延胡索酸堿水提物中生物堿含量比較

陳薇娜,岳顯可,,楊海燕,3*,張方坤

延胡索酸堿水提物中生物堿含量比較

陳薇娜1,岳顯可1,2,楊海燕1,3*,張方坤2

目的 比較不同濃度酸堿水溶液對延胡索中原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿6個生物堿提取的影響。方法 用氨水、冰醋酸配制不同酸堿濃度水溶液，供試品加熱回流提??；采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，乙腈-0.6%醋酸溶液(pH 5.0)為流動相進行梯度洗脫，檢測波長280 nm，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，測定6個生物堿及總生物堿含量。結(jié)果 原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿分別在14.34～143.36、12.61～126.07、12.80～128.01、12.22～122.16、15.31～153.14、11.41～114.09 μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系，R2≥0.999 0；平均加樣回收率分別為99.31%、97.64%、101.41%、96.29%、99.63%、98.74%，RSD值均小于3.0%。結(jié)論 延胡索不同酸堿提取物生物堿含量有較大差異，酸性提取物生物堿含量均高于堿性提取物。

延胡索；酸堿水溶液；生物堿

0 引言

延胡索為罌粟殼植物延胡索Corydalis yanhusuo的干燥塊莖，別名元胡。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有兩千多年的歷史，用于胸痹心痛、脘腹疼痛、腰痛、疝氣痛、痛經(jīng)、閉經(jīng)、產(chǎn)后瘀滯腹痛、跌打損傷等[1]，為中藥復(fù)方制劑中的常用藥。延胡索主要含有生物堿成分，即延胡索甲素、乙素、丙素等20個生物堿[2]。在心血管系統(tǒng)方面有擴張冠脈血管[3]、抗心律失常[4]、保護心肌細胞作用[5]，在神經(jīng)系統(tǒng)方面具有鎮(zhèn)痛[6]、鎮(zhèn)靜作用，在消化系統(tǒng)方面有抗?jié)僛7]、抑制胃液分泌，還具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、提高應(yīng)激能力的作用。

延胡索歷來多以其醋制品入藥，醋制能使難溶于水的生物堿與醋結(jié)合成為易溶于水的醋酸鹽，從而增加延胡索在水煎液中的總生物堿含量[8]。然而現(xiàn)有研究主要集中在不同產(chǎn)地延胡索、醋制延胡索，或者是延胡索炮制前后的質(zhì)量差異，很少對生延胡索在不同濃度酸堿溶劑中生物堿含量的分布進行研究。本實驗首次以延胡索中的原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿的提取率為指標[9-10]，比較不同酸堿水溶液中各生物堿含量的分布情況?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200型高效液相色譜儀，配有DAD二極管陣列檢測器，Chemstation色譜工作站(美國安捷倫公司)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 μm×250 mm,5 μm)色譜柱；AL-204電子分析天平(梅特勒儀器有限公司)；TGL-16C高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；W201B恒溫水浴鍋(上海申勝生物科技有限公司)；DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 新鮮延胡索藥材采自金華東陽，經(jīng)切片，烘干為生延胡索片；原阿片堿(批號：110853-201003，純度99.9%)、鹽酸巴馬汀(批號：110732-201108，純度86.2%)、鹽酸小檗堿(批號：110713-200910，純度97.9%)、延胡索乙素(批號：110726-201112，純度99.6%)購自中國食品藥品檢定研究院，去氫紫堇堿(批號：141207，純度98.12%)、紫堇堿(批號：150327，純度98.56%)購自成都普非德生物技術(shù)有限公司；氨水、冰醋酸、甲醇、磷酸、三乙胺為分析純，液相用甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 本研究采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱，乙腈為流動相A，0.6%醋酸溶液(三乙胺調(diào)pH至5.0)為流動相B，進行梯度洗脫，0～50 min，15%～50% A；50～70 min，50%～80% A；70～75 min，80% A；檢測波長為280 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量10 μL。延胡索對照品及樣品色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品原阿片堿5.74 mg、鹽酸巴馬汀5.85 mg、鹽酸小檗堿5.23 mg、去氫紫堇堿4.98 mg、延胡索乙素6.15 mg、紫堇堿4.63 mg置于20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，溶解搖勻，制成含原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿濃度分別為286.71、252.14、256.01、244.32、306.27、228.17 μg/mL的混合溶液，作為對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備 稱取延胡索粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，于具塞三角錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱定重量，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25.0 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5.0 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2”項下對照品儲備液0.5、1、2、4、5 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列對照品混合溶液。按“2.1”項下色譜條件依次進樣分析，記錄色譜峰面積。以對照品混合溶液的濃度(X，μg/mL)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程：原阿片堿Y=0.296 5X-0.008 8(R2=0.999 6)；鹽酸巴馬汀Y=0.547 7X-0.646 2(R2=0.999 7)；鹽酸小檗堿Y=0.460 8 X+0.447 4(R2=0.999 7)；去氫紫堇堿Y=0.452 3X+0.450 9(R2=0.999 8)；延胡索乙素Y=0.276 4X+0.113 7(R2=0.999 8)；紫堇堿Y=0.350 6X+0.364(R2=0.999 8)。線性范圍分別為14.34～143.36、12.61～126.07、12.80～128.01、12.22～122.16、15.31～153.14、11.41～114.09 μg/mL。

