納豆激酶生產(chǎn)菌的紫外誘變選育

薛健　王歡

摘 要：本研究采用紫外線誘變育種的方法，篩選并選育納豆激酶高產(chǎn)菌株。試驗結果表明，使用20W紫外燈照射90s，經(jīng)過篩選及纖維蛋白平板檢測，獲得了一株產(chǎn)酶活為498.84U/mL的高產(chǎn)菌株，產(chǎn)酶活力較出發(fā)菌株提高了6.78%。

關鍵詞：納豆激酶；物理誘變；紫外線

中圖分類號：S33 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131002

納豆是一種日本傳統(tǒng)食品，具有助消化、預防心血管疾病、延緩衰老等功效。1987年日本學者須見洋行首次對納豆及其提取物作了系統(tǒng)研究[1]。納豆激酶是在納豆發(fā)酵過程由納豆生產(chǎn)菌產(chǎn)生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶[2]，具有很強的溶解纖維蛋白和血漿酶底物活性，它不但能作用于纖維蛋白，而且還能激活動物體內纖溶酶原，從而增加內源性纖溶酶的量與功能，表現(xiàn)出較強的溶血栓作用，可用于治療和預防血栓病 [3]。獲得納豆激酶的主要途徑是利用可以代謝產(chǎn)生納豆激酶的菌株發(fā)酵獲得，因而用于納豆激酶生產(chǎn)菌的產(chǎn)酶性能就顯得至關重要[4]。

納豆激酶生產(chǎn)菌屬細菌科，芽孢桿菌屬，是枯草芽孢桿菌的一個亞種[5]，常用的提高納豆激酶產(chǎn)量的途徑主要有3種：對野生菌種的誘變選育；優(yōu)化納豆激酶生產(chǎn)菌的發(fā)酵條件；通過基因工程技術改造納豆激酶的相關基因[6]。本研究通過對納豆激酶生產(chǎn)菌菌株進行紫外線誘變處理，選育溶栓活力較高的納豆激酶生產(chǎn)菌，為今后的納豆激酶擴大化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

納豆激酶生產(chǎn)菌（吉林農業(yè)科技學院生物工程學院實驗室保藏）。

1.2 試劑

瓊脂糖購自Spanish公司，纖維蛋白原，凝血酶及尿激酶購自Sigma公司，其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

肉湯液體培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，pH 7.0～7.2，0.1Mpa滅菌20min。

加倍肉湯液體培養(yǎng)基：牛肉膏1%，蛋白胨2%，氯化鈉1%，pH 7.0～7.2，0.1Mpa滅菌20min。

纖維蛋白平板：纖維蛋白原20mg溶解于10mL PBS緩沖液中，50℃水浴待用。取凝血酶50μL（濃度為200μL/mL）的加入到10mL含2%瓊脂糖的PBS緩沖液中50℃水浴待用。將纖維蛋白原和含有凝血酶的溶液迅速混勻，倒入直徑6cm的平板內，放入4℃冰箱備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 紫外線物理誘變

挑取納豆激酶生產(chǎn)菌1環(huán)于盛有5mL肉湯的三角瓶中，置30℃過夜。

次日添加5mL新鮮的肉湯培養(yǎng)液，充分混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)5h，分裝于2瓶三角瓶中。

任取1支5mL培養(yǎng)好的菌液倒入離心管中，1350轉/分離心10min。

棄去上清液，打勻沉淀，加入生理鹽水，稀釋為細胞濃度為108個/mL的菌懸液。

20W紫外燈預熱30min后，取制備好的菌懸液3mL移入無菌培養(yǎng)皿內（含一無菌轉子），置于紫外燈下30cm處的磁力攪拌器上，開啟培養(yǎng)皿蓋后，在攪拌的條件下，紫外線照射分別為30s，60s，90s，120s和150s。

紫外線處理后的平皿中加入3mL加倍肉湯培養(yǎng)液，即用無菌遮光布包裹后放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內，避光培養(yǎng)24h。

計算致死率與正突變率，并使用纖維蛋白平板測定酶活力，并以相同的操作取未經(jīng)誘變處理的菌液作為對照，選取產(chǎn)酶活最高的菌液轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進一步搖瓶復篩，篩選出產(chǎn)酶較高的突變菌株。

