藏茵陳提取物抗腫瘤活性及其機理的研究進展

王海霞 黃慧明 倪芳芳 曹長年??趙紅平

【摘要】藏茵陳是藏藥中最具特色的治療熱癥、肝膽病及血液病的清熱解毒藥，其提取物獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、齊墩果酸、熊果酸與芒果苷等有效成分含量高、毒副作用小，具有抗腫瘤活性。筆者對藏藥藏茵陳提取物抗腫瘤活性及其機理的研究進展進行綜述，對其潛在的癌癥臨床治療方向進行展望。

【關(guān)鍵詞】藏茵陳；藏藥；抗腫瘤活性；獐牙菜苦苷

【中圖分類號】R29【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）02-0057-05

Review of Antitumor Activities of Zangyinchen Extracts and Their Mechanisms

WANG Haixia1，2HUANG Huiming2NI Fangfang1CAO Changnian1*ZHAO Hongping2*

1. School of Chemical Engineering， Qinghai University， Qinghai 810016， China； 2. Institute of Biomechanics and Medical Engineering， Tsinghua University， Beijing 100084， China

Abstract：Zangyinchen is a Tibetan folk medicine with its various pharmacological effects， especially in the treat of gall bladder and liver disorders. Chemical and pharmacological studies of Zangyinchen have show that its rich bioactive constituents， amarogentin， gentiopicroside， ursolic acid and oleanolic acid， have been found to have antitumor activities with low toxicities. The author reviewed antitumor activities of Zangyinchen extracts and their Mechanisms to draw great attention on its potential clinical application on cancer therapy.

Keywords：Zangyinchen；Tibetan Medicine；Antitumor Activity；Amarogentin

藏茵陳，作為藏藥八珍之一，始載于藏醫(yī)藥書 《晶珠本草》[1]，與藏紅花和冬蟲夏草并稱 “藏藥三寶”。在傳統(tǒng)藏醫(yī)學(xué)中，藏茵陳主要指含龍膽科的獐牙菜屬、龍膽屬、扁蕾屬、花錨屬及腺鱗草屬與虎耳草科虎耳草屬植物等；我國獐牙菜屬植物約有79種，其中可供藏茵陳使用的藥用植物約有40余種，在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究中使用范圍較廣的為扁蕾屬濕生扁蕾（Gentianopsis paludosa Ma）、獐牙菜屬川東獐牙菜（Swertia davidi Franch）、川西獐牙菜（Swertia mussotii Franch）、印度產(chǎn)獐牙菜（Swertia chirayita）、葦葉獐牙菜（Swertia phragmitiphylla）、印度獐牙菜（Swertia chirayita）、普蘭獐牙菜（Swertia purpurascens Wall）、藏獐牙菜（Swertia racemosa）等藥用植物[2]。藏茵陳因其活性物質(zhì)獐牙菜苦苷、齊墩果酸與芒果苷等具有確切的肝膽疾病藥理活性，常用于治療各種熱癥、肝膽與血液疾病[3-5]。《中國藥典》將其作為標準藥材收錄[6]，《中國醫(yī)學(xué)百科全書·藏醫(yī)分卷》也匯集了以藏茵陳為主藥命名的臨床方劑共十余方[7]。

清熱解毒的藥物是中醫(yī)最為關(guān)注的腫瘤預(yù)防與治療的藥物之一，現(xiàn)代藥理研究表明，清熱解毒藥物可以通過直接抑制腫瘤細胞增殖誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，或調(diào)節(jié)和增強機體的免疫能力，或誘導(dǎo)腫瘤細胞的分化與逆轉(zhuǎn)以及抗突變等作用達到抗腫瘤作用[8]。藏茵陳及其提取物作為典型的清熱解毒藏藥，其抗惡性腫瘤活性的基礎(chǔ)研究也陸續(xù)見諸報端。本文對國內(nèi)外藏茵陳提取物抗腫瘤方面的藥理研究情況進行整理總結(jié)，結(jié)合本課題組的研究工作，進一步展望藏茵陳抗腫瘤活性的研究方向與機制機理，以期推動藏茵陳及其提取物抗腫瘤的臨床應(yīng)用。

1抗腫瘤活性的研究進展

11抗肝癌活性藏茵陳富含獐牙菜苦苷、芒果苷、雛菊葉龍膽苷與熊果酸等活性成分，對于正常肝細胞損傷有顯著的修復(fù)作用，因此研究藏茵陳提取物抗腫瘤活性的關(guān)注點大多首選在抗肝癌活性上，藏茵陳主要活性成分結(jié)構(gòu)式見圖1。

