地中海貧血實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)展

蒙紹建

（廣西馬山縣婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530699）

地中海貧血實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)展

蒙紹建

（廣西馬山縣婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530699）

地中海貧血是一類以α或β珠蛋白鏈合成障礙為特征的溶血性貧血病，是人類最常見的單基因遺傳病之一。臨床為了提高地中海貧血的診斷準(zhǔn)確率，降低漏診以及誤診情況，有必要綜合應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室各類技術(shù)，加強(qiáng)研究，發(fā)現(xiàn)更有效、更合適的診斷方法。本研究具體就近些年實(shí)驗(yàn)室有關(guān)地中海貧血的各類不同診斷技術(shù)的情況進(jìn)行綜合論述。

地中海貧血；實(shí)驗(yàn)室診斷；技術(shù)進(jìn)展

地中海貧血（thalassemiasl）屬于隱性遺傳性疾病的一種，主要特征是珠蛋白B鏈、α鏈缺失或者合成不足，臨床出現(xiàn)最多的是β地中海貧血以及α地中海貧血[1]。從我國(guó)疾病分布情況來看，南方的發(fā)病率要高于北方，主要在香港、海南、廣東、廣西等地分布[2]。臨床對(duì)于地中海貧血具體類型的診斷必須進(jìn)行地中海貧血的相關(guān)檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行血紅蛋白電泳以及開展基因檢測(cè)能實(shí)現(xiàn)地中海貧血相對(duì)準(zhǔn)確的診斷，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)地中海貧血類型的鑒別[3]。對(duì)貧血類型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別有助于指導(dǎo)臨床針對(duì)貧血的治療，防止臨床濫用鐵劑治療貧血，從而避免地中海貧血患者受到損害。從當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室技術(shù)來看，對(duì)于地中海貧血的檢測(cè)具體包括基因診斷法以及篩查法兩種，下文進(jìn)行具體的論述。

1 基因診斷

分子診斷是基因診斷的另一種說法，其用于分析檢驗(yàn)對(duì)象某一個(gè)轉(zhuǎn)錄物（mRNA）或者特定基因（DNA），從而診斷遺傳病的一類技術(shù)。從我國(guó)情況來看，針對(duì)地中海貧血的基因診斷在近些年一共經(jīng)歷了6個(gè)發(fā)展階段，具體包括DNA點(diǎn)雜交、限制性內(nèi)切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）鏈鎖分析、聚合鏈酶反應(yīng)（PCR）體外基因擴(kuò)增、寡核苷酸（ASO）探針雜交、限制性內(nèi)切酶酶譜分析、芯片技術(shù)，尤其是其中的聚合鏈酶反應(yīng)（PCR）體外基因擴(kuò)增，當(dāng)前已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最多的一種方法。

1.1 RFLP鏈鎖分析

DNA上面特定的核苷酸序列經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶可以完成識(shí)別并切割，因此可以得到相應(yīng)長(zhǎng)度的DNA片段，除此之外，堿基突變可能導(dǎo)致酶切位點(diǎn)丟失，也會(huì)使得酶切位點(diǎn)形成，這樣會(huì)促使酶切片段大小被改變[4]。突變的基因在經(jīng)相關(guān)限制性內(nèi)切酶水解之后，會(huì)改變電泳條帶的大小以及數(shù)量，依照這類變化能夠?qū)ν蛔兊拇嬖谂c否進(jìn)行判斷。但是限制性內(nèi)切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）鏈鎖分析的不足在于無法將受檢者突變基因的類型直接測(cè)出，同時(shí)這一分析操作起來難度較大。

1.2 寡核苷酸(ASO)探針雜交

通過引物擴(kuò)增珠蛋白基因的，合成寡核苷酸探針，其和正常以及突變序列完全為互補(bǔ)關(guān)系。點(diǎn)上PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于尼龍膜上，將正常、突變ASO探針分別完成雜交并進(jìn)行標(biāo)記，假設(shè)探針不能實(shí)現(xiàn)徹底互補(bǔ)，在特定條件下可徹底洗脫，然后經(jīng)放射自顯影全面的對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行觀察[5]。寡核苷酸（ASO）探針雜交這一方法靈敏、快速，但是也存在不足，有很高的DNA數(shù)量以及純度上的要求。當(dāng)前寡核苷酸（ASO）探針雜交這一方法較多應(yīng)用于β-地中海貧血基因診斷。