圖1 延胡索混合對照品與延胡索樣品色譜圖

2.5 精密性考察 精密吸取混合對照品溶液(原阿片堿57.34 μg/mL、鹽酸巴馬汀50.43 μg/mL、鹽酸小檗堿50.20 μg/mL、去氫紫堇堿48.86 μg/mL、延胡索乙素61.25 g/mL、紫堇堿45.63 μg/mL)對照品溶液10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進樣測定6次，結(jié)果顯示，峰面積RSD分別為1.35%、1.14%、1.72%、1.08%、0.12%、0.74%，表明儀器精密性良好。

2.6 加樣回收率試驗 稱取已知含量延胡索粉末(過三號篩)6份，每份約0.5 g，加入原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿對照品適量，按“2.3”項下方法制備樣品，按“2.1”色譜條件進行測定，計算回收率。原阿片堿平均回收率為99.31%、RSD=1.38%，鹽酸巴馬汀平均回收率為97.64%、RSD=1.85%，鹽酸小檗堿平均回收率為101.41%、RSD=1.84%，去氫紫堇堿平均回收率為96.29%、RSD=1.61%，延胡索乙素平均回收率為99.63%、RSD=1.18%，紫堇堿平均回收率為98.74%、RSD=1.36%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取延胡索供試品溶液，分別于0、4、8、12、16 h，按“2.1”項下色譜方法進行分析。原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿峰面積值RSD值分別為0.83%、1.29%、0.98%、1.02%、0.83%、1.53%，結(jié)果表明，供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性考察 取同一批延胡索粉末約0.5 g，共6份，按照“2.3”項下制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進行分析測定。結(jié)果顯示，原阿片堿平均含量0.171 mg/g、RSD為1.43%，鹽酸巴馬汀平均含量0.168 mg/g、RSD為1.36%，鹽酸小檗堿平均含量0.059 mg/g、RSD為1.64%，去氫紫堇堿平均含量0.747 mg/g、RSD為1.26%，延胡索乙素平均含量0.411 mg/g、RSD為1.81%，紫堇堿平均含量0.751 mg/g、RSD為1.23%，結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.9 延胡索酸堿水提物中生物堿含量比較 取金華東陽(YH160601)、磐安(YH160602)、麗水慶元(YH160603)3批產(chǎn)地鮮切延胡索片，各稱取延胡索粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，于具塞三角錐形瓶中，分別精密加入8.0%、4.0%、2.0%、1.0%、0.5%醋酸溶液，水，0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%氨水溶液50 mL，稱定重量，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用相應(yīng)溶液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25.0 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5.0 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。按“2.1”項下色譜條件進行測定，得6個生物堿含量及總和，見表1。

