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    基于拉曼光譜法測定冷鮮牛肉中肌紅蛋白相對含量

    2018-01-04 05:43:40張同剛羅瑞明李亞蕾周亞玲
    食品科學 2018年2期
    關鍵詞:肌紅蛋白波數(shù)曼光譜

    張同剛,羅瑞明,李亞蕾*,周亞玲

    基于拉曼光譜法測定冷鮮牛肉中肌紅蛋白相對含量

    張同剛,羅瑞明,李亞蕾*,周亞玲

    (寧夏大學農學院,寧夏 銀川 750021)

    為研究4 ℃貯藏期間冷鮮牛肉3 種化學形式肌紅蛋白相對含量變化,對采集的一維拉曼光譜,用2D-shige二維相關分析軟件對其光譜數(shù)據(jù)進行二維相關分析,得出3 種化學形式肌紅蛋白的相對含量最佳推導公式。結果表明:肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白與高鐵肌紅蛋白相對含量的最佳推導公式分別為:脫氧肌紅蛋白相對含量/%=(-0.305 5x+19.570)×100;氧合肌紅蛋白相對含量/%=(-2.933 9x+154.17)×100;高鐵肌紅蛋白相對含量/%=(1.574 3x-14.369)×100。3 種化學形式的肌紅蛋白相對含量的預測效果為高鐵肌紅蛋白>脫氧肌紅蛋白>氧合肌紅蛋白,其中波數(shù)為1 033~1 248 cm-1時,高鐵肌紅蛋白相對含量的誤差值最小為4.76%。研究表明,基于拉曼光譜法無損檢測冷鮮牛肉中肌紅蛋白相對含量是可行的。

    拉曼光譜;二維相關光譜技術;冷鮮牛肉;肌紅蛋白

    肉色是影響消費者對肉購買行為的決定性因素,因為肉的顏色被認為是評價肉及肉制品新鮮程度和品質特征的重要指標。牛肉色澤主要由血紅蛋白與肌紅蛋白決定,屠宰后放血充分的鮮肉中,肉的顏色主要是由肌紅蛋白在肉中的含量和存在狀態(tài)決定的。剛剛屠宰完的肉色呈現(xiàn)為暗紅色(脫氧肌紅蛋白),隨后與氧氣的接觸,發(fā)生氧化反應,呈現(xiàn)為鮮紅色(氧合肌紅蛋白),隨著冷鮮牛肉貯藏時間的延長,肉色發(fā)生褐變(高鐵肌紅蛋白)[1-4]。隨著我國人民生活水平的提高,冷鮮肉正逐漸成為我國肉類消費的主流,在冷鮮肉推廣的過程中貯藏期是面臨的最大問題之一,只有在保證了冷鮮肉食品質量安全的同時,延長貯藏期,冷鮮肉才能快速穩(wěn)定的進一步發(fā)展[5-9]。

    拉曼光譜屬于振動光譜的一個分支,是紅外光譜的有效補充??捎糜跈z測不同狀態(tài)食品中蛋白質分子結構的變化[10-14]。二維相關技術將拉曼光譜信號擴展到第二維上,提高了光譜分辨率,簡化了含多重重疊峰的復雜光譜,并能通過提供各信號峰之間變化的相關關系,鑒別和研究分子內和分子間的相互作用[15-21]。

    本實驗通過基于二維相關拉曼光譜法研究4 ℃貯藏期間冷鮮牛肉肌紅蛋白相對含量的變化,從蛋白分子角度研究冷鮮牛肉貯藏中色澤變化規(guī)律,探明肉色變化特征,為下一步探明高鐵肌紅蛋白合成和分解的反應原理和富集的原因提供理論依據(jù),合理控制冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白含量,開發(fā)緩解肉色褐變的相應技術,延長冷鮮牛肉貨架期,具有重要的指導意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    背最長肌 寧夏回族自治區(qū)銀川市新百超市寧陽店;乳酸、蔗糖、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸(均為分析純) 銀川昕泰生物試劑公司。