1.3 PCR體外基因擴(kuò)增

其是一類基因體外擴(kuò)增技術(shù)，DNA聚合酶在PCR的利用下，于體外完成一對(duì)引物間的特異DNA片段催化合成。α-地中海貧血的基因診斷中PCR基礎(chǔ)診斷的應(yīng)用逐漸增多，尤其針對(duì)多重PCR，其特點(diǎn)是有4對(duì)等位基因的特異引物包含在一個(gè)PCR體系內(nèi)，按照不同突變位點(diǎn)完成特異擴(kuò)增，然后完成結(jié)果判定。多重PCR法檢測(cè)右及左缺失、α-珠蛋白基因東南亞缺失。多重PCR可實(shí)現(xiàn)對(duì)缺失型α-地中海貧血的鑒別，還能夠?qū)崿F(xiàn)其的基因分型[6]。通過單管多重PCR的應(yīng)用，能夠?qū)ⅲㄓ壹白笕笔?、?珠蛋白基因東南亞缺失）迅速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出來，對(duì)于α-地中海貧血產(chǎn)前診斷、分子篩查意義突出。

1.4 Southrrn印跡雜交

這重點(diǎn)是用于鑒別DNA靶分子雜交，指的是DNA雜交DNA，在固相支持物上將經(jīng)電泳分離的等待檢測(cè)的DNA片段完成轉(zhuǎn)印以及結(jié)合，繼續(xù)選擇DNA標(biāo)記探針檢測(cè)待測(cè)的DNA。這一方法可檢測(cè)基因缺失狀態(tài)，截至當(dāng)前，這一方法對(duì)于α-地中海貧血的診斷依舊是α-地中海貧血基因診斷的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 缺口PCR（Gap-PCR）

缺口PCR的原理是進(jìn)行2對(duì)或者3對(duì)引物的設(shè)計(jì)，也就是在趨勢(shì)區(qū)域的外側(cè)，在與缺失位點(diǎn)臨近的地方進(jìn)行1對(duì)引物的設(shè)計(jì)，在缺失區(qū)域里面進(jìn)行1對(duì)引物的設(shè)計(jì)。在正常人和雜合子中處于缺失區(qū)域中的引物能擴(kuò)增片段，同時(shí)如果是處于缺失純合子，則不能擴(kuò)增。一對(duì)引物處于缺失區(qū)域外側(cè)，因缺失兩端DNA原本距離很遠(yuǎn)，變得靠近，因而可完成擴(kuò)增特定DNA片段，從而對(duì)純合子患者實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確診斷。研究發(fā)現(xiàn)，通過缺口PCR方法的應(yīng)用，可以將三種缺失型地中海貧血準(zhǔn)確檢測(cè)出來。缺失序列、設(shè)計(jì)引物兩側(cè)翼序列互補(bǔ)，原本正常情況下處在斷裂點(diǎn)兩側(cè)翼相距遙遠(yuǎn)的引物由于基因缺失突變變得臨近，因而能實(shí)現(xiàn)一定長(zhǎng)度片段的擴(kuò)增；缺失區(qū)域有另外一對(duì)引物，當(dāng)處于雜合子情況或完全正常情況下，才能夠完成正常等位基因的擴(kuò)增。這一方法依據(jù)擴(kuò)增片段大小能實(shí)現(xiàn)正常雜合子、純合子個(gè)體的準(zhǔn)確區(qū)分。

