生物膜研究相關(guān)進(jìn)展

林迪，孫長(zhǎng)貴(解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 310013)

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生物膜研究相關(guān)進(jìn)展

林迪，孫長(zhǎng)貴
(解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 310013)

生物膜是微生物為了適應(yīng)生存環(huán)境，被自身產(chǎn)生的胞外聚合物包裹的高度密集微生物群體。大部分細(xì)菌和真菌感染都與生物膜相關(guān)。生物膜的形成不僅降低了抗菌藥物的療效，增加了微生物對(duì)抗菌藥物的耐藥性，并且能夠幫助微生物逃脫宿主的免疫攻擊，從而容易造成治療過(guò)程中或是治愈后感染的復(fù)發(fā)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。該文就生物膜概念及形成機(jī)制、生物膜與相關(guān)感染、生物膜與微生物耐藥性、生物膜實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及其防治作簡(jiǎn)要綜述。

生物膜；微生物；耐藥性；感染

美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院估計(jì)，超過(guò)60%的微生物感染有生物膜(biofilm)的參與，其大幅度降低了抗菌藥物的療效，并削弱了患者的免疫防御功能，使抗感染治療變得極其困難[1]。20世紀(jì)70年代，生物膜研究的先驅(qū)William J.Costerton首先介紹了生物膜的概念。雖然最初的研究只限于體外以及環(huán)境中細(xì)菌，但隨著生物膜相關(guān)危害的嚴(yán)重性日益被認(rèn)識(shí)，對(duì)生物膜的研究越來(lái)越多，更多的研究關(guān)注于微生物感染過(guò)程中形成的醫(yī)學(xué)生物膜[2]。本文就生物膜概念、生物膜相關(guān)疾病、生物膜與微生物耐藥性、生物膜實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及其防治作簡(jiǎn)要綜述。

1　生物膜概念及形成機(jī)制

目前普遍認(rèn)為生物膜是微生物被自身分泌的水合多聚物包裹，覆蓋于固體表面含有微生物集落的黏性膜層，可由單一菌種形成，也可由多菌種形成，是微生物抵抗不利環(huán)境的一種不可逆的生存方式。其與浮游(懸浮或自由浮動(dòng))狀態(tài)下的微生物有顯著的區(qū)別，如表型變異、基因轉(zhuǎn)錄及代謝機(jī)制的改變等方面[3-5]。生物膜形成的基本要素有固體物表、高度密集的微生物(近似每毫升含水生物膜中有1010個(gè)細(xì)胞)、胞外聚合物(extracellular polymer, EPS)與胞外黏性基質(zhì)、各種復(fù)雜的理化過(guò)程以及微生物群落之間的相互作用，但是并非所有的生物膜都具有這些特點(diǎn)。其中，EPS由微生物自身產(chǎn)生，是生物膜的主要成分，由胞外多糖、聚糖醛酸、蛋白質(zhì)、核酸以及脂質(zhì)構(gòu)成[5]。

生物膜的形成是一個(gè)層遞、動(dòng)態(tài)的過(guò)程，各種不同的物理、化學(xué)、遺傳、生物作用都參與生物膜的最終成熟。雖然生物膜形成機(jī)制沒(méi)有清楚的定義，但至少涉及以下5個(gè)步驟。(1)可逆性附著：微生物依靠細(xì)胞表面電荷、范德華力、疏水性和靜電力等可逆性附著于物體表面。(2)產(chǎn)生群體感應(yīng)(quorom sensing，QS)系統(tǒng)和EPS，形成不可逆附著：微生物聚集、黏附于有生命或無(wú)生命物體表面后表達(dá)特定的QS分子進(jìn)行基因調(diào)控。目前已確定的控制微生物生物膜形成的QS系統(tǒng)有4種，其中革蘭陰性細(xì)菌具有自誘導(dǎo)物1(autoinducer-1, AI-1)和自誘導(dǎo)物3(autoinducer-3, AI-3),革蘭陽(yáng)性細(xì)菌有自誘導(dǎo)信號(hào)肽(autoinducing peptide, AIP)，可負(fù)責(zé)種內(nèi)通信；革蘭陰性和革蘭陽(yáng)性細(xì)菌均表達(dá)自誘導(dǎo)物2(autoinducer-2, AI-2)，可負(fù)責(zé)種間細(xì)胞通信。當(dāng)自誘導(dǎo)物分子表達(dá)達(dá)到臨界濃度，就會(huì)在微生物菌落表面形成EPS，從而保護(hù)細(xì)胞并將其附著于物表。(3)微菌落形成：EPS形成后，大多數(shù)微生物鞭毛、纖毛和菌毛運(yùn)動(dòng)性降低，于附著物表面形成微菌落。(4)定植或成熟：成熟生物膜形成特征性蘑菇狀或郁金香型三維立體結(jié)構(gòu)，并可見(jiàn)EPS包被的非運(yùn)動(dòng)性微生物以及營(yíng)養(yǎng)物、水通道。(5)播散：微生物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酶、外部環(huán)境的影響以及人體內(nèi)相互作用都可能導(dǎo)致生物膜中微生物細(xì)胞的播散[6]。

