Dectin-1在熱處理光滑假絲酵母菌刺激大鼠氣道上皮細胞中的作用及對IL-10和TNF-α表達的影響

趙 瑩，駱雪萍，張 雪，宋文洺

(1 桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001； 2 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541001)

·論著·

Dectin-1在熱處理光滑假絲酵母菌刺激大鼠氣道上皮細胞中的作用及對IL-10和TNF-α表達的影響

趙 瑩1，駱雪萍1，張 雪1，宋文洺2

(1 桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001； 2 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541001)

目的 探討樹突狀細胞相關(guān)C型凝集素-1(Dectin-1)在熱處理光滑假絲酵母菌刺激大鼠氣道上皮細胞(RTECs)中的作用及對IL-10和TNF-α表達的影響。方法 將體外培養(yǎng)的RTECs隨機分為3組：對照組(RTECs +無菌生理鹽水)、真菌刺激組(RTECs +熱處理光滑假絲酵母菌)、抑制劑干預(yù)組(RTECs +昆布多糖+熱處理光滑假絲酵母菌)，分別孵育0、2、4、6 h后終止，MTT法檢測細胞存活率，Western Blot法檢測Dectin-1表達，ELISA法檢測IL-10和TNF-α的表達。結(jié)果 熱處理光滑假絲酵母菌破壞細胞結(jié)構(gòu)，降低細胞存活率。在培養(yǎng)開始時(0 h)，3組RTECs細胞存活率以及Dectin-1、IL-10、TNF-α表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。培養(yǎng)2、4、6 h后，真菌刺激組、抑制劑干預(yù)組Dectin-1、IL-10、TNF-α表達水平均高于對照組，抑制劑干預(yù)組Dectin-1、IL-10、TNF-α表達水平均低于真菌刺激組(均P<0.05)。除抑制劑干預(yù)組0 h與2 h IL-10表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義之外，真菌刺激組和抑制劑干預(yù)組組內(nèi)不同時間段Dectin-1、IL-10、TNF-α表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論 Dectin-1是RTECs識別熱處理光滑假絲酵母菌的重要受體，并誘導(dǎo)其釋放IL-10和TNF-α，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

Dectin-1受體；熱處理光滑假絲酵母菌；大鼠氣道上皮細胞；昆布多糖； IL-10；TNF-α

[Chin J Infect Control，2017，16(1)：10-15]

侵襲性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infection，IPFI)是目前重癥監(jiān)護病房重要的感染性疾病之一。近年來，光滑假絲酵母菌檢出率明顯增高，某些地區(qū)或醫(yī)院光滑假絲酵母菌已成為僅次于白假絲酵母菌的第2位或第3位常見病原假絲酵母菌[1-2]。氣道上皮細胞表達的樹突狀細胞相關(guān)C型凝集素-1(Dectin-1)是真菌細胞壁β-葡聚糖的重要識別受體，在機體抵抗真菌感染中發(fā)揮著重要作用。本實驗通過建立體外熱處理光滑假絲酵母菌刺激大鼠氣道上皮細胞(rat tracheal epithelia cells，RTECs)模型，觀察細胞形態(tài)和數(shù)目、細胞存活率、細胞Dectin-1表達和細胞因子IL-10、TNF-α表達，探討Dectin-1受體在光滑假絲酵母菌中的作用，為侵襲性真菌感染的治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料 RTECs購自北京協(xié)和細胞資源中心，光滑假絲酵母菌菌株購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，Dectin-1受體抑制劑昆布多糖、MTT粉、細胞凍存液DMSO(二甲基亞砜)購自Sigma公司，DMEN/F12(1∶1) 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素均購自Gibco公司，兔抗鼠Dectin-1抗體(一抗)、兔抗鼠β-actin抗體(一抗)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體(二抗)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，BCA定量試劑盒、RIPA裂解液購自碧云天公司，IL-10和TNF-α ELISA試劑盒購于eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 RTECs體外培養(yǎng) RTECs按5×105/孔接種于六孔板中，用DMEN/F12(1∶1)培養(yǎng)基(加入10%胎牛血清和10%青鏈霉素)于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)進行培養(yǎng)、傳代等操作。

1.2.2 光滑假絲酵母菌混懸液的制備 將光滑假絲酵母菌接種于沙堡瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h；挑取菌落后用無菌生理鹽水沖洗2遍，在濁度儀上

