胃癌患者組織p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性

王靜，王亞明，霍雙，吳士茜，孫穎，袁艷龍，王杰，田云霄，張桂東，劉博

(邯鄲市中心醫(yī)院病理科1、普外科2、科教科3、泌尿外科4、急診外科5，河北 邯鄲056001)

胃癌患者組織p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性

王靜1，王亞明2，霍雙3，吳士茜1，孫穎1，袁艷龍1，王杰4，田云霄1，張桂東2，劉博5

(邯鄲市中心醫(yī)院病理科1、普外科2、科教科3、泌尿外科4、急診外科5，河北 邯鄲056001)

目的 探討胃癌患者組織磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。方法 于2013年1月至12月對(duì)邯鄲市中心醫(yī)院收治的89例胃癌患者采用免疫組化法檢測(cè)胃組織標(biāo)本中p-mTOR的表達(dá)，分析其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、組織分化程度和病理分期的相關(guān)性，并按p-mTOR的不同表達(dá)情況比較患者的預(yù)后。結(jié)果p-mTOR陽(yáng)性率為77.53%(69/89)，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者p-mTOR陽(yáng)性率為90.20%，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的60.53%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)深度、組織分化及腫瘤分期均呈正相關(guān)(P＜0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.65、0.69和0.64。p-mTOR低表達(dá)組的疾病無進(jìn)展中位生存期為23.5個(gè)月，顯著長(zhǎng)于高表達(dá)組的12.8個(gè)月，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論p-mTOR在胃癌患者體內(nèi)高表達(dá)，檢測(cè)p-mTOR的表達(dá)有利于患者的預(yù)后評(píng)估。

胃癌；磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；免疫組化；預(yù)后；相關(guān)性

胃癌(gastric cancer，GC)是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，作為全球常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌與腸癌之后，且在惡性腫瘤死因順位中列第二位。我國(guó)是胃癌高發(fā)地區(qū)，每年新發(fā)和死亡病例分別約為40萬和35萬，嚴(yán)重威脅生命健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、逃避凋亡起著重要的調(diào)控作用[2]。磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)相關(guān)信號(hào)通路的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及蛋白質(zhì)合成是其主要的生物學(xué)功能。p-mTOR在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、新生血管的生成、浸潤(rùn)、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要影響[3]，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且與腫瘤分級(jí)呈現(xiàn)明顯相關(guān)性[4-5]。目前，p-mTOR與胃癌的關(guān)系報(bào)道很少，本研究采用免疫組化方法分析p-mTOR在胃癌患者胃癌組織中的表達(dá)，探討其表達(dá)水平與胃癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，為今后胃病患者的個(gè)體化治療和預(yù)后評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2013年12月在本院經(jīng)胃鏡病理證實(shí)為胃部惡性腫瘤、擬行胃癌根治切除術(shù)的胃癌患者89例，其中男性54例，女性35例；年齡38～72歲，平均(58.52±12.32)歲。參照1997年UICC臨床TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期12例，Ⅱ期24例，Ⅲ期26例，Ⅳ期27例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例；組織學(xué)類型：高分化腺癌25例、中分化腺癌28例、低分化腺癌36例；浸潤(rùn)黏膜及黏膜下層28例，浸潤(rùn)肌層30例，浸染漿膜層及漿膜層以上31例。另隨機(jī)抽取25例胃癌切緣黏膜作為正常對(duì)照組(均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí))。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入的所有胃癌病例均為初治患者，入選前均沒有接受放療、化療或者激素及非甾體類藥物治療；病理學(xué)診斷明確；均在本院接受規(guī)范化根治性胃癌切除治療，有完整的病歷資料。排除術(shù)后病理提示為胃肉瘤、胃淋巴瘤等其他組織來源惡性腫瘤、有出血/血栓性疾病或惡性腫瘤已出現(xiàn)骨髓轉(zhuǎn)移、近3個(gè)月內(nèi)使用腎上腺皮質(zhì)激素、雌激素、阿司匹林等影響凝血功能藥物者、一般情況差、合并嚴(yán)重心腦血管疾病或有嚴(yán)重肝、腎臟器功能障礙者、近3個(gè)月內(nèi)曾接受手術(shù)治療者。

1.3 主要試劑 兔抗人p-mTOR多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld生物公司，免疫組織化學(xué)SP試劑盒、DAB顯色試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.4 研究方法 取手術(shù)切除胃癌標(biāo)本，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋組織標(biāo)本，切成厚度為4 μm的切片，60℃過夜，經(jīng)過二甲苯、乙醇脫蠟，使用蒸餾水及磷酸鹽緩沖液(PBS)各沖洗3次，采用3%甲醇雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)和血清封閉后，添加一抗、二抗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，并用已知的p-mTOR蛋白陽(yáng)性的胃癌切片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 結(jié)果判斷p-mTOR蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，陽(yáng)性染色為呈黃色顆粒沉著者。計(jì)算每高倍視野中陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分率，0分為無陽(yáng)性細(xì)胞者，1分為陽(yáng)性細(xì)胞＜10%者；2分為陽(yáng)性細(xì)胞在11%～50%者；3分為陽(yáng)性細(xì)胞在51%～80%者；4分為陽(yáng)性細(xì)胞＞80%者。并按照染色深度分為：0分為細(xì)胞不顯色；1分為淺棕黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。以兩者乘積為最后得分：(-)為0分；(+)為1～4分；(++)為5～8分；(+++)為9～12分。