Lan D.等[9]研究了濕生扁蕾（Gpaludosa）中四種口山酮類化合物對人肝癌細胞株HepG2的抑制作用，結(jié)果表明四種口山酮類化合物的半抑制率IC50為743～2829 μg/mL，且抑制HepG2細胞增殖呈劑量和時間依賴型。趙李劍等[10]發(fā)現(xiàn)川東獐牙菜（Sdavidi）的正丁醇提取物黃酮類化合物芒果苷和環(huán)烯醚萜類化合物獐牙菜苦苷能明顯抑制HepG2細胞增殖，且對HepG2細胞的抑制具有協(xié)同作用。Mahendran [11]探討了印度產(chǎn)Scorymbosa甲醇提取物對HepG2的細胞毒理，實驗結(jié)果表明Scorymbosa甲醇提取物對HepG2具有明顯的細胞毒性且IC50值為6164 μg/mL。紀蘭菊等[12]發(fā)現(xiàn)了葦葉獐牙菜（Sphragmitiphylla）中新的抗腫瘤成分Swertiridoid A，實驗表明該化合物對HepG2細胞有明顯的抑制作用且IC50值為1893 μg/mL，為研制新的抗肝癌藥物提供了新的先導(dǎo)化合物。周慧[13]通過體外實驗觀察Sdavidi黃酮類化合物去甲基雛菊葉龍膽酮和裂環(huán)烯醚萜苷類化合物苦龍苷對HepG2215 細胞的細胞毒性，研究結(jié)果表明去甲基雛菊葉龍膽酮的最大無毒濃度為150 μg/mL，對細胞產(chǎn)生 50%毒性的濃度為 300 μg/mL；苦龍苷的最大無毒濃度為 200 μg/mL，對細胞產(chǎn)生 50%毒性的濃度為 400 μg/mL。趙利劍等[14]對Sdavidi的正丁醇萃取物進行研究，其中含有獐牙菜苦苷以及其他苦苷類成分，實驗結(jié)果表明苦苷濃度在35～50 μg /mL時，對肝癌細胞的抑制率可達到50%；其抑制作用可能是其它物質(zhì)和獐牙菜苦苷協(xié)同產(chǎn)生且使獐牙菜苦苷的活性得到增強。黃華藝等[15]研究了黃酮類化合物芒果苷對人肝癌細胞株BEL-7404增殖的抑制作用，表明隨著芒果苷濃度的升高和作用時間的延長，其對肝癌細胞株毒性作用增強且IC50為20 μmol/L，阻滯BEL-7404細胞周期于G2/M期。

通過國內(nèi)專利檢索，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)學(xué)者發(fā)明了含有藏茵陳的方劑用以治療肝癌?？踪毁籟16]發(fā)明了一種治療肝癌的藥物組合；基于免疫組化法的結(jié)果表明此含有藏茵陳獐牙菜的藥物組合能上調(diào)抑制基因P53的表達，下調(diào)凋亡抑制基因突變型P53的表達，能直接殺死H22肝癌細胞以抑制H22細胞增殖來誘導(dǎo)其凋亡。權(quán)棟棟等[17]的專利表明了一種九味獐牙菜片的制備方法及其對肝癌細胞Hepa1-6細胞的應(yīng)用；基于MTT法的結(jié)果表明，與對照組相比，當(dāng)九味獐牙菜片劑量達到5 mg/mL時對肝癌細胞Hepa1-6的抑制作用有差異；當(dāng)劑量達到15～20 mg/mL時有極顯著性的差異，表明九味獐牙菜片對Hepa1-6細胞的抑制作用成劑量依賴性。

部分文獻還探討了三萜類化合物熊果酸與齊墩果酸的抗肝癌活性，此類三萜類化合物在藏茵陳植物中也有較高的含量。Tian等[18]研究了熊果酸及其衍生物對肝癌細胞HepG2的作用，結(jié)果表明熊果酸能有效地抑制HepG2和其耐藥株R-HepG2細胞的增殖，并對正常小鼠肝細胞沒有毒性作用，進一步的研究機制表明熊果酸能阻滯HepG2細胞周期在G0～G1期，其作用機理可能是下調(diào)COX-2蛋白表達且上調(diào)了與凋亡相關(guān)的熱休克蛋白HSP105 mRNA表達。董靜等[19]通過齊墩果酸對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響研究中發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠經(jīng)齊墩果酸腹腔灌胃給藥處理后，其肝/體比與脾臟指數(shù)較模型組的升高，凋亡抑制基因生存素及B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白的表達下調(diào)，且與模型組相比有顯著性差異。