2　生物膜與相關(guān)感染

近些年，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，導(dǎo)尿管、中心靜脈導(dǎo)管、人工心臟瓣膜、支架等侵入性醫(yī)療器械得到廣泛應(yīng)用。微生物易附著于醫(yī)療器械表面形成生物膜，醫(yī)用生物材料相關(guān)生物膜感染率因此逐年上升。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)黏液性銅綠假單胞菌最易發(fā)生黏附形成生物膜，其他生物醫(yī)學(xué)材料相關(guān)感染細(xì)菌主要涉及腸球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等[7-8]。此外，真菌如白念珠菌、新型隱球菌、煙曲霉、莢膜組織胞漿菌等均能形成生物膜。

人體中，生物膜好發(fā)于小腸刷狀緣(霍亂弧菌)、尿道黏膜(淋病奈瑟菌)、腸淋巴結(jié)(鼠傷寒沙門(mén)菌)、抗菌藥物頑固性粉刺、慢性感染的扁桃體等部位[9]。牙菌斑就是由多種微生物組成的口腔生物膜結(jié)構(gòu)，牙周炎則是口腔生物膜中微生物之間相互作用的典型例子。臨床上一些急性感染通常可被抗生素有效治療，而慢性感染往往涉及生物膜，不易治愈，易于復(fù)發(fā)，如慢性呼吸道感染、慢性中耳炎、肺囊性纖維化、慢性前列腺炎、慢性鼻竇炎等。多數(shù)感染性心內(nèi)膜炎患者心臟瓣膜受損，主要致病菌(鏈球菌、腸球菌和葡萄球菌)更容易黏附定植形成生物膜[10]。此外，生物膜可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但抗體不能有效殺死生物膜內(nèi)微生物，反而形成免疫復(fù)合物破壞周?chē)M織，從而引起變態(tài)反應(yīng)性疾病。

3　生物膜與微生物耐藥性

傳統(tǒng)觀點(diǎn)通常認(rèn)為，微生物的耐藥由滅活酶與鈍化酶的產(chǎn)生、抗菌藥物滲透屏障和主動(dòng)外排泵作用、藥物作用靶位結(jié)構(gòu)改變等因素所導(dǎo)致[11]，但是生物膜的形成也是一個(gè)重要的原因。生物膜的形成可使抗菌藥物耐藥性提高10～1 000倍[12]，即使不攜帶耐藥基因的微生物一旦形成生物膜，抗菌藥物的敏感性也會(huì)大幅度降低，當(dāng)生物膜被破壞后，其抗菌藥物敏感性又可恢復(fù)。生物膜對(duì)抗菌藥物敏感性降低被認(rèn)為是一系列機(jī)制共同作用的結(jié)果。生物膜造成耐藥的機(jī)制主要包括以下幾種。

3.1抗菌藥物滲透緩慢或不完全抗菌藥物在糖蛋白或多糖中的擴(kuò)散速度為在純水中的36%～76%，這會(huì)導(dǎo)致抗菌藥物在生物膜中的殺菌能力降低，同時(shí)抗菌藥物的物理流動(dòng)并不能確保所有的抗菌藥物100%滲透進(jìn)生物膜[11]。一項(xiàng)研究表明，生物膜EPS攜帶負(fù)電荷，而氨基糖苷類抗菌藥物攜帶正電荷[11]，這可能也是抗生素滲透障礙的原因。但是有體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)情況下抗菌藥物在滲透進(jìn)入生物膜時(shí)并未大量被中和或吸附，還是可以很快滲透到部分微生物生物膜內(nèi)部，如喹諾酮類、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素等[13-15]，只有β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗菌藥物明顯被生物膜限制，存在嚴(yán)重滲透障礙。由此可見(jiàn)，滲透障礙并非造成微生物耐藥的主要原因。