為更加直觀地觀察延胡索不同酸堿水提物中生物堿含量的變化趨勢，以各濃度酸堿水溶液為橫坐標，各批次延胡索中原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿含量的平均值為縱坐標作柱形圖，見圖2。

表1 延胡索不同酸堿水提物生物堿含量比較(mg/g)

由表1、圖2可見，延胡索酸性提取物中，生物堿含量均高于水及堿性提取物。8.0%醋酸溶液提取時生物堿含量最高，隨著醋酸濃度的降低，生物堿含量也相應(yīng)減低；延胡索水提物生物堿含量高于堿性提取物，說明堿性條件抑制生物堿的提?。蝗欢?，由圖2可知，0.5%氨水溶液提取時，生物堿含量最低，隨著堿性的逐漸增大，生物堿含量先增高，而后又減低。

圖2 延胡索不同酸堿溶劑提取物中6個生物堿含量比較

3 討論

用DAD檢測器對原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿在200～400 nm波段進行掃描，當檢測波長為280 nm時，6個待測成分均有較大紫外吸收，響應(yīng)高且分離效果良好，故選用280 nm為檢測波長較為理想。

延胡索為臨床常用藥，明確含延胡索的方劑182首，配伍常用藥物共435味，涉及主治疾病78種。由于延胡索中游離生物堿難溶于水，其臨床應(yīng)用時往往使用醋制延胡索，經(jīng)醋制后，其生物堿與醋酸結(jié)合成易溶于水的醋酸鹽，從而更好地發(fā)揮藥效，這也是醋制入肝、疏肝止痛的原理。然而，在全國范圍內(nèi)，延胡索醋制方法和工藝有較大區(qū)別，導(dǎo)致醋延胡索質(zhì)量差異較大。從本研究中可知，生延胡索在醋酸溶液中生物堿的提取效果較好。本課題還將繼續(xù)開展生物等效性評價，明確生延胡索酸提和醋延胡索水提的藥效區(qū)別。

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Comparison of the contents of alkaloids inRhizomacorydalisextractive in acid and alkali aqueous solution

CHEN Wei-na1,YUE Xian-ke1,2,YANG Hai-yan1,3*,ZHANG Fang-kun2

(1.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China;2.Zhejiang Chinese Medical University Mecical Pieces,.LTD,Hangzhou 311401,China;3.Hangzhou Hospital of TCM,Hangzhou 310006,China)

Objective To compare the contents of 6 alkaloids(protopine,palmatine hydrochloride,berberine hydrochloride,dehydrocorydaline,tetrahydropalmatine and corydaline) fromRhizomacorydalisextractive extracted by different concentrations of acid and alkali aqueous solution.Methods Different concentrations of acid and alkali aqueous solution was made by ammonium hydroxide and acetic acid.Test solution was prepared by heating reflux.The optimal conditions of separation and detection were achieved on a Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) with linear gradient elution of acetonitrile-0.6% acetate solution (pH 5.0).The detection wavelength was 280 nm,the column temperature was 25 ℃,and the flow rate was 1 mL/min.Six alkaloids and total alkaloids of the solution were detected.Results All the active constituents′ calibration curves showed a good linearity,the liner range of the active constituents was 14.34～143.36,12.61～126.07,12.80～128.01,12.22～122.16,15.31～153.14,and 11.41～114.09 μg/mL,R2≥0.999 0,respectively.The average recovery was 99.31%,97.64%,101.41%,96.29%,99.63% and 98.74%,RSD<3.0%.Conclusion The contents of alkaloid inRhizomacorydaliswhich are extracted by alkali aqueous solution are higher than by acid aqueous solution,which has a significant difference.

Rhizomacorydalis;Acid and alkali aqueous solution;Alkaloid

2016-06-29

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司,杭州 311401;3.杭州市中醫(yī)院,杭州 310006

杭州市衛(wèi)生科技計劃(一般)項目(2015A39)

10.14053/j.cnki.ppcr.201702022

*通信作者