12抗結(jié)直腸癌活性根據(jù)《2012中國腫瘤登記年報》，結(jié)直腸癌位居我國癌癥發(fā)病第3位與癌癥死亡第5位，部分研究者進行了藏茵陳提取物抗結(jié)直腸癌活性的研究。張艷霞等[20]在Gpaludosa提取物對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖和細胞周期的影響研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取物濃度達到40 mg/L時，對SW480細胞增殖抑制顯著且具有明顯的量效關(guān)系；當(dāng)提取物濃度為30 μg/mL處理腫瘤細胞時，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)細胞周期停滯于G1期；進一步地，王雅莉等[21]采用RT-PCR法檢測了Gpaludosa提取物對SW480細胞增殖調(diào)控因子 CyclinD、CDK4、PCNA和P21kip1 的mRNA表達的影響，實驗結(jié)果表明SW480細胞經(jīng)不同濃度提取物作用24h后，CyclinD、CDK4與PCNA mRNA表達隨濃度的增加而減少，而P21kip1 mRNA的表達隨濃度增加而增加，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。紀蘭菊等[12]的專利中提及 Sphragmitiphylla中抗腫瘤活性成分Swertiridoid A對直腸癌細胞LoVo細胞有明顯的抑制作用，其IC50值為1495 ～1700 μg/mL，是治療抗直腸癌藥物潛在的先導(dǎo)化合物。

13抗皮膚癌活性作為一種癌癥預(yù)防和癌癥治療的新型藥用資源，印度獐牙菜（Schirayita）富含三萜類、生物堿與環(huán)烯醚萜類等有效成分[22]，Sata等[23]綜述了Schirayita抗炎、抗氧化與抗腫瘤等的藥理進展。此外，Sata等[24]研究了印度獐牙菜苦苷粗提物和純化物的急性毒理以及對二甲基苯蒽誘導(dǎo)小鼠皮膚癌變模型的抑癌活性影響；實驗結(jié)果表明，粗提物和獐牙菜苦苷劑量的急性毒理IC50分別為10 mg與05 mg；進一步的研究結(jié)果表明，粗提物與純化物均能提升小鼠GST、GPx、SOD與CAT的分泌，且能有效地減輕二甲基苯蒽誘導(dǎo)小鼠皮膚乳頭瘤的發(fā)生率，其主要機理在于獐牙菜苦苷能降低皮膚組織中癌細胞的增殖，與下調(diào)COX2表達、激活Caspase-3的表達有關(guān)。

14抗惡性血液疾病活性近年來，來源于間葉組織的惡性血液病的發(fā)病率也逐漸升高。Ding等[25]探討了基于Gpaludosa中分離得到的1-羥基-3，7， 8-三甲氧基口山酮對人早幼粒白血病HL-60細胞增值影響，發(fā)現(xiàn)該口山酮能誘導(dǎo)HL-60細胞的DNA損傷，在較低濃度（124～744 μM）作用下將細胞周期停滯在G1期，在較高濃度（827～3308 μM）作用下將細胞周期停滯在G2/M期，從而抑制了HL-60細胞的增殖并呈時間和劑量依賴性。丁丁[26]通過研究芒果苷對人淋巴瘤Rsiji細胞的增殖與侵襲的影響中發(fā)現(xiàn)，芒果苷對Rsiji細胞的增殖抑制具有明顯的劑量依賴性并呈現(xiàn)明顯的時間依賴性；Western blot結(jié)果表明100 μmol/L 與200 μmol/L的芒果苷作用于Rsiji細胞24h后，同對照組相比，具有顯著的抑制Rsiji細胞TIAM1蛋白的表達；進一步的Transwell 侵襲實驗表明，用不同濃度的芒果苷作用于Rsiji細胞24h后可抑制Rsiji細胞穿透 Transwell 小室 Matrigel 模擬的天然基底膜，并隨著濃度的增加呈劑量依賴性。

15抗其它癌癥活性權(quán)棟棟等[27-31]的發(fā)明專利中基于MTT法探討了九味獐牙菜片對乳腺腫瘤C127細胞、胃癌MFC細胞、淋巴瘤YAC-1、肺癌細胞LLC與畸胎瘤F9細胞的增殖抑制影響，結(jié)果表明對上述腫瘤細胞均有顯著的抑制作用且成劑量依賴性。本課題組基于人胃癌細胞MGC-803對藏茵陳藥用植物川西獐牙菜抗腫瘤活性以及活性成分進行研究，結(jié)果表明川西獐牙菜正丁醇部位增殖抑制最強并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，且表現(xiàn)出明顯的S期周期阻滯；HPLC-MS-MS分析結(jié)果表明正丁醇部位的主要活性成分多為口山酮類化合物，與文獻報道相吻合[32]。