3.2微環(huán)境改變與緩慢生長(zhǎng)抗菌藥物(例如青霉素)殺菌作用往往是生長(zhǎng)依賴的，只對(duì)生長(zhǎng)期的微生物具有殺菌作用[11]。研究人員通過(guò)熒光探針和報(bào)告基因技術(shù)對(duì)生物膜中微生物生長(zhǎng)模式與代謝活性情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)生物膜中代謝產(chǎn)物濃度、營(yíng)養(yǎng)成分由外到內(nèi)呈梯度分布。此外，氧氣濃度和pH值等也會(huì)共同作用使生物膜微環(huán)境發(fā)生特殊改變。在這種特殊微環(huán)境下，微生物長(zhǎng)期處于饑餓狀態(tài)，生長(zhǎng)緩慢或處于靜止?fàn)顟B(tài)，對(duì)抗菌藥物的敏感性低于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物，當(dāng)停止使用抗菌藥物治療后，存留微生物利用死亡微生物為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行繁殖，重新形成生物膜，致使感染反復(fù)發(fā)作，最后往往演變成慢性感染[11,16]。

3.3基因誘導(dǎo)生物膜表型改變一些獨(dú)特基因會(huì)參與改變微生物的代謝途徑，誘導(dǎo)表達(dá)特異性生物膜表型，從而起到保護(hù)生物膜作用。例如，Muca基因的突變會(huì)導(dǎo)致銅綠假單胞菌EPS藻酸鹽的大量產(chǎn)生，使其生物膜比野生型要厚，并從非黏液表型向黏液表型轉(zhuǎn)變，形成具有保護(hù)性的生物表型，從而導(dǎo)致耐藥[17]。此外，rpoS基因突變的銅綠假單胞菌其生物膜要比野生型更厚，并使其對(duì)妥布霉素的敏感性降低[11]；gacA基因能促進(jìn)生物膜成熟，其突變會(huì)使抗菌藥物殺菌作用增強(qiáng)[11]。

3.4應(yīng)激反應(yīng)的激活微生物可以進(jìn)行大量的應(yīng)激反應(yīng)來(lái)適應(yīng)環(huán)境的波動(dòng)(例如溫度變化、氧化應(yīng)激、低水分活性、DNA損傷、饑餓狀態(tài)等)，屬于一種保護(hù)性反應(yīng)。應(yīng)激反應(yīng)下的生物膜微生物在分子和遺傳特征方面有別于浮游微生物[11]。σ因子RpoS是一種應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控因子，已經(jīng)在銅綠假單胞菌生物膜中檢測(cè)到，rpoS基因轉(zhuǎn)錄物也被發(fā)現(xiàn)于囊性纖維化患者的痰液中，這表明生物膜內(nèi)低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物堆積等造成的微環(huán)境的改變激活了σ因子RpoS的表達(dá)，脅迫微生物發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)抵抗環(huán)境壓力以及抗菌藥物的作用[18]；但是rpoS基因突變體形成的生物膜抗菌藥物敏感性研究不支持該基因保護(hù)生物膜的作用[19]，所以其在生物膜耐藥性中的作用還有待研究。

3.5外排泵系統(tǒng)生物膜中多種藥物外排泵的組成型表達(dá)也可能是造成耐藥的原因；研究人員利用DNA微陣列等方法，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌和白色念珠菌生物膜中外排泵基因的表達(dá)高于浮游微生物[19]，由此可見(jiàn)生物膜加強(qiáng)了抗微生物藥物外排泵的合成，導(dǎo)致生物膜微生物耐藥性的出現(xiàn)。

3.6抗菌藥物水解酶Elkins等[11]研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌生物膜能夠激活誘導(dǎo)型過(guò)氧化氫酶基因katB。Strathmann等[20]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌生物膜形成后β-內(nèi)酰胺酶的活性顯著增加，青霉素和頭孢類抗菌藥物的抗菌效果明顯下降，由此可見(jiàn)生物膜會(huì)加強(qiáng)部分抗菌藥物水解酶的表達(dá)。

3.7持留菌雖然抗菌藥物和化學(xué)消毒劑等能殺死大部分生物膜(包括雙層生物膜)內(nèi)的微生物，但仍會(huì)有少部分存活，這些存留微生物受到高度保護(hù)，對(duì)抗菌藥物表現(xiàn)出高耐藥性，即使延長(zhǎng)抗菌藥物治療也不受影響[11]。Lewis等[21]研究發(fā)現(xiàn)持留狀態(tài)下的大腸埃希菌高表達(dá)hip基因，因此一些編碼調(diào)節(jié)回路的基因被認(rèn)為有助于微生物轉(zhuǎn)變?yōu)槌至魻顟B(tài)，并發(fā)生一些特殊的保護(hù)性反應(yīng)，從而造成生物膜對(duì)抗菌藥物敏感性的降低。

