• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雙峰駝凝乳酶原基因的生物信息學(xué)分析

    2014-11-14 07:10:34張富春
    生物信息學(xué) 2014年1期
    關(guān)鍵詞:雙峰駝凝乳酶結(jié)構(gòu)域

    楊 藝,普 燕,張富春

    (新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆,烏魯木齊,830046)

    隨著乳品行業(yè)的高速發(fā)展,人們對(duì)發(fā)酵乳制品的需求也日益增加。近年來國內(nèi)外干酪市場發(fā)展迅猛,不僅對(duì)干酪的研究日益深入,而且制作干酪所用的凝乳酶需求量大增。干酪加工中添加凝乳酶的主要目的是促使牛乳凝結(jié),為排除乳清提供條件[1]。凝乳酶是一種從未斷奶的小牛皺胃中發(fā)現(xiàn)的天門冬氨酸蛋白酶,可以專一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵,破壞乳中的酪蛋白膠束引起蛋白質(zhì)凝聚,因此在乳制品尤其是在干酪加工制作中應(yīng)用廣泛[2],理想的凝乳酶應(yīng)能迅速、專一地打開κ-酪蛋白Phe105-Met106鍵,但水解蛋白其他肽鍵的能力較低,即兩者的活力比值要高[3]。凝乳酶凝乳后制成的干酪相當(dāng)于將原料奶中的蛋白質(zhì)和脂肪濃縮了十倍左右,另外干酪中還含有糖類、有機(jī)酸、常量礦物質(zhì)元素等多種成分,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。凝乳酶主要為動(dòng)物來源的凝乳酶,約占市場的70%,同時(shí)還有植物來源的凝乳酶、微生物來源的凝乳酶和利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組凝乳酶。牛凝乳酶有著強(qiáng)大的凝乳活性和較低的蛋白水解活性,是凝乳制作干酪的優(yōu)質(zhì)酶,目前對(duì)牛凝乳酶的研究已經(jīng)較為成熟,市場上銷售的凝乳酶主要是牛凝乳酶,而相應(yīng)駱駝凝乳酶研究較少,因此駱駝凝乳酶開發(fā)利用前景廣闊。Kappeler等[4]研究發(fā)現(xiàn)單峰駝凝乳酶與牛凝乳酶有不同的特性,單峰駝凝乳酶表現(xiàn)出比牛凝乳酶高70%的凝乳活性,卻只有牛凝乳酶的20%非特異性蛋白酶活性。動(dòng)力學(xué)分析表明,達(dá)到半飽和時(shí),其所需的底物僅是牛凝乳酶的50%還少,并且牛凝乳酶不能凝結(jié)駱駝乳,說明駱駝凝乳酶有較高的凝乳活性。Jensen等[5]研究表明單峰駝凝乳酶的穩(wěn)定性高于牛凝乳酶。

    本研究主要運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)雙峰駝凝乳酶基因及相應(yīng)的氨基酸序列的同源性、理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、親水性/疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及活性位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析。旨在為研究雙峰駝凝乳酶的凝乳特性及其條件提供理論參考。

    1 材料和方法

    1.1 雙峰駝凝乳酶原基因序列的獲得

    首先從Broe[6]等人在2011申請(qǐng)的專利中獲得雙峰駝凝乳酶原基因序列,由上海生工生物工程有限公司合成雙峰駝凝乳酶原基因開放閱讀框序列,在大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá),發(fā)現(xiàn)雙峰駝凝乳酶原融合蛋白以包涵體形式表達(dá),分子大小與理論值相符。將雙峰駝凝乳酶原融合蛋白包涵體溶于尿素,但透析復(fù)性的雙峰駝凝乳酶原融合蛋白經(jīng)過酸化/中和處理并沒有得到有活性的凝乳酶,說明該基因序列所產(chǎn)生的雙峰駝凝乳酶原有誤。隨后通過檢索GeneBank數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)Kappeler等人正式注冊的雙峰駝凝乳酶原基因序列,與從專利獲得的序列比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)兩者雙峰駝凝乳酶原有六個(gè)氨基酸的差異,推測可能是這六個(gè)氨基酸的差異導(dǎo)致合成的凝乳酶無活性。本研究采用從GeneBank數(shù)據(jù)庫中獲得的雙峰駝凝乳酶原基因序列進(jìn)行分析。

