兔膝關節(jié)開放性海水浸泡損傷模型的構建

李文，曾國慶，陳愛寶，楊學洪，穆繼宏

(中國人民解放軍第425醫(yī)院骨科，海南 三亞572008)

兔膝關節(jié)開放性海水浸泡損傷模型的構建

李文，曾國慶，陳愛寶，楊學洪，穆繼宏

(中國人民解放軍第425醫(yī)院骨科，海南 三亞572008)

目的 探索并構建理想的兔膝關節(jié)開放性海水浸泡損傷的動物模型。方法 取新西蘭白兔60只，建立兔膝關節(jié)開放性損傷模型，按照不同的海水浸泡時間分為對照組、0.5 h組、1 h組、3 h組和6 h組，每組各12只。對照組不予處理，各實驗組制備膝關節(jié)開放性傷口，分別給予相應的海水浸泡時間。術后觀察實驗動物傷口及存活情況，于術后7 d抽取各組白兔膝關節(jié)液，采用酶聯免疫吸附法檢測關節(jié)液中炎性因子白細胞介素1-β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結果3 h組和6 h組的7 d存活率分別為91.7%、75.0%，其余各組均為100.0%；1 h組、3 h組和6 h組的14 d存活率分別為91.7%、83.3%和58.3%，其余各組均為100.0%。術后7 d，3 h組和6 h組中關節(jié)液IL-1β水平分別為(37.50±6.1)pg/mL和(38.40±5.1)pg/mL，明顯高于其他各組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而3 h組和6 h組中關節(jié)液IL-1β水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；術后7 d，1 h組和3 h組關節(jié)液中的TNF-α水平分別為(297.48±35.7)pg/mL和(312.84±34.0)pg/mL，高于0.5 h組和對照組，低于6 h組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而1 h組和3 h組關節(jié)液中的TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論 海水浸泡3 h構建兔膝關節(jié)海水浸泡損傷的動物模型具有動物存活率高、炎性反應活躍等特點，是一種理想的關節(jié)開放性海水浸泡損傷的動物模型。

膝關節(jié)；海水浸泡；動物模型；兔

隨著人們對海洋的不斷認識和探索，海水浸泡損傷在戰(zhàn)創(chuàng)傷中所占的比例不斷增大。本實驗的目的是建立合理的膝關節(jié)開放性海水浸泡損傷動物模型，了解動物模型的病理機制，提高關節(jié)海水浸泡傷的臨床處理水平。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取普通新西蘭白兔60只，體質量(2.4±0.2)kg，雌雄不限。全部實驗動物隨機分為五組，每組12只。其中4組按膝關節(jié)外傷后海水浸泡時間分為0.5 h組、1 h組、3 h組和6 h組，另1組實驗動物不予如何處理，作為對照組。

1.2 實驗模型的制備 各實驗組白兔按0.l mL/kg給予速眠新肌注麻醉，四肢固定在實驗臺上，單側膝關節(jié)去毛，常規(guī)消毒、鋪單。沿髕旁內側做約2.5cm的橫行切口，逐層切開至關節(jié)囊，直至關節(jié)腔，暴露關節(jié)軟骨面。在自然天氣情況下將各組家兔患膝傷口在海水中分別浸泡0.5h、1h、3h和6h，浸泡結束后用無菌生理鹽水沖洗關節(jié)腔，依次縫合傷口。對照組白兔不予處理。術后全部實驗動物按常規(guī)分籠喂養(yǎng)。

1.3 檢測指標

1.3.1 臨床觀察 大體觀察實驗動物的傷口情況、關節(jié)活動度等，比較各組間術后7 d和14 d的生存率。

1.3.2 關節(jié)液炎性因子指標 于術后第7天按相同方式麻醉、消毒，采用注射器于膝關節(jié)外側間隙向關節(jié)腔內注射1.0mL無菌生理鹽水，待充分混勻后抽取1.0mL關節(jié)液備用。樣本置于離心管中，1 500r/min離心20min，-70℃保存待測。采用ELISA試劑盒檢測各樣本中白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的水平。

2 結果

2.1 術后7 d和14 d各組白兔的生存率比較 全部實驗動物術后第1天均能站立，傷口無明顯滲出，局部皮膚無紅腫。術后第3天，3 h組和6 h組部分實驗動物患膝出現腫脹，局部皮溫高，傷口無明顯滲出。術后第5天，1 h組1例實驗動物患膝出現紅腫，皮溫稍高。術后14 d臨床觀察，存活的實驗動物中，僅6 h組出現1例傷口不愈合，見表1。

表1 術后7 d和14 d各組生存率比較[只(%)]

