原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠模型的研究進展

張冀豫， 范興良

(上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院， 上海 200071)

原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠模型的研究進展

張冀豫， 范興良

(上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院， 上海 200071)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以小葉間膽管破壞，炎性因子浸潤為主要特征的自身免疫性疾病。PBC以抗線粒體抗體升高為主要特點，最終導致肝內膽管膽汁淤積、肝纖維化甚至肝硬化。該病目前發(fā)病機制尚未完全清楚，也無理想的治療方案。因此，有必要尋找一種與PBC相匹配的動物模型對PBC的發(fā)病、治療、轉歸進行研究。簡述膽管結扎模型、藥物模型、抗原模型、基因自發(fā)模型等方面的進展，旨在總結歸納近年來發(fā)表的PBC小鼠模型的特點與局限，為PBC模型的選擇和研究提供依據。

原發(fā)性膽汁性膽管炎； 疾病模型, 動物； 綜述

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以小葉間膽管破壞，炎性因子浸潤為主要特征的自身免疫性肝病，以中年女性多發(fā)。目前，PBC發(fā)病原因尚未明確，可能由環(huán)境、細菌感染、基因等諸多因素引起[1-3]。PBC的病理表現為肝匯管區(qū)淋巴細胞浸潤，CD8+T淋巴細胞侵犯膽小管上皮細胞，造成肝內膽汁淤積及肝硬化[4]；臨床以出現抗線粒體抗體(AMA)、ALP及IgM升高為特征性表現。近年來，PBC治療不斷完善[5]，PBC動物模型的研究不斷深入，現對國內外近年來PBC實驗小鼠模型研究進展進行綜述，為研究PBC提供選擇和依據。

1 膽管結扎模型

膽管結扎(bile duct ligation, BDL)模型是通過結扎小鼠膽總管，造成膽總管阻塞，毛細膽管進行性擴張，肝細胞浸潤，進而引起局部炎癥，最終引起肝硬化。該方法于胸骨下切口，玻璃分針剝離膽管脂肪，5-0結扎線進行膽管結扎。Duwaerts等[6]將C57BL/6雌性小鼠膽總管結扎，3 d后發(fā)現小鼠體內LY6C單核細胞和CD11b增加，小鼠肝臟病理切片出現Kupffer細胞和單核巨噬炎細胞(IMNPs)浸潤，提示炎癥浸潤是BDL的主要特征。Aller等[7]闡釋了BDL模型炎癥浸潤的機制，BDL模型的肝損傷是基于膽汁淤積而出現局部炎癥、細胞膜轉運異常、細胞代謝紊亂等一系列問題。盡管該模型手術方法成熟，成模率高，實驗成本低，可造成膽總管阻塞，肝內膽汁淤積，但并未涉及引起PBC相關的特異性抗體AMA等因子升高，因此，該模型多用于膽汁淤積性疾病的研究。

2 藥物模型

Wakabayashi等[8]腹腔注射小牛血清蛋白(BSA)和2-辛炔酸(2-octynoic acid)共軛體(100 μg/25 μl)免疫C57BL/6雌性小鼠，并通過相同方法注射包含結核分枝桿菌H37Ra(10 mg/ml)完全佐氏制劑24周后，發(fā)現100%小鼠出現膽管炎，炎性因子浸潤，腫瘤壞死因子(TNF)α等指標上升，特異性CD8+T淋巴細胞表達CD44升高。但該模型僅能表現PBC的病理特點，由于缺少AMA，使得該模型在PBC免疫學表現上存在缺陷。Fickert等[9]采用0.1% DDC (diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine)飲食喂養(yǎng)2個月齡雄性瑞士白化病小鼠8周，喂養(yǎng)4周后小鼠出現膽管阻塞以及谷胱甘肽排泄減少，伴有肝纖維化和大膽管損傷。8周實驗后，小鼠膽道卟啉和血管細胞黏附分子增加，同時DDC誘導了骨橋蛋白和TNFα表達。此模型病理表現與PBC類似，表現為小鼠膽管和膽管周圍損傷。該模型可觀察外源性因素誘導慢性膽道疾病的機制和膽管纖維化，成本較低，但DDC藥物模型中缺少特異性AMA指標。