    1.2 生物信息學(xué)分析

    利用 NCBI及 ProtParam、ProtScale、SignalP 4.0 Server、TMHMM2.0、等在線工具進(jìn)行核酸及氨基酸序列的組成、理化性質(zhì)、信號(hào)肽和親水性/疏水性分析;利用Blast和DNAMAN在線工具以及MEGA4.0軟件,進(jìn)行氨基酸序列的序列比對(duì)和同源性分析。所用軟件或在線工具有關(guān)信息見表1。

    表1 預(yù)測基因結(jié)構(gòu)和功能應(yīng)用的網(wǎng)站及軟件Table 1 The websites and softwares for predicting the gene structure and function

    2 結(jié)果與分析

    2.1 雙峰駝凝乳酶原基因序列

    雙峰駝凝乳酶原基因序列是一個(gè)完整的開放閱 讀框,為1 146 bp,編碼381個(gè)氨基酸(見圖1)。

    圖1 雙峰駝凝乳酶原序列及其氨基酸序列Fig.1 Nucleotide acid sequence and amino acid sequence of prochymosin in camelus bactrianus

    2.2 雙峰駝凝乳酶原的同源性分析

    通過GeneBank數(shù)據(jù)庫中的Blastp程序,對(duì)雙峰駝凝乳酶的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,數(shù)據(jù)顯示其與單峰駝,牦牛、牛、山羊、印度水牛、綿羊凝乳酶氨基酸序列相似性分別為99%、84%、84%、84%、83%和84%。利用DNAMAN軟件對(duì)雙峰駝凝乳酶原的氨基酸序列和其它物種凝乳酶原的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)(見圖2)。運(yùn)用MEGA4.0軟件,根據(jù)上述動(dòng)物的凝乳酶原的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖3),進(jìn)一步的驗(yàn)證了其同源性。

    圖2 雙峰駝凝乳酶原以及其它動(dòng)物種凝乳酶原的基氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Homology analysis of camelus bactrianus prochymosin amino acid sequences and those from other animal species

    圖3 不同物種基于凝乳酶原氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of different species basedon amino acid of prochymosin in camelus bactrianus

    2.3 雙峰駝凝乳酶原氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)預(yù)測分析

    通過ExPASyProtParam預(yù)測雙峰駝凝乳酶原基因編碼的氨基酸序列的組成和理化性質(zhì),并與單峰駝、牛等動(dòng)物凝乳酶原基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,凝乳酶原基因均編碼381個(gè)氨基酸,并且其帶正、負(fù)電荷氨基酸數(shù)目相差甚微,分子量差異很小,等電點(diǎn)在4.8到5.9之間,其半衰期均大于10小時(shí),表明其有較高穩(wěn)定性,根據(jù)定義當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)分值小于40時(shí),預(yù)測蛋白質(zhì)比較穩(wěn)定;當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)分值大于40時(shí),則該蛋白質(zhì)不穩(wěn) 定[7],因此七種凝乳酶原均為較穩(wěn)定的蛋白。

    表2 不同物種凝乳酶原的氨基酸理化性質(zhì)的比較Table 2 The physical and chemical characteristics of amino acid sequences of different prochymosin

    2.3 雙峰駝凝乳酶原的保守結(jié)構(gòu)域分析

    通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(Conserved Domain Database,CDD),分析雙峰駝凝乳酶原中的保守結(jié)構(gòu)域(見圖4),結(jié)果顯示雙峰駝凝乳酶原屬于胃蛋白酶A超家族,含有多個(gè)胃蛋白酶保守結(jié)構(gòu)域。

    圖4 預(yù)測的雙峰駝凝乳酶原保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conserved domain prediction of prochymosin in camelus bactrianus

    2.4 雙峰駝凝乳酶的亞細(xì)胞定位

    應(yīng)用Psort工具預(yù)測雙峰駝凝乳酶的亞細(xì)胞定位,結(jié)果見表2,其可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(膜)、過氧化物酶體、細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(腔)。表3顯示雙峰駝凝乳酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(膜)的概率較高,為0.820,定位于過氧化物酶體、細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(腔)的概率甚微。

    表3 雙峰駝凝乳酶原的亞細(xì)胞定位Table 3 Subcellular location of prochymosin of camelus bactrianus