使用生理鹽水稀釋至菌液濃度為1×107CFU/mL；按照文獻方法進行熱處理[3]：在95℃環(huán)境中進行水浴熱處理30 min，冷卻后妥善貯存、備用。

1.2.3 建立熱處理光滑假絲酵母菌感染RTECs模型 將培養(yǎng)好的RTECs接種于10 cm2的培養(yǎng)皿中，隨機分為3組：對照組為RTECs+無菌生理鹽水；真菌刺激組為RTECs+熱處理光滑假絲酵母菌，調(diào)整濃度使感染復(fù)數(shù)(MOI)=1；抑制劑干預(yù)組為RTECs+昆布多糖+熱處理光滑假絲酵母菌，加入Dectin-1特異性抑制劑昆布多糖，使其終濃度為0.3 mg/mL，預(yù)處理30 min后加入熱處理光滑假絲酵母菌菌液[4]。3組在處理完后放入37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0、2、4、6 h后終止孵育，分別行MTT法、Western Blot方法和ELISA方法檢測。

1.2.4 MTT法檢測RTECs細胞存活率 每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩20 min后，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測每孔吸光度值(A)。

1.2.5 Western Blot方法檢測Dectin-1蛋白表達 分別收集3組細胞，用含磷酸酶抑制劑甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液提取蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。用10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色觀察，應(yīng)用X線膠片曝光，在電腦上使用Image J軟件進行分析并計算各條帶灰度值。

1.2.6 ELISA方法檢測IL-10、TNF-α表達 取3組細胞的上清液樣本各100 μL，嚴格按照IL-10、TNF-α試劑盒說明書步驟操作，檢測樣品中IL-10、TNF-α的表達水平，每個樣品設(shè)2個復(fù)孔，得到的樣品濃度以pg/mL表示。

1.3 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，采用重復(fù)測量資料方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RTECs細胞形態(tài) 光鏡下觀察3組RTECs形態(tài)及數(shù)目，對照組在培養(yǎng)2、4、6 h后細胞形態(tài)均為近梭形，形態(tài)正常，邊緣清晰，未見明顯細胞碎片。真菌刺激組與抑制劑干預(yù)組在培養(yǎng)2、4、6 h后細胞形態(tài)改變，結(jié)構(gòu)變化明顯，細胞呈大片壞死，可見大量細胞碎片懸浮在上清液中，隨孵育時間延長，形態(tài)變化越明顯，細胞碎片越多；同時間點上抑制劑干預(yù)組細胞形態(tài)變異比真菌刺激組明顯，細胞損傷及死亡數(shù)目增多。見圖1。

2.2 MTT實驗結(jié)果 在培養(yǎng)開始時(0 h)，3組RTECs存活率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。培養(yǎng)2、4、6 h后，真菌刺激組、抑制劑干預(yù)組RTECs存活率均低于對照組(均P<0.05)；抑制劑干預(yù)組RTECs存活率均低于真菌刺激組(均P<0.05)。真菌刺激組、抑制劑干預(yù)組組內(nèi)不同時間點RTECs存活率分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

2.3 Western Blot方法檢測細胞Dectin-1蛋白表達 在培養(yǎng)開始時(0 h)，3組RTECs Dectin-1蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。培養(yǎng)2、4、6 h后，真菌刺激組、抑制劑干預(yù)組RTECs Dectin-1表達量均高于對照組(均P<0.05)；抑制劑干預(yù)組RTECs Dectin-1表達量均低于真菌刺激組(均P<0.05)。真菌刺激組和抑制劑干預(yù)組組內(nèi)不同時間點RTECs Dectin-1表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。詳見圖2、表2。

A1—3：對照組細胞培養(yǎng)2、4、6 h；B1—3：真菌刺激組細胞培養(yǎng)2、4、6 h；C1—3：抑制劑干預(yù)組細胞培養(yǎng)2、4、6 h

組別0h2h4h6h真菌刺激組(n=6)102.68±3.8991.04±3.04*▲81.77±2.44*▲75.87±2.21*▲抑制劑干預(yù)組(n=6)99.90±3.4584.83±2.07*△▲73.78±1.08*△▲63.28±1.94*△▲對照組(n=6)100.00±1.49103.26±2.87107.18±4.33109.35±4.54