3.8QS系統(tǒng)QS系統(tǒng)是微生物間通過(guò)分泌、釋放一些特定的信號(hào)分子，以“集體作戰(zhàn)”方式來(lái)應(yīng)對(duì)生存環(huán)境變化的群體行為，可發(fā)生于種間或種內(nèi)。當(dāng)生物膜內(nèi)微生物數(shù)量過(guò)多時(shí)，QS會(huì)使部分微生物從生物膜表面脫離，導(dǎo)致感染擴(kuò)散或復(fù)發(fā)，引起臨床癥狀。另外有研究表明QS調(diào)節(jié)在紅霉素耐藥性增加中起重要作用[16]。

4　生物膜實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

4.1染色法

4.1.1結(jié)晶紫染色法培養(yǎng)物生物膜經(jīng)過(guò)結(jié)晶紫染色、沖洗、脫色后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定590 nm處的吸光度[22]。該法可同時(shí)對(duì)生物膜進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，且可在普通實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。

4.1.2阿利新藍(lán)-剛果紅染色法微生物細(xì)胞外多糖被阿利新藍(lán)-剛果紅復(fù)合染液染成深紅色，生物膜為黃色，背景為淡藍(lán)色，以此來(lái)檢測(cè)生物膜形成情況[23]。另外，剛果紅培養(yǎng)基(0.8 g/L，腦心浸液干粉37 g/L，蔗糖50 g/L，瓊脂12 g/L)法也被用來(lái)檢測(cè)生物膜，研究人員將微生物接種于剛果紅培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，若出現(xiàn)褐紅色、干燥菌落則為生物膜陽(yáng)性[24]。但有研究發(fā)現(xiàn)該方法不適用于檢測(cè)葡萄球菌生物膜。

4.1.3快速銀染法快速銀染法主要利用陰離子被還原成金屬銀而使生物膜中的多糖蛋白復(fù)合物染成灰褐色或灰黑色，以此來(lái)觀察不同階段生物膜中多糖蛋白復(fù)合物的動(dòng)態(tài)變化情況。該方法操作方便，敏感性較好，試劑價(jià)格低廉，普通的微生物實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行操作。該染色法只能用于初步觀察生物膜的形成，無(wú)法檢測(cè)其黏附能力、空間分布等。

4.2顯微鏡檢測(cè)法掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡等都被用來(lái)研究生物膜，但其中大多數(shù)微觀方法都涉及樣本的制備(包括染色、固定、冷凍、脫水、包埋、切片)，但是生物膜很柔軟且水分含量很高，制片時(shí)細(xì)胞膜容易發(fā)生收縮并變形，從而引起生物膜結(jié)構(gòu)和組成成分的改變，使觀察結(jié)果與實(shí)際情況存在差異[5]。激光掃描聚焦顯微鏡是目前研究生物膜較理想的方法，其無(wú)需進(jìn)行樣本制備，可以較好地保持生物膜結(jié)構(gòu)的完整性，同時(shí)可結(jié)合二乙酸和鈣黃綠素等熒光染料觀察生物膜中的各種成分、三維結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化過(guò)程[25]。原子力顯微鏡由于其分辨率高(達(dá)納米級(jí))，樣品制備簡(jiǎn)單，在近年來(lái)也被較多地用于研究生物膜動(dòng)態(tài)形成過(guò)程中的表面變化。

4.3熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)FISH是較新發(fā)展的用于生物膜微生物群落量化分析以及確定微生物種群空間分布情況的技術(shù)。FISH不需提取核酸，可直接利用熒光寡核苷酸探針標(biāo)記進(jìn)行原位雜交，探針可以用不同熒光染料標(biāo)記，每種熒光劑都有不同的激發(fā)譜和發(fā)射譜，因此，可同時(shí)使用兩種或兩種以上(最多可達(dá)7種)探針檢測(cè)不同種群。FISH靈敏度高、檢測(cè)快速，但熒光弱易導(dǎo)致假陰性，并且只能確定微生物種群空間分布情況，無(wú)法判斷其是否具有活性[5]。

4.4PCR基因檢測(cè)技術(shù)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因PCR檢測(cè)成為一種免培養(yǎng)、快速有效診斷生物膜陽(yáng)性率的技術(shù)。生物膜形成相關(guān)的基因有rpoS(銅綠假單胞菌)、mbaA(霍亂弧菌)、icaABCD(葡萄球菌)等[26-28]。

4.5報(bào)告基因報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，將其與目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用其表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，所以利用轉(zhuǎn)入生物膜中的熒光蛋白自身發(fā)光即可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察生物膜及其空間分布情況。常用的報(bào)告基因有螢火蟲(chóng)熒光素酶、細(xì)菌熒光素酶以及熒光蛋白家族的綠熒光蛋白。