聚肌胞苷酸(polyI:C)可有效誘導Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)，并影響自身免疫。Okada等[10]在雌性C57BL/6小鼠體內1周2次腹腔注射polyI:C(5 mg/kg)，第8周小鼠匯管區(qū)出現單核細胞浸入，并且小鼠體內出現大量的免疫球蛋白聚集以及淋巴活化細胞，16周后所有實驗小鼠血清中均可檢測到AMA。郭曉霞等[11]重復該實驗，發(fā)現在第24周AMA-M2陽性率達100%，同時肝臟匯管區(qū)出現碎屑樣壞死和纖維化，并有大量炎性細胞浸潤。為了研究polyI:C模型的蛋白組學，Song等[12]將注入poly I:C的控制組與對照組小鼠對比，發(fā)現polyI:C可以使小鼠肝線粒體表達的9個蛋白表達下調，20個蛋白上調。表明polyI:C小鼠模型可以使線粒體蛋白質組差異表達，差異表達的蛋白參與了脂質代謝，類固醇激素和膽汁酸的合成。有學者在polyI:C腹腔注射時聯合藥物協同，以尋找更完美的PBC匹配。Ambrosini等[13]在實驗中將小牛血清蛋白和2-辛炔酸(2OA-BSA)與polyI:C聯合作用小鼠，發(fā)現除AMA 100%陽性外，CD8+T淋巴細胞和肝纖維化出現了大幅升高，表明類似Toll樣受體的poly I:C聯合2-辛炔酸可更好的模擬人PBC的病程變化，與單純2-辛炔酸藥物模型相比，聯合作用會增加發(fā)生肝纖維化的概率。該模型方法簡單、可重復性高，很好的模擬人PBC生化、免疫和病理表現，深受研究者青睞。

3 抗原模型

新鞘脂菌是一種革蘭氏陰性菌，具有與PBC患者丙酮酸脫氫酶復合體E2(PDC-E2)抗原表達相同的鞘糖脂CD1，可被限制性自然殺傷細胞(NK T淋巴細胞)識別[14]。Mattner等[15]發(fā)現將新鞘脂菌5×107cfu腹腔注射感染C57BL/6、 NOD、以及 SJL品系小鼠，2周后所有品種的小鼠出現體內PDC-E2及AMA的聚集，并有T淋巴細胞聚集浸潤肝內小膽管的現象，AMA抗體可出現80%陽性，這與人PBC的疾病特征類似。但該細菌抗原模型并不會出現肝纖維化的表現[16]。除新鞘脂菌外，Wang等[17]將PBS與大腸桿菌緩沖液靜脈注射非肥胖型糖尿病(NOD)AMA小鼠，結果小鼠出現了AMA陽性以及膽管炎癥，4周后實驗組小鼠AMA濃度約為對照組5倍。這可能由于大腸桿菌中的肽序列與PDC-E2 中6～8個氨基酸的序列相同，因而產生AMA等因子[18]。也有報道[19]認為尿路感染是PBC的誘因，大腸桿菌刺激導致尿路感染導致PBC發(fā)病。但此類模型通過大腸桿菌刺激會使PBC小鼠造模時合并小鼠尿路感染，降低制備模型的特異性。

將純化的AMA-M2和完全弗氏佐劑(1 mg/ml)腹腔注射C57BL/6小鼠，也有AMA出現，聯合試劑在免疫后第66周小鼠體內出現AMA-M2抗體(100%)，但該模型的制備時間較長。并且該模型腹腔注射小鼠主要引起肝內小膽管損傷，ALT、TBil無顯著變化，與早期PBC發(fā)病相似[20]。