1.6 術(shù)后隨訪 患者術(shù)后均順利出院。出院后采用電話或門診復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，隨訪間隔為3個(gè)月，隨訪起始時(shí)間為術(shù)后病理確診日期，隨訪截止時(shí)間為2015年12月?？偵嫫谑侵笍拇_診時(shí)間至疾病進(jìn)展或隨訪截止的時(shí)間。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher's精確概率檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，使用Log-rank檢驗(yàn)比較組間的無進(jìn)展生存情況。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α取值為0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的p-mTOR的陽(yáng)性等級(jí)比較89例胃癌患者中，共69例患者p-mTOR表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為77.53%，而25例正常胃黏膜中，p-mTOR陽(yáng)性4例，陽(yáng)性率為16%，兩組受檢者的p-mTOR表達(dá)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.15，P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的p-mTOR陽(yáng)性等級(jí)比較[例（%）]

2.2 p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 胃癌組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的51例患者中，p-mTOR陽(yáng)性有46例，陽(yáng)性率為90.20%；而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的38例患者中，p-mTOR陽(yáng)性有23例，陽(yáng)性率為60.53%。兩組p-mTOR的表達(dá)等級(jí)情況見表2，兩組p-mTOR不同等級(jí)構(gòu)成比的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.22，P＜0.05)。

表2 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組的p-mTOR陽(yáng)性等級(jí)情況[例（%）]

2.3 p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)深度的關(guān)系 癌組織浸潤(rùn)在黏膜及黏膜下層p-mTOR陽(yáng)性有13例，陽(yáng)性率為46.42%；癌組織浸潤(rùn)肌層者p-mTOR陽(yáng)性26例，陽(yáng)性率為86.67%；癌組織浸潤(rùn)漿膜層及漿膜層以上p-mTOR陽(yáng)性30例，陽(yáng)性率為96.77%。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)深度呈較強(qiáng)的正相關(guān)(r=0.65，P＜0.01)，見表3。

表3 p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)深度的相關(guān)性(例)

2.4 p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與組織類型分化的關(guān)系 高分化組p-mTOR陽(yáng)性有12例，陽(yáng)性率為48.00%；中分化組p-mTOR陽(yáng)性23例，陽(yáng)性率為82.14%；低分化組p-mTOR陽(yáng)性34例，陽(yáng)性率為94.44%。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與組織分化程度呈較強(qiáng)的正相關(guān)(r=0.69，P＜0.01)，見表4。

表4 p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與組織分化程度的相關(guān)性（例）

2.5 p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤病理分期的關(guān)系 Ⅰ期組p-mTOR陽(yáng)性有5例，陽(yáng)性率為41.67%；Ⅱ期組p-mTOR陽(yáng)性18例，陽(yáng)性率為75.00%；Ⅲ期組p-mTOR陽(yáng)性21例，陽(yáng)性率為80.77%；Ⅳ期組p-mTOR陽(yáng)性25例，陽(yáng)性率為92.59%。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤病理分期呈較強(qiáng)正相關(guān)(r=0.64，P＜0.01)，見表5。

表5 p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期的相關(guān)性（例）

2.6 p-mTOR的表達(dá)與胃癌預(yù)后的關(guān)系 將p-mTOR按評(píng)分劃為低表達(dá)組(評(píng)分為4分及以下)34例和高表達(dá)組(5分以上)55例，低表達(dá)組與高表達(dá)組的疾病無進(jìn)展中位生存期分別為23.5個(gè)月和12.8個(gè)月，兩組生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank χ2= 28.72，P＜0.01)。