    2.5 雙峰駝凝乳酶原信號(hào)肽預(yù)測和分析

    圖5 雙峰駝凝乳酶信號(hào)肽預(yù)測Fig.5 Signal P prediction of prochymosin in camelus bactrianus

    通過Signal P4.0Server軟件預(yù)測雙峰駝凝乳酶信號(hào)肽(見圖5),結(jié)果顯示:第17位絲氨酸殘基具有最高的原始剪切位點(diǎn)分值0.661,第8位亮氨酸殘基具有最高的信號(hào)肽分值0.946,第17位絲氨酸殘基具有最高的綜合剪切位點(diǎn)分值0.778。由于氨基酸殘基的原始剪切位點(diǎn)和信號(hào)肽的分值均,可推測雙峰駝凝乳酶基因所編碼的蛋白存在信號(hào)肽,屬于分泌蛋白,與Foltman關(guān)于牛凝乳酶的研究一致,該研究表明牛凝乳酶存在一個(gè)16個(gè)氨基酸組成的前導(dǎo)信號(hào)序列,在通過細(xì)胞膜分泌中很重要[15]。

    2.6 雙峰駝凝乳酶原跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測和分析

    跨膜結(jié)構(gòu)域是膜內(nèi)在蛋白與膜脂相結(jié)合的主要部位,它固著于細(xì)胞膜上起錨定作用,一般由20個(gè)左右的疏水氨基酸組成。通過Expasy軟件中的TMHMM Server v.2.0工具預(yù)測雙峰駝凝乳酶原基因的跨膜螺旋區(qū)(見圖6)。預(yù)測結(jié)果顯示,雙峰駝凝乳酶原基因氨基酸序列中不存在跨膜螺旋區(qū),蛋白質(zhì)整體381個(gè)氨基酸殘基全部在膜外,為非跨膜蛋白。

    圖6 雙峰駝凝乳酶原跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.6 Predicted transmembrane domain of prochymosin in camelus bactrianus

    2.7 雙峰駝凝乳酶原氨基酸序列的疏水性親水性的預(yù)測和分析

    通過ExPASyProtScale在線軟件,對(duì)雙峰駝凝乳酶原基因所編碼的氨基酸序列的疏水性親水性進(jìn)行預(yù)測,其結(jié)果見圖7,分析雙峰駝凝乳酶的結(jié)果顯示,雙峰駝凝乳酶,最高的分值3.300,為第7位的亮氨酸,疏水性最強(qiáng);最低的分值-2.789,為第115和116位的精氨酸和苯丙氨酸,親水性最強(qiáng)。GRAVY值是測蛋質(zhì)的疏水性標(biāo)準(zhǔn),通常GRAVY值分布在2至-2之間,如為正值,則該蛋白為疏水蛋白;如為負(fù)值,則為親水蛋白。其GRAVY值為 -0.096,從整體來看,親水性氨基酸殘基的分布在整條肽鏈上,且在整體上多于疏水性氨基酸殘基,推測雙峰駝凝乳酶是一種可溶性蛋白。

    圖7 雙峰駝凝乳酶原氨基酸序列的疏水性親水性預(yù)測Fig.7 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of the amino acidsequence of camelus bactrianus prochymosin

    2.8 雙峰駝凝乳酶原二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析

    蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋,延伸鏈,β轉(zhuǎn)角,無規(guī)則卷曲以及模序等蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)組件。通過GOR4方法對(duì)雙峰駝凝乳酶原二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析(見表4,圖8),在雙峰駝凝乳酶原二級(jí)結(jié)構(gòu)中,無規(guī)則卷曲占的比例最高為53.02%,α螺旋占17.32%,延伸鏈占29.66%。由此可推測,無規(guī)卷曲是雙峰駝凝乳酶原二級(jí)結(jié)構(gòu)中最大量的結(jié)構(gòu)元件,α螺旋和延抻鏈分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

    表4 雙峰駝凝乳酶二級(jí)結(jié)構(gòu)典型構(gòu)象統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 Secondary structure prediction of camelus bactrianus prochymosin

    圖8 雙峰駝凝乳酶原二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析Fig.8 Predicted secondary structure of camelus bactrianus prochymosin