    1.2 儀器與設備

    Inspector 300拉曼光譜儀 美國賽普斯公司;HH.SY21-Ni6-C高速組織搗碎機 江蘇金壇市億通電子有限公司;UV-1200紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品處理

    本研究選取寧夏本地2 歲齡左右的秦川牛作為研究對象。將宰后胴體修整后,立即取下背最長肌在0~4 ℃,真空包裝保藏。為避免微生物作用因素干擾,獲得肉自身生理生化變化對引起肉色變化的數(shù)據(jù),樣品每天在潔凈工作臺拆包裝后以蒸餾水清洗,用4%乳酸液噴淋殺菌,重新包裝后在0~4 ℃條件下保藏。選取屠宰牛肉貯藏期中的8 個時間點檢測,以胴體修整作為0 d,分別選取0、3、6、9、12、15、18、21 d八個時間點檢測。

    1.3.2 肌紅蛋白含量測定

    參照Krzywicke[22]的方法,取待測5 g肉樣,加入25 mL濃度為0.04 mol/L、pH 6.8的磷酸緩沖液,用超細勻漿器在室溫條件下以10 000 r/min均質25 s。置均質液與4 ℃冰箱中避光保存1 h,然后與4 500×g,4 ℃離心20 min。將上清液通過濾紙過濾,濾液用分光光度計分別在波長525、545、565 nm和572 nm處測其吸光度,并按下式計算:

    式中:P1、P2、P3分別為脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白與高鐵肌紅蛋白的相對含量/%;R1、R2、R3分別為吸光度比值A572nm/A525nm、A565nm/A525nm、A545nm/A525nm。

    1.3.3 拉曼光譜測定

    取貯藏0、3、6、9、12、15、18、21 d八個時間點的肉樣5 g置于可升降平臺上,使待測肉樣中心位置放于拉曼光譜50 倍鏡頭下,進行測定,激光波長為785 nm,功率為10 mW,掃描范圍為400~1 700 cm-1,聚焦深度為200 μm。

    1.3.4 光譜預處理

    拉曼光譜實驗中,儀器系統(tǒng)噪聲會干擾有用的信息,從而影響模型的建立與預測效果。通常,使用基線校準和曲線平滑對拉曼光譜數(shù)據(jù)進行預處理,盡量減少干擾。實驗用Savitzky-Golay平滑濾波方法進行拉曼光譜數(shù)據(jù)曲線平滑處理,采用8 點平滑。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    首先用2D shige軟件對預處理后的驗證集樣本的拉曼光譜處理,得到其同步二維拉曼相關光譜圖。二維拉曼光譜圖中包含自動峰與交叉峰,找出隨樣品濃度變化而變化的多組特征峰。每組特征峰包括一個隨樣品濃度升高峰強度值(Iinc)而升高的上升峰和一個隨樣品濃度升高峰強度值(Idec)而下降的下降峰,計算不同濃度樣品的每組特征峰的峰比(peak ratio,PR)值,PR=Iinc/(Iinc+Idec)×100。通過PR值與樣品校正集中的肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白相對含量的回歸方程,PR=K1×肌紅蛋白相對含量+a(K1為斜率,a為截距)。確定拉曼光譜法肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白相對含量推導公式。讀取檢驗集樣本拉曼光譜(經預處理后)的Iinc與Idec,確定PR值后代入回歸方程,得到相對含量。

    2 結果與分析

    2.1 4 ℃貯藏冷鮮牛肉肌紅蛋白拉曼光譜圖

    由圖1可知,902、996 cm-1處的特征峰帶較寬,表明變化相對明顯,1 023、1 208、1 347、1 625 cm-1處的特征峰帶相對較窄,表明變化相對不明顯。冷鮮牛肉樣品的一維拉曼光譜在900~1 700 cm-1范圍內重疊嚴重,且小峰顯示不明顯,不容易分辨。從圖1可知,各特征吸收峰比較相似,由此可認為冷鮮牛肉樣品的一維拉曼光譜圖直觀上沒有較明顯的差異。