4 基因自發(fā)模型

DnTGFβ轉基因小鼠是PBC模型中應用較為廣泛的一種。將轉化生長因子(TGF)加入CD4的啟動子下，構成了DnTGF-βRⅡ模型小鼠。該模型小鼠會限制T淋巴細胞的表達，100%會產生AMA，以及PDC-E2、BCOADC-E2、OGDC-E2等自身抗體，同時由于TGF的作用會引起肝纖維化[21]。該模型的匯管區(qū)炎癥類似人PBC淋巴細胞浸潤。在轉基因小鼠特異性損傷TGFβ信號中，只在T淋巴細胞識別抗原，出現自身免疫性膽道疾病，因此可認為此模型是對人PBC的模擬[22]。Bernuzzi等[23]通過實驗發(fā)現在不同T淋巴細胞亞群中，PBC患者的亞群CD8 T淋巴細胞是大多數肝纖維化發(fā)病的致病因素。有學者[24]將CD4與CD8 T淋巴細胞分別轉輸到免疫缺陷小鼠體內，發(fā)現在CD8 T淋巴細胞作用下，小鼠體內出現了更高水平的TNFα、INFγ等炎性因子。此模型可以通過CD8 T淋巴細胞的作用造成類似PBC的病理特征。但值得注意的是，DnTGFβ小鼠在AMA表達和淋巴細胞浸潤的同時會對小膽管產生損傷，并伴有結腸炎的發(fā)生[25]。

C3c4轉基因鼠是另一種PBC模型鼠，由非肥胖糖尿病小鼠(一種自發(fā)的T淋巴細胞攻擊胰島β細胞自身免疫性Ⅰ型糖尿病模型鼠)發(fā)展而來，該模型是由于3,4染色體的B6/B10胰島素依賴性糖尿病(IDD)位點異常，并自發(fā)出現自身免疫性膽管疾病，淋巴細胞浸潤，抗核抗體(ANA)陽性，最終導致膽道梗阻[26]。該模型AMA在第9周到第10周可以達到56%。并且最終約30%的小鼠會出現肝纖維化，以及膽管持續(xù)淤積造成模型失敗。超過8個月齡的雌性小鼠體內有更高水平的IgM dsDNA、 IgG dsDNA和IgG ssDNA，顯示該模型雌性較雄性免疫表達更符合PBC的特征[27-28]。除相應的PBC炎癥因子釋放外(CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞和PDC-E2抗體)，通過組織學分析顯示，肝切片出現破壞性膽管炎、肉芽腫形成和嗜酸性粒細胞浸潤。并且隨著時間推移該模型小鼠肉芽腫的比例增加，而腸內炎癥和肝纖維化的比例不高[27,29]。

IL-2Rα-/-小鼠存在自發(fā)性的淋巴細胞浸潤和膽管損傷。Yao等[30]發(fā)現IL-2受體α缺失會出現類似PBC的自身免疫肝病。IL-2Rα/CD25 (IL-2Rα-/-)缺陷小鼠，與同窩野生型小鼠相比，該小鼠除會出現PBC特異性抗體AMA外，IFNγ、TNFα、IL-2、IL-12p40比例升高，同時表現CD4、CD8+T淋巴細胞浸潤。IL-2Rα-/-小鼠模型AMA 100%表達，約有80%會出現ANA。同時該模型會對小膽管、大膽管產生損傷。但此模型未見肝臟纖維化，而且會使結腸炎的發(fā)生風險增高。研究發(fā)現該模型小鼠伴有腸道炎癥、肉芽腫、嗜酸性粒細胞浸潤的發(fā)生，并且具有年壽短的特點[31-32]。