2.2 術后7 d各組白兔關節(jié)液中IL-1β和TNF-α的水平 術后7 d，各組兔膝關節(jié)液中IL-1β和TNF-α的水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。3 h組和6 h組的IL-1β水平明顯高于0.5 h組和1 h組(P＜0.05)，且0.5 h組和1 h組的IL-1β水平高于對照組(P＜0.05)；此外，6 h組的TNF-α水平明顯高于1 h組和3 h組(P＜0.05)，且1 h組和3 h組的TNF-α水平明顯高于對照組和0.5 h組。這表明長時間的海水浸泡容易引發(fā)更嚴重的炎癥反應，見表2。

表2 術后7 d各組白兔膝關節(jié)液IL-1β和TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

表2 術后7 d各組白兔膝關節(jié)液IL-1β和TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與0.5 h組比較，bP＜0.05；與1 h組比較，cP＜0.05；與3 h組比較，dP＜0.05。

組別對照組0.5 h組1 h組3 h組6 h組F值P值只數12 12 12 11 9 IL-1β 25.49±2.8 30.21±5.8a31.58±4.7a37.50±6.1abc38.40±5.1abc13.694＜0.05 TNF-α 252.00±57.9 254.77±38.1 297.48±35.7ab312.84±34.0ab353.62±32.3abcd13.100＜0.05

3 討論

海水是一種較為復雜的致傷因素，當機體出現開放性損傷，海水浸泡將加重創(chuàng)傷后機體的病理生理改變，從而導致不同的預后及治療方案[1-2]。由于關節(jié)內的組織結構復雜，且軟骨、滑膜等組織自愈能力欠佳，故建立合適的關節(jié)內海水浸泡傷動物模型將有助于了解其病理改變，提供合理的臨床治療方案。

有學者研究證明，高滲液體可刺激單核細胞內炎性介質基因的表達[3]。發(fā)生海水浸泡傷后，與創(chuàng)傷愈合的相關蛋白早期表達減弱以及機體對海水中致病菌的暴露，都可能是影響組織愈合的因素[4-5]。林建寧等[6]觀察了家兔海水浸泡開放性骨折的特點，發(fā)現海水浸泡使傷口的感染率增高，骨折愈合的滿意率下降，骨痂形成不良率增高，骨折愈合過程延遲[7]。筆者假設海水浸泡對膝關節(jié)開放性損傷產生重要的影響，在關節(jié)及全身感染率、關節(jié)內組織不可逆損傷、關節(jié)液中炎性因子的表達等方面發(fā)揮作用，那么通過比較不同海水浸泡時間的差別，可以總結出致死率低、關節(jié)內炎性改變明顯的兔膝關節(jié)海水浸泡傷模型。

本實驗發(fā)現，海水浸泡6 h的動物模型生存率相對較低，傷口周圍炎性反應較其他各組明顯。這可能與關節(jié)內和全身感染相關，全身性炎癥反應致多器官功能障礙。盡管此組動物模型能夠提供足夠嚴重的關節(jié)損傷，但造模過程中實驗動物的損失較多，造模失敗率及經濟損傷過大；相對而言，0.5 h、1 h和3 h組的實驗動物具有更高的存活率。

關節(jié)液中炎性因子的水平可以間接反映關節(jié)內炎癥反應的程度，動物實驗發(fā)現，海水浸泡可以使損傷組織內的炎性因子含量升高并參與組織繼發(fā)損傷，TNF-α、白介素-8(IL-8)、NO的含量在浸泡后3～36 h內明顯較單純損傷高[8]。本研究發(fā)現，術后7 d，1 h、3 h和6 h組的兔膝關節(jié)液中IL-1β和TNF-α的水平均高于對照組，表明海水浸泡損傷是兔膝關節(jié)炎性反應較為敏感的致傷因素。同時，海水浸泡0.5 h和1 h的實驗動物關節(jié)液中IL-1β水平明顯低于3 h和6 h組；海水浸泡1 h和3 h的實驗動物關節(jié)液中TNF-α的水平明顯低于6 h組，說明海水浸泡時間會影響關節(jié)液中炎性因子的水平。從實驗結果看出，1 h、3 h及6 h的海水浸泡時間均能夠造成兔海水浸泡傷模型膝關節(jié)的炎性反應，浸泡時間越長，炎性因子水平升高越明顯。長時間的海水浸泡使關節(jié)組織內的滲透壓改變，合并特殊致病菌感染等因素，發(fā)生一系列病理生理改變，大量炎性因子介入，最終導致關節(jié)內不可逆的組織損傷[9]。