*：與對照組同時間點比較P<0.01；△：真菌刺激組同時間點比較P<0.01；▲：與同組前一時間點比較P<0.01

2.4 ELISA法檢測IL-10、TNF-α的表達 在培養(yǎng)開始時(0 h)，3組RTECs IL-10、TNF-α表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。培養(yǎng)2、4、6 h后，真菌刺激組、抑制劑干預(yù)組RTECs IL-10、TNF-α表達量均高于對照組(均P<0.05)；抑制劑干預(yù)組RTECs IL-10、TNF-α表達量均低于真菌刺激組(均P<0.05)。真菌刺激組組內(nèi)不同時間點細胞IL-10、TNF-α表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。抑制劑干預(yù)組組內(nèi)不同時間點細胞IL-10(2 h與4 h、4 h與6 h)、TNF-α(0 h與2 h、2 h與4 h、4 h與6 h)表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

圖2 不同時間點3組RTECs Dectin-1蛋白的表達情況

Figure 2 Expression of RTECs Dectin-1 protein of three groups at different time points

表2 不同時間點3組RTECs Dectin-1蛋白的相對表達量

*：與對照組同時間點比較P<0.01；△：與真菌刺激組同時間點比較P<0.01；▲：與同組前一時間點比較P<0.05

表3 不同時間點3組RTECs IL-10、TNF-α分泌情況

*：與對照組同時間點比較P<0.01；△：與真菌刺激組同時間點比較P<0.01；▲：與同組前一時間點比較P<0.05

3 討論

光滑假絲酵母菌是嚴重危害患者生命安全的重要機會致病菌，尤其對重癥監(jiān)護病房的患者更為明顯。侵襲性肺部真菌感染中，氣道上皮細胞首先接觸病原真菌，成為機體抵御外界刺激的第一道屏障。研究[5]表明，上皮細胞具有重要的免疫防御功能，其模式識別受體可以在受到外界刺激或損傷時分泌不同的宿主防御蛋白。Dectin-1是一種可以識別真菌的重要模式識別受體，在真菌炎癥反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用；Dectin-1與真菌細胞壁的β-1,3葡聚糖結(jié)合后形成“吞噬突出”激活，經(jīng)免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)募集激活酪氨酸激酶(SyK)，誘導(dǎo)生成 CARD9-Bcl10-Malt1 (CBM)復(fù)合物激活下游信號通路，調(diào)節(jié)多種細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[6-7]，在真菌的識別和天然免疫反應(yīng)中起重要作用。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，氣道上皮細胞能在光滑假絲酵母菌感染后上調(diào)Dectin-1的表達。本實驗用RTECs成功建立體外光滑假絲酵母菌感染模型，光鏡下可見真菌刺激組和抑制劑干預(yù)組細胞成片壞死、變形、破碎；MTT實驗顯示，光滑假絲酵母菌菌液對細胞生長具有明顯的抑制作用。RTECs在與熱處理光滑假絲酵母菌共培養(yǎng)后可表現(xiàn)出Dectin-1表達水平的上調(diào)。

昆布多糖是一種萃取于掌狀海帶的1,3-β-葡聚糖，可以特異性結(jié)合Dectin-1，是Dectin-1的特異性阻斷劑[10]。在小鼠白假絲酵母菌感染模型中，Dectin-1基因敲除小鼠對白假絲酵母菌的抵抗能力下降[11]；Elcombe等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Dectin-1與IL-10等細胞因子的表達有關(guān)。本實驗中，熱處理光滑假絲酵母菌誘導(dǎo)細胞IL-10和TNF-α的高表達，相比真菌刺激組，抑制劑干預(yù)組IL-10和TNF-α的表達水平明顯降低，提示Dectin-1可參與光滑假絲酵母菌的識別并誘導(dǎo)細胞因子IL-10和TNF-α的產(chǎn)生，實驗結(jié)果與林莉等[13]研究結(jié)果一致。與單純熱處理光滑假絲酵母菌刺激的RTECs相比，昆布多糖刺激后，不僅表現(xiàn)為Dectin-1的表達顯著下降，IL-10、TNF-α的表達也呈同樣的變化趨勢，與Sun等[9]的結(jié)果相似。抑制劑干預(yù)組細胞因子表達雖然比真菌刺激組低，但仍高于正常對照組，提示在光滑假絲酵母菌引起的真菌感染中，還有其他的模式識別受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與抗真菌感染的免疫反應(yīng)。