AE2基因缺陷小鼠是一種膽道上皮陰離子交換通道的缺陷小鼠。在肝內膽管上皮的研究中，Chen等[33]發(fā)現膽管上皮細胞可以表達多種抗原識別受體，激活免疫通路。膽管上皮中Cl-/ HCO3-陰離子交換劑(AE)2參與體內PH跨膜調節(jié)和膽汁運輸。在PBC患者的肝活組織檢查標本以及血液中發(fā)現AE2基因表達的減少，并且AE2基因缺陷小鼠模型的膽管細胞出現了氧化應激和抗原呈遞，而同時AE2a,b-/-缺陷小鼠發(fā)現其組織相容性復合物Ⅰ升高，這也促進了小鼠PBC的發(fā)生[34]，表明陰離子交換通道的缺陷對小鼠膽管的上皮細胞會產生影響。通過AE2a,b-/-缺陷小鼠的制備發(fā)現除了AMA升高外(40%～80%)，IL-12P79和CD8+、INFγ均會升高。在組織學上，30%的小鼠顯示在匯管區(qū)及周圍的膽管周圍有CD4+和CD8+T淋巴細胞浸潤，膽管梗阻周圍有輕微的纖維化。該模型中約有1/3的小鼠會出現周圍膽管損傷和炎性浸潤，合并結腸炎、肝纖維化，同樣該模型會出現遲發(fā)以及難以繁衍的問題。

相比較其他小鼠模型基因自發(fā)模型在實驗環(huán)境，實驗成本上要求較高。目前國內的PBC小鼠多以藥物模型和抗原模型為主。盡管基因自發(fā)模型的內源性匹配度高，但多數轉基因小鼠存在并發(fā)癥以及難以繁衍的問題。

5 結論

盡管目前PBC的發(fā)病機理并不是非常清楚，但可以肯定的是PDC-E2升高等因素會引起AMA升高，并出現肝內小膽管損傷及肝纖維化。PBC動物模型和人類在組織學和免疫學有很多的相似性。但是動物模型本身具有限制性，在諸多的模型中不可避免會出現PBC以外的并發(fā)癥，諸如肝內肉芽腫、結腸炎，這與嚴格界定的PBC疾病有一定的差距。有研究從基因遺傳闡釋PBC的發(fā)病，發(fā)現PBC疾病與X染色體異常去甲基CXCR3啟動子相關[35]。這也闡明了由于XY染色體的差異，臨床中PBC女性發(fā)病高于男性。而現有的模型還不能完全達到制備的雌性小鼠AMA陽性率高于雄性小鼠，也不足以從免疫細胞本身活動對于PBC的影響解釋PBC的發(fā)病機理。不同的模型各有優(yōu)劣，因此對于PBC模型還有待進一步研究，尋找更合適的匹配模型。

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引證本文：ZHANG JY, FAN XL. Research advances in the mouse model of primary biliary cholangitis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(11): 2235-2238. (in Chinese)

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(本文編輯：邢翔宇)

Researchadvancesinthemousemodelofprimarybiliarycholangitis

ZHANGJiyu,FANXingliang.

(ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200071,China)

Primary biliary cholangitis (PBC) is an autoimmune disease characterized by the destruction of interlobular bile ducts and infiltration of inflammatory factors. An increase in anti-mitochondrial antibody is the major feature of PBC and may eventually lead to intrahepatic cholestasis, liver fibrosis, and even liver cirrhosis. The pathogenesis of this disease remains unclear, and there is no ideal treatment regimen. Therefore, it is necessary to find an animal model matching with PBC, in order to study the pathogenesis, treatment, and prognosis of PBC. This article introduces the research advances in bile duct ligation models, drug models, antigen models, gene models, and spontaneous models, in order to summarize the features and limitations of the mouse model of PBC in the articles published in recent years and provide a basis for the selection and research of PBC models.

primary biliary cholangitis； disease models, animal； review

R575.22

A

1001-5256(2017)11-2235-04

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.11.041

2017-08-22；

2017-10-10。

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會中醫(yī)藥科研專項課題(2016LP032)

張冀豫(1994-)，男，主要從事中西醫(yī)結合治療慢性肝病方面的研究。

范興良，電子信箱：1212fxl@163.com。