蠶砂葉綠素水提物光動力療法對痤瘡丙酸桿菌體外抑制實驗研究

施建新++閔仲生

【摘要】目的：評估蠶砂葉綠素水提物光動力療法在體外對痤瘡丙酸桿菌的抑制效應。方法：以96孔板為實驗載體，加入痤瘡丙酸桿菌，分為實驗組、蠶砂組、細菌紅光組及細菌組，采用半導體固態(tài)冷光源，進行光動力治療。結果：1000mg/mL蠶砂聯(lián)合光動力療法組各濃度的培養(yǎng)皿中未見菌落產生，其余各蠶砂PDT組培養(yǎng)皿中未均見菌落產生。蠶砂組、細菌組、細菌紅光組培養(yǎng)皿中均可見菌落產生。而對照組中痤瘡丙酸桿菌生長未受抑制。結論：臨床使用蠶砂葉綠素水提物聯(lián)合光動力療法治療丙酸桿菌所致痤瘡具有一定可行性，其療效可在今后臨床試驗中進一步觀察。

【關鍵詞】蠶砂葉綠素水提物；光動力療法；痤瘡丙酸桿菌；體外實驗

【中圖分類號】R2467【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）02-0041-03

Inhibitory Effect of Silkworm Chlorophyll Extract Photodynamic Therapy on Propionibacterium Acnes

SHI JianxinMIN Zhongsheng*

Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China

Abstract：Objective To evaluate the effect of silkworm chlorophyll extract photodynamic therapy on Propionibacterium acnes. Methods 96-well cell culture plates were used for experimental carriers and Propionibacterium acnes suspension was added to these wells，which were divided into experimental group and three control groups. With Semiconductor as the exctiation source. Results 1000mg/mL Silkworm-PDT group can completely inhibited the growth of each concentration of P.acnes， the rest Silkworm -PDT group cant completely inhibited the growth of each concentration of P.acnes. Silkworm groups， the group of bacteria and bacterial phototherapy groups cant completely inhibited the growth of each concentration of P.acnes. The growth of P.acnes was not inhibited in three control groups. Conclusion The experimental results provide the experimental basis for the clinical use of silkworm chlorophyll extract in the treatment of acne.

Keywords：Silkworm Sand Chlorophyll Aqueous Extract；Photodynamic Therapy；Propionibacterium Acnes；In Vitro Studies

尋常痤瘡是一種臨床常見毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病，各年齡皆可發(fā)病，以青少年發(fā)病率為最高[1]。因其具有一定的損容性，其治療包括外用藥物治療、系統(tǒng)治療與物理治療，隨著科技的發(fā)展其治療方式與方法也再不斷更新。光動力療法（Photodynamic Therapy，PDT）是一種近年來應用于多種疾病治療的治療方法，光動力療法選擇性殺傷腫瘤細胞和增生旺盛的細胞是其最大的特點，而對正常細胞無損傷，從2000年首次報道治療痤瘡有效以來[2]，目前的文獻多集中報道光動力治療痤瘡的有效性，少見純中藥提取物進行光動力治療痤瘡。本文旨在通過體外實驗，通過蠶砂葉綠素水提物光動力療法的實驗，探索對不同濃度痤瘡丙酸桿菌的體外抑制效果，尋找一個最低的有效濃度，為以后臨床應用尋找新的思路。

1儀器與材料

11菌株與試劑痤瘡丙酸桿菌標準菌株（Propionibacterium acnes，ATCC11827，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心）；蠶砂葉綠素提取物（江蘇省中醫(yī)院制劑科）；瓊脂（L3027，美國Sigma-Aldrich公司）；PBS緩沖液（003mol/L，使用前配制）。

12儀器高能窄譜光動力治療儀，紅光波長為（640±10）nm，輸出功率2～230mW，由安徽航天生物科技有限公司提供。

2方法

21痤瘡丙酸桿菌懸液的制備在微生物限度室復活痤瘡丙酸桿菌凍干粉，復活成功后增殖培養(yǎng)，測定痤瘡丙酸桿菌濃度，調整最大濃度為17×108CFU/mL（Colony Forming Units），依次稀釋至17×107CFU/mL、17×106CFU/mL、17×105CFU/mL、17×104CFU/mL。加入96孔板中，每孔菌液200μL。

22痤瘡丙酸桿菌的分組將痤瘡丙酸桿菌分成：①實驗組：96孔板分別加入對應濃度蠶砂葉綠素水提物100μL，終末濃度分別為1000mg/mL、500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、625mg/mL、312mg/mL、156mg/mL，并充分混勻，每組設6個復孔，置于37℃避光孵育15min。②3個對照組：細菌組：單純不同濃度痤瘡丙酸桿菌懸液，無照光處理；細菌紅光組：單純不同濃度痤瘡丙酸桿菌懸液，只予半導體固態(tài)冷光源照射；蠶砂組：不同濃度痤瘡丙酸桿菌懸液加入不同濃度蠶砂葉綠素水提物酸共同孵育，無半導體固態(tài)冷光源照射，每組設6個復孔，置于37℃避光孵育15min。