3 討論

胃癌細(xì)胞自身具有的下調(diào)細(xì)胞間相互粘附性、促進(jìn)微血管增生、降解周圍基質(zhì)等功能是促進(jìn)癌細(xì)胞增生、侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)基礎(chǔ)，也是影響胃癌臨床療效和預(yù)后的主要原因[6]。p-mTOR是蘇氨酸激酶/絲氨酸的一種，它位于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/鼠類胸腺瘤病毒致癌基因同源物(Akt)/mTOR信號(hào)通路的下游，它一方面可以接受細(xì)胞外生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)素的等來自上游的信息刺激；另一方面，mTOR將信息進(jìn)一步傳遞給下游，從而對(duì)細(xì)胞周期的進(jìn)展發(fā)揮影響，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)分化。PI3K/Akt途徑在腫瘤中被激活后可引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，從而引發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展。這種編碼mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的基因突變存在于多種腫瘤中，蛋白的異常表達(dá)能夠使mTOR通路激活過度。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路失調(diào)與乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系，mTOR是腫瘤發(fā)生過程中的一個(gè)決定性因子，通過PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活并磷酸化后形成p-mTOR。p-mTOR可以降低細(xì)胞凋亡、加速細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。對(duì)p-mTOR的相關(guān)分子作用機(jī)制研究顯示，p-mTOR可以通過對(duì)其下游分子4EBP1的激活，抑制不依賴p53的細(xì)胞凋亡[7-8]，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞與新生血管生成加速[9-10]，并增強(qiáng)對(duì)抗腫瘤藥物的抵抗[11]，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[12-14]。陳業(yè)剛等[5]通過對(duì)p-mTOR與膀胱癌的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)p-mTOR能促使膀胱上皮增生活躍，且p-mTOR是膀胱癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?？梢姡琾-mTOR在人體許多癌癥細(xì)胞中表達(dá)水平高，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、侵襲、轉(zhuǎn)移等具有重要影響。通過對(duì)p-mTOR的檢測(cè)能夠反映mTOR通路的激活狀態(tài)，并成為腫瘤治療中的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

p-mTOR與胃癌的關(guān)系的研究較少。有研究表明，p-mTOR在胃癌的發(fā)展中呈現(xiàn)過度表達(dá)。本研究顯示p-mTOR在胃癌中的陽(yáng)性率為77.53%，高于徐大志等[15]的研究，而與Lang等[16]的研究比較接近。本研究顯示，p-mTOR在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的陽(yáng)性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，與同類研究結(jié)果一致[15]。并且p-mTOR陽(yáng)性表達(dá)情況與癌組織浸潤(rùn)程度、組織分化程度及病理分期呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明癌組織浸潤(rùn)程度越深、組織分化程度越差、病理分期越高，p-mTOR陽(yáng)性表達(dá)率越高，許星宇等[17]的研究也證明了類似的結(jié)論。推測(cè)p-mTOR的陽(yáng)性表達(dá)可能從上述幾方面影響胃癌患者的預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn)，p-mTOR低表達(dá)組的疾病無進(jìn)展中位生存期顯著高于p-mTOR高表達(dá)組，兩組生存率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，p-mTOR的激活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要的作用，p-mTOR的測(cè)定對(duì)于胃癌的治療和預(yù)后判斷可以提供積極的指導(dǎo)作用。

綜上所述，p-mTOR在胃癌患者體內(nèi)高表達(dá)，對(duì)于胃癌的發(fā)生、侵襲、進(jìn)展起著較重要的作用。檢測(cè)p-mTOR可為患者的預(yù)后評(píng)估提供參考意義，p-mTOR可能成為預(yù)測(cè)胃癌進(jìn)展的新型分子標(biāo)志物，并且有望成為胃癌靶向治療的有效靶點(diǎn)。

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Correlation of positive expression of p-mTOR with clinicopathological factors and prognosis in gastric cancerpatients.

WANG Jing1,WANG Ya-ming2,HUO Shuang3,WU Shi-xi1,SUN Ying1,YUAN Yan-long1,WANG Jie4,TIAN Yun-xiao1,ZHANG Gui-dong2,LIU Bo5.Department of Pathology1,Department of General Surgery2,Department of Science and Education3,Department of Urinary Surgery4,Department of Emergency Surgery5,Handan Municipal Central Hospital,Handan 056001,Hebei,CHINA

ObjectiveTo analyze the correlation of positive expression of phosphorylated mammalian target of raphmycin(p-mTOR)with clinicopathological factors and prognosis in gastric cancer patients.MethodsThe expression of p-mTOR of stomach tissue specimens from 89 gastric cancer patients in Handan Municipal Central Hospital from Jan.2013 to Dec.2013 were detected by immunohistochemistry method,and its correlation with lymphatic metastasis, depth of invasion,degree of differentiation and pathological stage were analyzed.The relationship of p-mTOR with prognosis of patients was assessed according to the expression level of p-mTOR.ResultsThe positive rate of p-mTOR was 77.53%(69/89).The positive rate of p-mTOR in patients with lymphatic metastasis was 90.20%,higher than that of patients without lymphatic metastasis(60.53%),and difference was statistically significant(P＜0.05).The Spearman rank correlation showed that positive expression of p-mTOR had positive correlation with depth of invasion,degree of differentiation and pathological stage(all P＜0.01),with correlation coefficient of 0.65,0.69,and 0.64 respectively.The median progression free survival in group of low p-mTOR expressing was 23.5 months,longer than that of group of high p-mTOR expressing which was 12.8 months,and the difference was statistically significant(P＜0.01).ConclusionThere is high expression of p-mTOR in gastric cancer patients,and the detection of p-mTOR is in favor of assessment of prognosis.

Gastric cancer;p-mTOR;Immunohistochemistry;Prognosis;Correlation

R735.2

A

1003—6350（2017）02—0188—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.02.006

2016-06-08)

王亞明。E-mail：wangjing1133wj@sina.com