1.4.2 致死率與正突變率的計算

紫外線物理誘變后菌株的致死率與正突變率計算公式[7]如下：

致死率（%）=[（未誘變平板菌落數(shù)-誘變后平板菌落數(shù)）/未誘變平板菌落數(shù)]×100

正突變率（%）=（酶活增加的菌株數(shù)/總菌株數(shù)）×100（正變株指酶活高于出發(fā)株的變異株）

1.4.3 納豆激酶酶活性檢測方法

在纖維蛋白平板上打直徑2mm的圓孔，吸取發(fā)酵液上清3μL點樣，靜置10min后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18h，測定透明圈的垂直直徑。根據(jù)尿激酶纖維蛋白溶解酶標準曲線，計算纖維蛋白溶解酶的酶活[8，9]。

2 結果與討論

2.1 紫外線誘變條件的確定

紫外線廣泛地被用作微生物誘變劑，它可使DNA分子形成嘧啶二聚體，阻礙堿基正常配對，并可能引起突變或死亡[10]。為研究紫外線照射時間對誘變效果的影響，本研究使用的紫外燈功率為20W，照射距離為30cm，照射時間分別為30s，60s，90s，120s和150s，紫外誘變時間與正突變率與致死率關系的曲線見圖1和圖2。結果表明起初正突變率隨著紫外誘變時間的增加而升高。當紫外線照射時間為90s時，正突變率為2.12%，此后，正突變率隨誘變時間增加而下降。隨著紫外線照射時間的延長，菌體細胞內的DNA分子所形成的嘧啶二聚體持續(xù)增加，從而影響菌體細胞分裂與增殖，導致致死率逐漸增加，當照射時間為90S時，致死率為79%。

2.2 紫外線誘變結果

通過對納豆激酶生產(chǎn)菌株進行紫外線誘變共篩選出3株產(chǎn)納豆激酶活力較高的突變株。紫外線誘變結果見表1。其中菌株2的納豆激酶活力最高，為498.84U/mL，菌株1和菌株3的產(chǎn)納豆激酶活力分別為495.36U/mL和486.23U/mL，均低于菌株2，而作為對照的納豆激酶生產(chǎn)菌出發(fā)菌株產(chǎn)酶活力為467.18U/mL。因此，本研究中經(jīng)紫外線物理誘變得到產(chǎn)納豆激酶活力最高的正突變菌株為菌株2，其納豆激酶活力比原始菌株提高了6.78%。

本試驗研究了納豆激酶生產(chǎn)菌紫外線物理誘變的條件。確定了紫外線誘變條件為20W紫外燈照射距離30cm，照射時間90s，正突變率為2.12%，致死率79%，獲得了一株產(chǎn)酶活力為498.84U/mL正突變株，比原始菌株提高了6.78%。在本研究的基礎上，可以進一步進行復合誘變，并優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，用于之后的納豆激酶擴大生產(chǎn)。

參考文獻

[1]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al. A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese Natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet [J].Experientia，1987，43（20）：1110-1111.

[2]楊艷燕，李順意，高尚，等.豆豉中納豆桿菌的篩選和納豆激酶的初步分離[J].沈陽藥科大學學報，2001，18（6）：436-438.

[3]劉柳，彭喜春.納豆激酶與豆豉纖溶酶酶學性質比較研究[J].中國釀造，2010，29（8）：88-90.

[4]夏麗，沙維，張麗萍.紫外線誘變選育高產(chǎn)納豆激酶菌株的研究[J].農產(chǎn)品加工（創(chuàng)新版），2010，206（4）：9-34.

[5]刁建中，陳桂光，馬波，等.納豆激酶的最新研究進展[J].輕工科技，2012（3）：7-8.

[6]陳志文，徐爾尼，肖美燕.納豆激酶的研究進展[J].山西食品工業(yè)，2002（1）：26-35.

[7]趙斌，何紹江.微生物學實驗[M].北京：科學出版社，2002：187-191.

[8]江曉，董明盛.一種食源性纖溶酶（納豆激酶）酶學性質研究[J].中國釀造，2002（1）：23-25.

[9]謝秋玲，郭勇.納豆激酶活性測定方法[J].廣東藥學，2000，10（6）：8-10.

[10]李榮杰.微生物誘變育種方法研究進展[J].河北農業(yè)科學，2009，13（10）：73-78.

作者簡介：薛?。?979-），男，講師，研究方向：代謝工程與發(fā)酵過程優(yōu)化。