(yīng)，OD值下降幅度超過(guò)50%。反應(yīng)具有特異性。

2.3 交叉試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)冠狀病毒糞樣與輪狀病毒進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示均不顯色。呈陰性反應(yīng)。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

本次進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果無(wú)顯著差異，可以看出該實(shí)驗(yàn)方法具有較好的重復(fù)性。

2.5 與電鏡對(duì)比檢查試驗(yàn)結(jié)果

本組研究中，在26份ELISA陽(yáng)性糞樣中，有24份電鏡檢查MDV呈球狀，且大小不一，在40～60nm之間。另外，在8份ELISA陰性樣品中，不存在 MDV例子。

2.6 某地鹿場(chǎng)的鹿感染MDV檢查結(jié)果

本次總共有160頭樣品，有52例顯示陽(yáng)性，陽(yáng)性率為32.5%。

3 討論

當(dāng)前，在鹿粘膜病檢查中包括多種方法。常見(jiàn)的有：病毒分離法、中和試驗(yàn)法、瓊擴(kuò)試驗(yàn)。具體來(lái)講，應(yīng)用病毒分離后，操作復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間多，從而減低了分離率。采用瓊擴(kuò)試驗(yàn)，具有操作簡(jiǎn)單、方便的優(yōu)勢(shì)，但是特異性差，檢出率不高，經(jīng)常造成漏診的現(xiàn)行。中和試驗(yàn)具有較高的準(zhǔn)確性，安全可靠[3]。然而，要求采取雙份血清，無(wú)法進(jìn)行早期診斷。同時(shí)，該方法在應(yīng)用的過(guò)程中，花費(fèi)的時(shí)間多，且消耗大量人力，比較麻煩。除此之外，應(yīng)用中和試驗(yàn)時(shí)，還要在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求比較高。再加上昂貴的檢測(cè)費(fèi)用，很難擴(kuò)大應(yīng)用。特別是針對(duì)基礎(chǔ)條件比較薄弱的基層醫(yī)院來(lái)講，實(shí)施的難度更大。在這種情況下，就會(huì)對(duì)本病的檢測(cè)與凈化造成障礙。

本組研究中，在檢測(cè)鹿黏膜病毒時(shí)，應(yīng)用了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法，有效的彌補(bǔ)了上述檢測(cè)方法的缺點(diǎn)。研究表明，該檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，具有較高的特異性、靈敏性。且操作安全、可靠。因此，值得在臨床上大力推廣。

參考文獻(xiàn)

[1]屈月，葛俊偉，唐麗杰，等.豬傳染性胃腸炎病毒雙抗體夾

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