2抗腫瘤機制的研究進展

基于國內(nèi)外關(guān)于藏茵陳提取物抗腫瘤活性的研究進展，進一步歸納總結(jié)了其抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，表明主要在以下三個方面。

21抑制腫瘤細胞的增殖及其機制國內(nèi)外研究均表明，藏茵陳獐牙菜提取物中的獐牙菜苦苷、芒果苷、口山酮類在體內(nèi)和體外對肝癌、皮膚癌、結(jié)腸癌等均具有不同程度的抗癌作用，其中口山酮類化合物可通過調(diào)節(jié)周期蛋白和周期蛋白激酶在周期調(diào)控中的活性，影響細胞周期分布，從而抑制癌細胞的增殖，并呈時間和濃度的依賴關(guān)系[21]。相關(guān)分子機制發(fā)現(xiàn)，藏茵陳Gpaludosa乙醇提取物通過抑制STAT3信號途徑，降低了Bcl-xL的表達，從而抑制了癌細胞的增殖[33]。

22誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡癌細胞通常存在著凋亡異常的現(xiàn)象，進而呈現(xiàn)異常增殖的特性，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是抗癌藥物及抗癌療法的篩選標準之一。藏茵陳苷類化合物可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Caspase家族、促進ROS的產(chǎn)生[14]以及抑制NF-KB的活性直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[34]；經(jīng)熊果酸處理后的HepG2細胞線粒體跨膜電位的損失，進而釋放細胞質(zhì)中的細胞色素Cytc，通過下調(diào)COX-2，上調(diào)P21的表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[19]；從分子機制方面闡述了獐牙菜苦苷能夠選擇性的下調(diào)COX-2的表達，上調(diào)Caspase-3的表達誘導(dǎo)細胞凋亡[35-36]；齊墩果酸和熊果酸通過促使線粒體中細胞色素C釋放到胞液，激活Caspase-9和Caspase-3，并誘導(dǎo)多聚ADP核糖多聚酶裂解，同時通過NF-KB活性和下調(diào)凋亡蛋白的XIAP誘導(dǎo)HuH7細胞凋亡[37]。

23抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移基于Transwell侵襲實驗表明，藏茵陳芒果甙作用淋巴瘤細胞 Raji 24 小時后，可抑制 Raji 細胞穿透 Transwell 小室 Matrigel 模擬的天然基底膜，且具有明顯的劑量依賴性，其機理在于可顯著下調(diào)Raji細胞TIAM1mRNA的表達和TIAM1在蛋白水平的表達[27]。

3小結(jié)

作為藏藥的八珍之一，藏茵陳類藥用植物在我國分布區(qū)域較廣，其獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、齊墩果酸、熊果酸與芒果苷等有效成分含量高且毒副作用小，具有很高的藥用價值和經(jīng)濟價值。基于文獻綜述表明，國內(nèi)外研究人員基于藏茵陳提取物進行的抗癌活性基礎(chǔ)研究，主要呈現(xiàn)以下特點：①大多數(shù)研究基于體外的抗腫瘤細胞實驗；②多數(shù)研究基于消化道腫瘤探討藏茵陳提取物的抗癌活性，因其具有明確的肝膽疾病的藥理作用，大多數(shù)文獻基于抗肝癌活性進行研究；③國內(nèi)已有一定的專利清晰地表明了藏茵陳及其提取物作為方劑在臨床上的潛在應(yīng)用。

體外細胞的藥篩實驗表明藏茵陳提取物具有明確的抗腫瘤活性且較小的量即可達到半抑制率，但是基于體內(nèi)動物試驗以及抗癌活性分子機制的研究仍較少，有待進行大量的深入研究；筆者所在課題組一直致力于基于藏茵陳提取物進行抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選。一方面，要深入研究高純度藏茵陳提取物單體的工業(yè)提純工藝；另一方面，藏茵陳提取物應(yīng)按照抗腫瘤活性藥物的篩選模式進行體內(nèi)體外系統(tǒng)實驗，為抗腫瘤臨床應(yīng)用提供堅實的依據(jù)。相信隨著研究的不斷深入，作為藏藥八珍之一的藏茵陳在未來的腫瘤防治中將會有很好的應(yīng)用前景。

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