    2.9 雙峰駝凝乳酶原的活性位點(diǎn)的分析

    通過NPS的PROSCAN對(duì)雙峰駝凝乳酶原進(jìn)行活性位點(diǎn)的分析(見表5),結(jié)果顯示,雙峰駝凝乳酶原有6類活性位點(diǎn),分別是N-糖基化位點(diǎn)、cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、蛋白酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化、N–十四?;稽c(diǎn)、真核生物和病毒天門冬氨酰蛋白酶活性位點(diǎn)。這可能與凝乳酶的分泌以及自剪切成為有活性的酶等生物學(xué)功能相關(guān)。

    表5 雙峰駝凝乳酶原在NPS中的活性位點(diǎn)預(yù)測分析Table 5 Scanning of camelus bactrianus prochymosin for site/signatures against proscan database in NPS

    3 結(jié)論

    駱駝乳具有多種生理活性物質(zhì),營養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般的動(dòng)物乳制品。這些獨(dú)特成分使其在防病抗病方面起著積極的作用[16]。Jesper等研究的結(jié)果表明,單峰駝凝乳酶作為一種替代品已經(jīng)被成功地銷售,因?yàn)槠淠芴峁┹^高的干酪產(chǎn)量和制備的干酪苦味少,風(fēng)味很好,并且蛋白水解的活性較低[17]。Bansal N.等研究的結(jié)果表明,單峰駝凝乳酶適合用于契達(dá)奶酪的制作,不僅蛋白水解水平較低,并且具有有良好的風(fēng)味[18]。目前駱駝凝乳酶研究較少,對(duì)于雙峰駝凝乳酶原基因的生物信息分析尚未見報(bào)道,因此駱駝凝乳酶開發(fā)利用前景廣闊。

    本研究運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件,系統(tǒng)地研究了雙峰駝凝乳酶原的基因序列和氨基酸序列。結(jié)果顯示,雙峰駝凝乳酶原基因全長1 146 bp,編碼381個(gè)氨基酸,屬于胃蛋白酶A超家族,可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(膜)的穩(wěn)定親水性蛋白,不含跨膜結(jié)構(gòu)域。無規(guī)卷曲是其二級(jí)結(jié)構(gòu)中最大量的結(jié)構(gòu)元件,α螺旋和延抻鏈分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中,編碼蛋白有6類活性位點(diǎn),主要分為N-糖基化位點(diǎn),蛋白激酶磷酸化位點(diǎn),蛋白酶磷酸化位點(diǎn),N-十四酰化位點(diǎn)和蛋白酶活性位點(diǎn)。通過分析雙峰駝凝乳酶原基因及其編碼蛋白質(zhì)的特征為研究其凝乳特性及其條件提供理論參考,對(duì)凝乳酶凝乳功能的研究具有重要的意義。

    References)

    [1] 鐘繼才.凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國乳品工業(yè),2006,6(1):54-56.ZHONG Jicai.Application of rennin in cheese making[J].China Dairy Industry,2006,6(1):54-56.

    [2] WILLIAMS M G,WILSHER J,NUGENT P,et al.Mutagenesis,biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin[J].Protein Eng,1997,10(9):991-997.

    [3] 周俊清.產(chǎn)高效凝乳酶菌株獲得方法的探討[J].食品科學(xué),2005,26(3):253-256.ZHOU Junqing.Discussion on method of yielding high effect chymosin-producing strain [J]. Food Science,2005,26(3):253-256.

    [4] KAPPELER S R,BRINK H M V D,RAHBEK-NIELSEN H,et al.Characterization of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk [J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,342(2):647-654.

    [5] JANGHOLM JENSEN J, M?LGAARD A, NAVARRO POULSEN J C,et al.Camel and bovine chymosin:the relationship between their structures and cheese-making properties[J].Biological Crystallography,2013,D69,901-913.

    [6] BROE M L,BRINK J V D,HARBOE M R.Marianne Kirsten Harboe.Coagulation of Milk [P].United States,US2011/0008492A1,2011-1-13.

    [7] 陳珊珊,郭晉隆,李國印,等.甘蔗過氧化氫酶基因的電子克隆及生物信息學(xué)分析[J].生物信息學(xué),2012,10(1):65-70.CHEN Shanshan,GUO Jinlong, LIGuoyin,etal.Electronic cloning and characterization of CAT gene from Saccharum officinarum using bioinformatics tools [J].Chinese Journal of Bioinformaties,2012,10(1):65-70.