    圖1 冷鮮牛肉拉曼光譜圖Fig. 1 Raman spectra of chilled beef

    2.2 二維相關拉曼光譜

    2.2.1 4 ℃貯藏冷鮮牛肉肌紅蛋白二維拉曼光譜圖

    圖2 4 ℃貯藏冷鮮牛肉的二維相關譜圖Fig. 2 2D correlation spectra of chilled beef

    如圖2所示,對角線上的為自動峰,對角線外的為交叉峰;陰影填充的部分為負峰,未填充的部分為正峰。其中二維相關光譜圖有8 個自動峰,分別為1 033、1 248、1 385、1 426、1 560、1 582、1 605 cm-1和1 665 cm-1;交叉峰分別為1 033 cm-1與1 248 cm-1,1 385 cm-1與1 426 cm-1,1 560 cm-1與1 582 cm-1,1 560 cm-1與1 605 cm-1。正峰與負峰呈軸對稱出現(xiàn),且1 460~1 650 cm-1間含有較多小峰,出現(xiàn)較多雜帶的干擾,說明肌紅蛋白在常溫放置氧化過程中可能產生一些物質對拉曼光譜產生熒光干擾。

    不同貯藏時間肌紅蛋白的拉曼光譜存在的微小差異可利用二維相關光譜技術顯現(xiàn),而在一維拉曼光譜中不能明確體現(xiàn)。盧明子等[23]發(fā)現(xiàn)不同氧化方式下血紅蛋白的拉曼光譜存在的微小差異可利用二維相關光譜技術顯現(xiàn)。通過加入不同氧化劑,可見較多雜帶的干擾,說明血紅蛋白在常溫放置34 d過程中血紅蛋白解聚,球蛋白變性,生成的一些雜質降低了拉曼光譜的信噪比[23-24]。1 248 cm-1特征峰為蛋白質變性和肌紅蛋白聚集的主要標志峰,二維相關拉曼光譜中1 248 cm-1自動峰的出現(xiàn),說明雖然肌紅蛋白在4 ℃避光貯藏條件下放置可發(fā)生氧化生成高鐵肌紅蛋白,但是長期放置會導致肌紅蛋白解聚,球蛋白已發(fā)生不可逆變性。1 460~1 650 cm-1間出現(xiàn)了較多自動峰,在一維拉曼光譜中可見較多雜帶的干擾,說明肌紅蛋白在4 ℃放置21 d過程中蛋白發(fā)生了變性,生成的一些雜質降低了拉曼光譜的信噪比。

    2.2.2 一元線性回歸定量分析

    表1 冷鮮牛肉肌紅蛋白拉曼光譜的特征峰峰強度值Table 1 Intensity of characteristic Raman spectral peaks of myoglobin in beef

    表2 冷鮮牛肉中肌紅蛋白拉曼光譜特征峰的PR值Table 2 PR values of characteristic Raman spectra peaks of myoglobin in beef

    將表1中肌紅蛋白相對含量為橫坐標,與表2中相對應的PR值為縱坐標做一元線性回歸,見表3。

    表3 PR值與脫氧肌紅蛋白相對含量的一元線性回歸方程Table 3 Linear regression equation between PR value and DeoxyMb content

    由表3可以看出,1 0 3 3~1 2 4 8 c m-1與1 5 6 0~1 5 8 2 c m-1的相關系數(shù)r大于0.9 5,1 385~1 426 cm-1與1 560~1 650 cm-1的相關系數(shù)r小于0.95。因此,通過PR值評估肌紅蛋白相對含量,主要考察1 033~1 248 cm-1與1 560~1 582 cm-1的PR值。

    表4 PR值與氧合肌紅蛋白相對含量的一元線性回歸方程Table 4 Linear regression equation between PR value and OxyMb content