23半導體固態(tài)冷光源照射將96孔板垂直置于光源下20cm，使光斑直徑為10cm，剛好將細菌孔完全覆蓋，光照能量設定為80mW/cm2，照射時長為15min。按照上述辦法將實驗組和對照組中的b組進行照射。

24判斷抑菌效果照光結束后，每組各孔吸取100μL菌液，混合后，每組取05mL混合液，澆板，37℃厭氧培養(yǎng)2d，記錄痤瘡丙酸桿菌是否增長。

3結果

對本研究的痤瘡丙酸桿菌的生長情況進行統(tǒng)計，見表1～3。研究中，1000mg/mL實驗組各濃度的培養(yǎng)皿中未見菌落產生，其余各實驗組培養(yǎng)皿中未見菌落產生。蠶砂組、細菌組、細菌紅光組培養(yǎng)皿中均可見菌落產生。而對照組a、b、c中痤瘡丙酸桿菌生長未收到抑制，說明單純照光與只加蠶砂葉綠素水提物不照光，均不能抑制細菌的生長。

4討論

痤瘡的發(fā)生主要與雄激素與皮脂增加、毛囊皮脂腺過度角化、痤瘡丙酸桿菌及繼發(fā)炎癥反應等原因相關。一般認為痤瘡丙酸桿菌產生的各類生物酶，能分解甘油三酯，釋放具有生物活性的組胺、細胞趨化物質、短鏈脂肪酸等參與炎癥反應，其細胞成分中的肽聚糖可被TLR2識別，并啟動免疫應答[3]。光動力療法是近年來迅速發(fā)展起來治療痤瘡的一項新型技術，是應用特定波長光源與光敏劑，通過光動力學效應選擇破壞病變組織的治療技術。氨基酮戊酸光動力療法現(xiàn)已被證實可以殺死細菌、真菌和酵母等微生物[4-5]。

蠶砂提取的葉綠素a的在外加激發(fā)光源以后，即可產生光化學反應[6]，其主要的吸收峰存在于光譜中紅光部分的640～660nm和藍光部分的430～450nm處。早在20世紀80年代，就已經制成性質穩(wěn)定性，親水性良好的葉綠素衍生物，主要是通過從蠶砂中提取糊狀的葉綠素，然后進行皂化，最后通過加入重金屬鹽的方法來取代中心鎂原子的方法制成。通過以上方法制成的葉綠素衍生物，它的治療波長介于400～700nm之間，值得注意的是在415nm和630～664nm處也具有兩個吸收最高峰值[7]，這與天然的葉綠素a治療峰值基本吻合，表明其光動力激發(fā)波段并沒有受到影響。值得注意的是，葉綠素治療痤瘡已有臨床報道，Kim JE等[8]已經應用提純后的葉綠素a、葉綠素b通過光動力療法治療痤瘡。

氨基酮戊酸是卟啉、血紅蛋白、葉綠素等四吡咯生物合成的中間產物。葉綠素a的合成過程由2分子ALA開始，通過一系列反應，生成原卟啉Ⅸ， 原卟啉Ⅸ之前的在是葉綠素與血紅蛋白生物合成中都是一樣的，下一步反應中PpⅨ與亞鐵結合就成亞鐵血紅素，而PpⅨ與鎂結合就成鎂原卟啉。鎂原卟啉再接受甲基、環(huán)化后成為具有第Ⅴ環(huán)的原脫植醇基葉綠素，最終形成葉綠素a。

本實驗結果表明，考慮到ALA-PDT體外抑制Pacnes生長的結果[9]，蠶砂葉綠素水提物同樣具有良好抑制作用。實驗組中1000mg/mL 的細菌生長被抑制，然而1000mg/mL蠶砂組細菌的生長依舊生長，說明此次實驗中，痤瘡丙酸桿菌在細胞外濃度的改變的情況下，并沒有出現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌破裂、死亡的現(xiàn)象。另外幾組濃度下的實驗組未能抑制Pacnes生長，說明此次蠶砂葉綠素水提物濃度已成為能達到有效的抑菌濃度。因為本次實驗并沒有設置孵育時間，考慮葉綠素本身的疏水性，所以假設痤瘡丙酸桿菌外是發(fā)生光化學反應的主要場所。細胞外直接發(fā)生的光化學反應可能直接損傷痤瘡丙酸桿菌的細胞壁，當損傷達到一定程度時，痤瘡丙酸桿菌的生長被完全抑制，所以葉綠素提取物濃度越高，Pacnes損傷程度也就越高，抑制效果應當越明顯，推測一定濃度范圍內葉綠素濃度與抑制效果應當是一個線性的關系，且結果也符合以上推測。表1～2結果表明，光動力效果的要素缺一不可，缺少了光照、光敏劑都不能產生光動力效應，不能產生應抑菌的效果，本實驗完全符合光動力實驗的特性。

通過試驗可以發(fā)現(xiàn)，蠶砂葉綠素水提物光動力療法可以抑制Pacnes體外的生長，為進一步探索蠶砂葉綠素水提物臨床治療痤瘡的可能性，發(fā)揮我國中醫(yī)藥在治療痤瘡方面的優(yōu)勢提供了實驗依據(jù)。

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（編輯：梁志慶）