1.6 反向點(diǎn)雜交法（PCR-RDB）

和等位基因特異性寡核苷酸探針點(diǎn)雜交原理相比，反向點(diǎn)雜交法的原理存在很大相似性，但是也存在不同，將以往固定靶DNA利用膜上固定探針取代，通過一次雜交能夠檢測(cè)未知樣品之間的多種突變，使得傳統(tǒng)雜交法僅僅能夠?qū)σ环N突變進(jìn)行檢測(cè)這一不足得到改進(jìn)，反向點(diǎn)雜交法的主要特點(diǎn)包括操作簡(jiǎn)便、敏感度高、獲取檢測(cè)結(jié)果速度快，是近些年國(guó)內(nèi)以及國(guó)外使用較多的一種檢測(cè)技術(shù)。有學(xué)者通過反向點(diǎn)雜交法對(duì)β-珠蛋白基因有沒有發(fā)生17個(gè)點(diǎn)的突變進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，獲得了滿意的效果[7]。并且反向點(diǎn)雜交法還能夠?qū)⑼蛔兊木唧w類型：正?；?、雜合子、純合子、雙重雜合子準(zhǔn)確區(qū)分出來，對(duì)于我國(guó)比較多發(fā)的β-地中海貧血基因檢測(cè)非常適用。且該方法還可診斷非缺失型α-地中海貧血突變。

1.7 熒光PCR

相較于普通PCR，熒光PCR的敏感度要高出超過1000倍，選擇各個(gè)顏色的熒光素標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在DNA測(cè)序儀上面將各個(gè)片段、不同顏色PCR擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)，所以可分辨正常、純合子或者雜合子。經(jīng)熒光PCR基因掃描，能對(duì)一些地區(qū)β珠蛋白基因突變進(jìn)行檢測(cè)，熒光PCR的主要特點(diǎn)包括有較高靈敏度、檢測(cè)迅速、操作簡(jiǎn)便等，并且不需要大量DNA樣本。

1.8 基因芯片

依基因芯片上不同位置可觀察的熒光位點(diǎn)顏色不同以及強(qiáng)弱變化實(shí)施地中海貧血基因突變類型的判斷，相較于以往的傳統(tǒng)方法，基因芯片方法基于核酸擴(kuò)增基礎(chǔ)，通過熒光標(biāo)記引物延伸，能夠使檢測(cè)結(jié)果的特異性以及敏感性得到提升。并且因?yàn)榛蛐酒哂懈咄窟@一特點(diǎn)，所以能夠在同一張芯片上完成α、β地中海貧血的基因診斷。這一方法更適用于大面積普查，這一方法的主要特點(diǎn)包括省時(shí)、方便。

2 篩查法

2.1 測(cè)定血常規(guī)

低色素以及小細(xì)胞是地中海貧血的最典型特征，MCH＜27 pg、MCV＜80 fl則是血液學(xué)中最重要的指標(biāo)，符合上述標(biāo)準(zhǔn)的可能是缺鐵性貧血或者地中海貧血。將MCH以及MCV作為初篩地中海貧血的方法價(jià)值明顯。

2.2 對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行檢查

具體有涂片、瑞氏染色，由于貧血程度會(huì)有明顯差別，所以相應(yīng)紅細(xì)胞可能會(huì)表現(xiàn)為不均勻的大小，存在很多不同異常形態(tài)，出現(xiàn)靶形紅細(xì)胞或者嗜堿性點(diǎn)彩紅細(xì)胞等。越嚴(yán)重的貧血，就會(huì)出現(xiàn)越明顯的異形性。

2.3 對(duì)不穩(wěn)定血紅蛋白進(jìn)行測(cè)定

（1）熱變性試驗(yàn)：相較于正常血紅蛋白，不穩(wěn)定血紅蛋白在溫度升高的時(shí)候，發(fā)生沉淀的可能性很大。處于50℃-60℃溫度下，α-地中海貧血的沉淀量會(huì)偏高[9]。但是這一方法缺乏較高的敏感度，并且受比色影響比較大，但是相較于異丙醇試驗(yàn)，這一方法的特異性更高。

（2）異丙醇試驗(yàn)：地貧血液中血紅蛋白存在比較不穩(wěn)定，在37℃的溫度中且濃度為17%的異丙醇溶液中不穩(wěn)定血紅蛋白在5分鐘內(nèi)會(huì)發(fā)生沉淀，在20分鐘時(shí)會(huì)有絮狀形成。