海水浸泡致膝關節(jié)損傷的作用機制十分復雜，本研究的造模過程未能納入關節(jié)損傷和海水浸泡傷的全部致傷因素，如低體溫、復合損傷、關節(jié)內骨折等。這些因素能夠在不同程度上改變損傷的進程，隨著研究的深入，尚需進一步的實驗逐步完善此動物模型。

綜上所述，采用1 h、3 h及6 h海水浸泡兔膝關節(jié)的造模方法可以提高關節(jié)液中的炎性因子水平，但6 h海水浸泡的實驗動物存活率較低，因而1 h和3 h的海水浸泡時間可以滿足兔膝關節(jié)海水浸泡損傷的造模需要，而3 h的浸泡時間更容易引發(fā)造模所需的炎癥反應。該兔膝關節(jié)海水浸泡損傷模型可應用于進一步研究，在損傷分型、病理改變和早期救治等方面發(fā)揮作用。

[1]張雪非,呂榮,陳士明,等.海水浸泡爆炸傷關節(jié)滑膜修復的研究[J].中國骨與關節(jié)損傷雜志,2006,21(12):980-982.

[2]張雪非,劉文華,史惠強,等.肢體關節(jié)爆炸傷并海水浸泡后的創(chuàng)傷反應[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2005,7(8):761-763.

[3]Shapiro L,Dinarello CA.Hyperosmotic stress as stimulant for proinflammatory cytokine production[J].Exp Cell Res,1997,231(2): 354-362.

[4]洪建明,劉敏,胡學峰.海水浸泡感染后皮膚軟組織缺損修復的差異性觀察[J].中國矯形外科雜志,2013,21(15):1569-1571.

[5]寧浩勇,孟宇宏,劉肖,等.創(chuàng)傷合并海水浸泡后愈合過程延遲的因素分析[J].轉化醫(yī)學雜志,2013,2(5):272-276.

[6]林建寧,阮狄克,楊偉志.模擬海水浸泡開放骨折的實驗研究[J].中華航海醫(yī)學與高氣壓醫(yī)學雜志,2006,13(3):140-142.

[7]楊偉志,阮狄克,林建寧.海水浸泡股骨開放性骨折的早期救治[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2005,7(3):250-253.

[8]張炎,劉剛,王育紅,等.腫瘤壞死因子-α、白介素-6、丙二醛、超氧化物歧化酶在大鼠腹腔海水浸泡傷中的表達[J].實用醫(yī)學雜志, 2009,25(22):3764-3766.

[9]劉瑾紅,韓善橋.海戰(zhàn)傷細菌感染特點及抗菌藥物的應用[J].人民軍醫(yī),2014,57(10):1043-1044.

Establishment of a rabbit model of seawater immersion after knee injury.

LI Wen,ZENG Guo-qing,CHEN Ai-bao, YANG Xue-hong,MU Ji-hong.Department of Orthopedics,the 425thHospital of Chinese PLA,Sanya 572008,Hainan, CHINA

ObjectiveTo explore and construct a rabbit model of seawater immersion after knee injury. MethodsSixty rabbits of knee injury were randomly divided into five groups:control group,0.5 h group,1 h group, 3 h group and 6 h group.The control group was subjected to simple knee injury,and other groups received seawater immersion of different duration respectively.The wound and survival was observed.After 7 days,the content of interleukin-1 β(IL-1 β)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in the synovial fluid in each group was measured by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsThe 7-d survival rate was 91.7%in 3 h group,75.0%in 6 h group,and 100.0%in other groups.The 14-d survival rate was 91.7%in 1 h group,83.3%in 3 h group,58.3%in 6 h group,and 100.0%in other groups.Seven days after treatment,the IL-1β levels of synovial fluid in 3 h group and 6 h group showed no statistically significant difference,which were(37.50±6.1)pg/mL and(38.40±5.1)pg/mL,but they were significantly higher than those in other groups.Seven days after treatment,the TNF-α content of synovial fluid in 1 h group and 3 h group,(297.48±35.7)pg/mLand(312.84±34.0)pg/mL respectively,were significantly higher than that in 0.5 h group and control group but lower than that in 6 h group(P＜0.05).ConclusionThe models of seawater immersion for 3 hours after knee injury have higher survival rate and more inflammatory reactions,which are recommended.

Knee;Seawater immersion;Animal model;Rabbits

R-332

A

1003—6350（2017）02—0183—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.02.004

2016-07-07)

海南省三亞市醫(yī)療衛(wèi)生科技創(chuàng)新項目（編號：2014YW47）

穆繼宏。E-mail：mu.jihong@hotmail.com