    由表4可以看出,1 3 8 5~1 4 2 6 c m-1與1 5 6 0~1 6 5 0 c m-1的相關系數(shù)r大于0.9 5,1 033~1 248 cm-1與1 560~1 582 cm-1的相關系數(shù)r小于0.95。因此,通過PR值評估氧合肌紅蛋白相對含量,主要考察1 385~1 426 cm-1與1 560~1 650 cm-1的PR值。

    表5 PR值與高鐵肌紅蛋白相對含量的一元線性回歸方程Table 5 Linear regression equation between PR value and MetMb content

    由表5可以看出,1 033~1 248、1 385~1 426 cm-1與1 5 6 0~1 5 8 2 c m-1的相關系數(shù)r大于0.9 5,1 560~1 650 cm-1的相關系數(shù)r小于0.95。因此,通過PR值評估高鐵肌紅蛋白相對含量,主要考察1 033~1 248、1 385~1 426 cm-1與1 560~1 582 cm-1的PR值。

    將表3~5中相關系數(shù)r大于0.95的方程分別進行轉置,分別得到脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白的推算公式(蛋白相對含量/%=(PR×a+b)×100),如下:

    脫氧肌紅蛋白相對含量計算公式:

    1 033~1 248 cm-1:脫氧肌紅蛋白相對含量/%=(-0.282 1x+17.682)×100

    1 560~1 582 cm-1:脫氧肌紅蛋白相對含量/%=(-0.305 5x+19.570)×100

    氧合肌紅蛋白相對含量計算公式:

    1 385~1 426 cm-1:氧合肌紅蛋白相對含量/%=(-2.933 9x+154.17)×100

    1 560~1 650 cm-1:氧合肌紅蛋白相對含量/%=(-2.520 0x+151.66)×100

    高鐵肌紅蛋白相對含量計算公式:

    1 033~1 248 cm-1:高鐵肌紅蛋白相對含量/%=(1.574 3x-14.369)×100

    1 385~1 426 cm-1:高鐵肌紅蛋白相對含量/%=(1.904 3x-29.292)×100

    1 560~1 582 cm-1:高鐵肌紅蛋白相對含量/%=(1.680 4x-23.718)×100

    式中:x為PR值。

    表6 待測冷鮮牛肉中肌紅蛋白拉曼光譜特征峰的PR值Table 6 PR values of characteristic Raman spectral peaks of myoglobin in beef samples to be analyzed

    表7 不同特征峰預測肌紅蛋白相對含量Table 7 Predicted relative contents of myoglobin based on different characteristic peaks

    由表6、7可得,波數(shù)為1 560~1 582 cm-1時,脫氧肌紅蛋白相對含量預測值與實際值的相對平均誤差值為6.90%,波數(shù)為1 033~1 248 cm-1時,脫氧肌紅蛋白相對含量預測值與實際值的相對平均誤差值為10.3%。因此,波數(shù)為1 560~1 582 cm-1時,脫氧肌紅蛋白相對含量的預測效果相對較好。波數(shù)為1 385~1 426 cm-1時,氧合肌紅蛋白相對含量預測值與實際值的相對平均誤差值為7.03%,波數(shù)為1 560~1 650 cm-1時,氧合肌紅蛋白相對含量預測值與實際值的相對平均誤差值為9.31%。因此,波數(shù)為1 385~1 426 cm-1時,氧合肌紅蛋白相對含量的預測效果相對較好。波數(shù)為1 385~1 426 cm-1時,高鐵肌紅蛋白相對含量預測值與實際值的相對平均誤差值為8.4%,波數(shù)為1 033~1 248 cm-1時,高鐵肌紅蛋白相對含量預測值與實際值的相對平均誤差值為4.76%,波數(shù)為1 560~1 582 cm-1時,高鐵肌紅蛋白相對含量預測值與實際值的相對平均誤差值為12.7%。因此,波數(shù)為1 033~1 248 cm-1時,高鐵肌紅蛋白相對含量的預測效果最好。3 種肌紅蛋白相對含量的預測效果為高鐵肌紅蛋白>脫氧肌紅蛋白>氧合肌紅蛋白。