病原真菌侵入機體后啟動固有免疫系統(tǒng)，炎性細胞浸潤，其中輔助性T(T helpers, Th)細胞起重要作用。TNF-α是Th1型細胞因子，可以增強免疫細胞對假絲酵母菌的抵抗作用，對機體起保護作用；IL-10是Th2型細胞因子，具有抗炎和免疫抑制作用，被稱為細胞因子合成阻抑因子。機體正常情況下可少量表達IL-10、TNF-α等細胞因子，在病原菌入侵激活病原模式識別受體啟動炎癥反應(yīng)時，上述細胞因子的表達出現(xiàn)變化。Dectin-1的缺乏可以抑制保護性免疫的發(fā)展，減少Th1、Th2和Th17型細胞因子的產(chǎn)生，減少活化的CD4+和CD8+遷移至感染部位，導(dǎo)致更加嚴重的組織病理學(xué)變化和病死率[14]。本實驗中，熱處理光滑假絲酵母菌刺激RTECs可以誘導(dǎo)IL-10和TNF-α的表達，昆布多糖可以部分抑制這種作用。隨著孵育時間的延長，細胞存活率減低，細胞產(chǎn)生IL-10和TNF-α的水平進行性增高，提示上述細胞因子可能在熱處理光滑假絲酵母菌刺激RTECs中起負性調(diào)節(jié)作用，與本課題組前期動物實驗結(jié)果[15]一致。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)熱處理的光滑假絲酵母菌可以刺激體外培養(yǎng)的RTECs Dectin-1表達上調(diào)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10和TNF-α，這些細胞因子可能趨化炎性細胞因子至感染部位，介導(dǎo)抗真菌免疫反應(yīng)。抑制劑干預(yù)組阻斷Dectin-1受體后可抑制其介導(dǎo)產(chǎn)生的細胞因子表達水平，提示可以將Dectin-1作為調(diào)節(jié)靶點，調(diào)控其表達來控制炎癥反應(yīng)強度，以減少對機體的損傷，控制炎癥范圍，更好地治療侵襲性真菌感染。本實驗為體外細胞試驗，可直接表現(xiàn)出RTECs對真菌感染的反應(yīng)，由于動物機體內(nèi)部自環(huán)境的復(fù)雜、個體的差異性等原因，細胞試驗并不能完全說明機體內(nèi)真正的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和炎癥調(diào)節(jié)機制，但可能為今后以Dectin-1為靶點的侵襲性真菌感染的治療和相關(guān)藥物的研發(fā)提供新思路和實驗室依據(jù)。

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(本文編輯：劉思娣)

Role of Dectin-1 in the production of IL-10 and TNF-α by rat tracheal epithelial cells stimulated with heat-treatedCandidaglabrata

ZHAOYing1,LUOXue-ping1,ZHANGXue1,SONGWen-ming2

(1TheSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China; 2GuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China)

Objective To investigate the effect of Dectin-1 on the release of inflammatory factors interleukin-10(IL-10) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in rat tracheal epithelial cells (RTECs) stimulated with heat-treatedCandidaglabrata(C.glabrata).Methods RTECs cultivated in vitro were randomly divided into three groups, including control group(RTECs +sterile normal saline), fungal stimulation group(RTECs + heat-treatedC.glabrata), and inhibitor intervention group(RTECs + laminarin + heat-treatedC.glabrata), cells were harvested after incubation for 0, 2, 4, 6 hours respectively, cell survival rate was determined by MTT method, expression of Dectin-1 was analyzed by Western Blot, expression of IL-10 and TNF-α were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results Heat-treatedC.glabratadestroyed cell structure and reduced cell survival rate. At the beginning of the culture (0 h), cell survival rate, expressions of Dectin-1, IL-10 and TNF-α among three groups were all not significantly different(allP>0.05). After incubation for 2, 4, 6 hours, expressions of Dectin-1, IL-10 and TNF-α in fungal stimulation group and inhibitor intervention group were both significantly higher than control group; expressions of Dectin-1, IL-10,and TNF-α in inhibitor intervention group was lower than fungal stimulation group(allP<0.05). The expressions of IL-10 in inhibitor intervention group at 0 h and 2 h was not significantly different, expressions of Dectin-1, IL-10, and TNF-α in fungal stimulation group and inhibitor intervention group at different incubation periods were significantly different(allP<0.05).Conclusion Dectin-1 is an important receptor for RTECs to recognize the heat-treatedC.glabrata, it induces the release of IL-10 and TNF-α, and mediate the occurrence of inflammation.

Dectin-1 receptor; heat-treatedCandidaglabrata; rat tracheal epithelial cell; laminarin; IL-10; TNF-α

2016-07-12

廣西自然科學(xué)基金資助項目(2013GXNSFAA019209);廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點科研課題(重2012007)

趙瑩(1991-)，女(回族)，河南省郟縣人，碩士研究生，主要從事重癥感染研究。

駱雪萍 E-mail：xueping-l@sohu.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.01.003

R519.3

A

1671-9638(2017)01-0010-06