5　生物膜的防治

5.1物理方法對(duì)于已形成的生物膜可采取機(jī)械、超聲波、電擊等方法清除。

5.2噬菌體噬菌體在環(huán)境中無(wú)處不在，大部分噬菌體具有溶胞作用、宿主特異性，并且對(duì)人類無(wú)毒，由于其必須穿透宿主EPS進(jìn)行復(fù)制，所以在一定程度上可以控制生物膜的形成[6]。

5.3QS?；呓z氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactones, AHLs)是調(diào)控QS系統(tǒng)的關(guān)鍵信號(hào)分子，一些細(xì)菌、真菌和植物可分泌抗QS分子(如AHL內(nèi)酯酶)從而抑制或降低QS，影響生物膜的形成。AHL內(nèi)酯酶廣泛存在于微生物中，具有較好的應(yīng)用前景，但其作用機(jī)制尚未完全清楚，目前相關(guān)研究和報(bào)道也較少[6]。

5.4EPS崩解部分微生物分泌的抗黏附多糖或蛋白質(zhì)可以減少生物膜的產(chǎn)生，如多糖解聚酶、酯酶和Dispersin B等促解離劑能破壞已形成的生物膜，使消毒劑可以更好地作用于生物膜內(nèi)的微生物[6]。

5.5光敏劑光敏作用是涉及光敏劑、光以及氧氣的非熱處理方法。Luksiene等[29]研究表明光敏作用可以殺死食源性病原菌生物膜。

5.6抗生物膜活性生物化合物許多植物和微生物尤其是海洋細(xì)菌能分泌抗生物膜化合物，如蔗糖脂肪酸、萘環(huán)衍生物等均可減少體外生物膜的形成[30-31]。Jiang等[32]最新研究顯示，海洋弧菌對(duì)銅綠假單胞菌具有抗生物膜活性，但對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)效。Sayem等[33]發(fā)現(xiàn)從地衣芽胞桿菌分離出的EPS對(duì)大腸埃希菌和熒光假單胞菌具有抗生物膜活性。Dheilly等[34]報(bào)道交替假單胞菌屬培養(yǎng)上清液對(duì)腸道沙門(mén)菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌具有抗生物膜活性。

5.7金屬離子銀離子、銅離子、鈣離子等都被證明對(duì)生物膜的形成有一定的抑制作用。

5.8新型抗菌生物材料微生物黏附是生物膜形成的第一步，所以改變生物材料理化性質(zhì)或在生物材料表面涂抹具有抗菌生物活性和抑制微生物黏附的物質(zhì)(如銀)，可有效減少生物膜的形成。

5.9藥物防治兩性霉素B對(duì)念珠菌生物膜具有獨(dú)特藥效，棘白菌素類藥物也可顯著抑制白念珠菌生物膜的形成[35]。體外研究表明，部分大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能進(jìn)入生物膜內(nèi)層，具有抗生物膜作用；大蒜素可抑制EPS的合成，從而抑制生物膜的形成?？股芈?lián)合使用對(duì)生物膜有顯著抑制作用，如羅紅霉素和氟羅沙星合用，羅紅霉素通過(guò)抑制細(xì)菌多糖蛋白復(fù)合物合成來(lái)增強(qiáng)氟羅沙星對(duì)生物膜的滲透。所以，新型生物膜特異性抗生素的研發(fā)有利于控制生物膜感染。此外，新型藥物傳輸系統(tǒng)如脂質(zhì)體、類脂質(zhì)體、聚合物粒子以及樹(shù)狀聚合物等均可提高抗菌藥物在生物膜中的透過(guò)性，從而提高藥效[1]。

6　結(jié)語(yǔ)

生物膜特殊結(jié)構(gòu)所致的獨(dú)特耐藥性使得生物膜相關(guān)性感染成為慢性、難治性疾病?，F(xiàn)在許多抗菌藥物被用來(lái)對(duì)抗微生物生物膜，但抗菌藥物的不合理治療也可能導(dǎo)致低效的生物膜控制以及耐藥性的傳播。隨著對(duì)生物膜耐藥機(jī)制、檢測(cè)方法、防控手段等研究的不斷深入，以及對(duì)抗生物膜新型藥物的研發(fā)，相信在不久的將來(lái)，生物膜相關(guān)感染可以得到有效的控制。

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(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.01

林迪，1987年生，女，大學(xué)本科，技師，從事臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)。

孫長(zhǎng)貴，主任技師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail: suncgui@163.com。

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2017-01-09)