    在清真屠宰充分放血的情況下,肌紅蛋白約占80%~90%,為肉色的主要呈色物質。肌紅蛋白是球狀血紅素蛋白質,主要貯存在肉類動物的肌肉中[25-27]。脫氧肌紅蛋白與氧氣的結合是可逆的,肌細胞內的氧主要通過脫氧肌紅蛋白轉運和儲存,牛肉色澤主要由脫氧肌紅蛋白濃度、氧化狀態(tài)、穩(wěn)定性以及與其他物質結合情況決定,宰后脫氧肌紅蛋白在肉中的3 種氧化還原形態(tài)之間會隨著貯藏時間、溫度、pH值等因素發(fā)生變化,從而決定肉的色澤[28-30]。

    3 結 論

    脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白與高鐵肌紅蛋白含量的最佳推導公式分別為:脫氧肌紅蛋白相對含量/%=(-0.305 5x+19.570)×100;氧合肌紅蛋白相對含量/%=(-2.933 9x+154.17)×100;高鐵肌紅蛋白相對含量/%=(1.574 3x-14.369)×100;3 種肌紅蛋白含量的預測效果為:高鐵肌紅蛋白>脫氧肌紅蛋白>氧合肌紅蛋白,其中波數(shù)為1 033~1 248 cm-1時,高鐵肌紅蛋白相對含量的誤差值最小為4.76%。

    利用二維相關光譜技術可顯現(xiàn)在4 ℃不同貯藏時間條件下冷鮮牛肉中肌紅蛋白拉曼光譜的微小差異,反映冷鮮牛肉貯藏過程中肌紅蛋白發(fā)生自然氧化還原反應的情況,從分子結構的角度為冷鮮牛肉貯藏過程中色澤變化與拉曼光譜測定肌紅蛋白相對含量方法學的建立提供科學數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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    Determination of Myoglobin in Chilled Beef Based on Raman Spectroscopy

    ZHANG Tonggang, LUO Ruiming, LI Yalei*, ZHOU Yaling
    (School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

    In this study, we examined the changes in the relative amounts of three chemical forms of myoglobin,deoxymyoglobin (DeoxyMb), oxymyoglobin (OxyMb) and metmyoglobin (MetMb), in fresh beef meat stored at 4 ℃. For this purpose, one-dimensional Raman spectral data were acquired and analyzed by two-dimensional correlation analysis using 2D-shige software. The optimal formulas for the relative amounts of three chemical forms of Mb were DeoxyMb/% =(?0.305 5x + 19.570) × 100; OxyMb/% = (?2.933 9x + 154.17) × 100; and MetMb/% = (1.574 3x ? 14.369) × 100,respectively. The prediction eff i ciency of these formulas was in the decreasing order: MetMb > DeoxyMb > OxyMb. When the Raman frequency was 1 033–1 248 cm-1, the root mean square error of prediction of MetMb was minimum, only 4.76%.Therefore, it is feasible to determine the relative amount of myoglobin using Raman spectroscopy.

    Raman spectroscopy; two-dimensional correlation spectroscopy; chilled beef; myoglobin

    10.7506/spkx1002-6630-201802033

    TS251

    A

    1002-6630(2018)02-0210-05

    張同剛, 羅瑞明, 李亞蕾, 等. 基于拉曼光譜法測定冷鮮牛肉中肌紅蛋白相對含量[J]. 食品科學, 2018, 39(2): 210-214.

    DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802033. http://www.spkx.net.cn

    ZHANG Tonggang, LUO Ruiming, LI Yalei, et al. Determination of myoglobin in chilled beef based on Raman spectroscopy[J]. Food Science,2018, 39(2): 210-214. (in Chinese with English abstract)

    10.7506/spkx1002-6630-201802033. http://www.spkx.net.cn

    2017-05-06

    國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目(31660442)

    張同剛(1987—),男,博士研究生,研究方向為畜產品加工。E-mail:372998013@qq.com

    *通信作者簡介:李亞蕾(1967—),女,教授,碩士,研究方向為畜產品加工與安全。E-mail:yaleili.cn

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