2.4 血紅蛋白電泳

實(shí)驗(yàn)室中對(duì)于異常血紅蛋白的識(shí)別以及檢測(cè)最常應(yīng)用血紅蛋白電泳這一方法，具體包括以下幾種。

（1）珠蛋白肽鏈聚丙烯酰胺凝膠電泳：經(jīng)尿素解離血紅蛋白，組建多肽鏈，不同肽鏈的分離通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的分子篩效應(yīng)和電荷，獲取各個(gè)區(qū)帶，假設(shè)不同類別珠蛋白鏈合量、結(jié)構(gòu)有異常，珠蛋白鏈就會(huì)發(fā)生區(qū)別正常的變化，經(jīng)測(cè)定不同區(qū)帶含量比例，能夠?qū)Ω髦榈鞍谆虻谋磉_(dá)進(jìn)行了解，還能夠基本上將β0-β+、α-地中海貧血檢測(cè)出來[10]。但是這一方法也存在不足，操作比較復(fù)雜，試劑存在比較大的毒性，結(jié)果穩(wěn)定性不滿意，可能導(dǎo)致珠蛋白鏈假陽(yáng)性。

（2）自動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳：點(diǎn)樣前調(diào)整Hb含量為8～12 g/L，稍微稀釋已經(jīng)制備的Hb液，再加入加樣杯中，經(jīng)定量?jī)x器添加樣本到加樣孔，設(shè)置儀器500 V、20℃，實(shí)施電泳處理，時(shí)間為25分鐘，完成后取出，置于儀器染色位置，完成對(duì)應(yīng)程序的設(shè)定，經(jīng)儀器自動(dòng)功能完成各個(gè)環(huán)節(jié)的操作，包括沖洗和染色，脫色以及烘干。結(jié)束之后，電泳膠片直接在全自動(dòng)密度掃描儀上掃描定量各個(gè)成分，得出掃描圖譜。經(jīng)全自動(dòng)瓊脂糖凝膠對(duì)血紅蛋白進(jìn)行電泳后，顯示其對(duì)異常Hb有非常高的分辨力，新生兒Hb Bart，s含量等微量成分能夠清晰顯示1.0%-3.0%的區(qū)帶，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的掃描以及定量。

（3）高效液相色譜（HPLC）：當(dāng)前這一方法多用于HbA2以及HbF的定量分析。有研究證實(shí)，通過這一方法的陰陽(yáng)離子交換層析儀可以實(shí)現(xiàn)血紅蛋白的自動(dòng)化分析，同時(shí)完成測(cè)定抗堿血紅蛋白，能夠得到穩(wěn)定結(jié)果，且檢測(cè)非常簡(jiǎn)便迅速。特別針對(duì)β-珠蛋白生成障礙性貧血，HPLC能快速實(shí)現(xiàn)診斷。

（4）毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CEl）：毛細(xì)管區(qū)帶全自動(dòng)電泳法是在石英管（充滿緩沖液）中實(shí)施電泳的方法。溶血試劑中置入的紅細(xì)胞樣品進(jìn)行稀釋后在毛細(xì)管陽(yáng)極端進(jìn)行注射，通過高電壓的作用完成分離，在陰極端415nm的波長(zhǎng)下對(duì)血紅蛋白各組分含量進(jìn)行直接檢測(cè)。這一方法能夠自動(dòng)鑒別以及定量HbA2區(qū)帶，能夠有效區(qū)分聚焦HbA以及HbS間的HbF，同時(shí)能夠?qū)ζ溟_展精準(zhǔn)的測(cè)量。

3 結(jié) 語(yǔ)

由于科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)室當(dāng)前對(duì)于地中海貧血的檢測(cè)在技術(shù)方面也得到顯著提高，基因診斷以及篩查技術(shù)成熟度不斷提高?；蚍治鲇糜诘刂泻Ｘ氀脑\斷可靠性最高，不過這一方法操作比較復(fù)雜、需要花費(fèi)的時(shí)間比較長(zhǎng)、對(duì)操作人員的技術(shù)要求也非常高的，所以還無法廣泛推廣。因此臨床必須繼續(xù)加強(qiáng)研究，不斷推出更快速方便、更準(zhǔn)確，更便于推廣的地中貧血的檢測(cè)技術(shù)，為臨床診斷和治療地中海貧血提供更科學(xué)的指導(dǎo)依據(jù)。

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本文編輯：吳玲麗

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ISSN.2095-8242.2017.16.3167.02