    [8] GASTEIGER E,HOOGLAND C,GATTIKER A,et al.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[J].The Proteomics Protocols Handbook,2005,571-607.

    [9] PETERSEN T N,BRUNAK S,HEIJINE G V,et al.Signal P 4.0: discriminating signalpeptidesfrom transmembrane regions [J].Nature Methods,2011,8(10):785-786.

    [10] NAIR R,ROST B.Better prediction of sub-cellular localization by combing evolutionary and structural information[J].PROTEINS:Structure,F(xiàn)unction,and Genetics,2003,53:917-930 .

    [11]郝愛平,熊超超.小鼠Pitx2基因的生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù),2012,22(6):13-16.HAO Aiping,XIONG Chaochao.Bioinformatics analysis of pitx2 gene in mouse[J].Biotechnology,2012,22(6):13-16.

    [12] MA Tingting,ZHOU Yijun,GAO Fei,et al.Bioinformatical analysis on sequence and functions ofperoxidase in Arabidopsis [J]. Agricultural Biotechnology,2012,13(8):1645-1650.

    [13] TAMNRA R,DUDLEY J,NEI M,et al.MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0[J].Molecular Biology Evolution,2007,24(8):1596-1599.

    [14]蔡明,高貝,張道遠(yuǎn).齒肋赤蘚熱激蛋白60基因的電子克隆和生物信息學(xué)分析[J].生物信息學(xué),2013,11(3):216-223.CAI Ming, GAO Bei, ZHANG Daoyuan. Electronic cloning and characterization of HSP60 gene from Syntrichia caninervis using bioinformatics tool[J].Chinese Journal of Bioinformaties,2013,11(3):216-223.

    [15] FOLTMANN B,PEDERSEN V B,JACOBSEN H,et al.The complete amino acid sequence ofprochymosin [J].Proc Natl Acad Sci USA,1977,74:2321-2324.

    [16]何俊霞,哈斯蘇榮,那仁巴圖,等.駝乳醫(yī)療保健作用的研究進(jìn)展Ⅱ[J].食品科學(xué),2009,30(23):504-507.HE Junxia,HASISURONG,NARENBATU,et al.Research progress in health care function of camel milk[J].Food Science,2009,30(23):504-507.

    [17] S?RENSEN J,PALMER D S,QVIST K B,et al.Initial Stage of Cheese Production:A Molecular Modeling Study of Bovine and Camel Chymosin Complexed with Peptides from the Chymosin-Sensitive Region of K-Casein [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59:5636-5647.

    [18] BANSAL N,DRAKE M A D A,PIRAINO P,et al.Suitability of Recombinant Camel(Camelus Dromedarius)Chymosin as a Coagulant for Cheddar Cheese [J].International Dairy Journal,2009,19:510-517.

    猜你喜歡
    雙峰駝凝乳酶結(jié)構(gòu)域
    極危物種
    ——野雙峰駝
    更正
    蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域劃分方法及在線服務(wù)綜述
    米黑毛霉UV-LiCl-6凝乳酶酶學(xué)特性研究
    重組綠豆BBI(6-33)結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用分析
    組蛋白甲基化酶Set2片段調(diào)控SET結(jié)構(gòu)域催化活性的探討
    干酪用牛凝乳酶替代品的研究進(jìn)展*
    蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNA Cytb基因和D-loop序列的遺傳多樣性
    泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與泛素化信號(hào)的識(shí)別
    牛凝乳酶原基因在畢赤酵母中的表達(dá)及其酶學(xué)特性的研究
    99久久综合免费| 少妇人妻 视频| 亚洲美女视频黄频| 亚洲国产欧美在线一区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲四区av| 2021少妇久久久久久久久久久| 99热国产这里只有精品6| 一区二区av电影网| 欧美国产精品一级二级三级| 国产99久久九九免费精品| 婷婷色综合www| av不卡在线播放| 久久久精品区二区三区| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久精品国产a三级三级三级| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲在久久综合| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品 国内视频| 国产黄色免费在线视频| 最新的欧美精品一区二区| 国产国语露脸激情在线看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产一区亚洲一区在线观看| 国产亚洲最大av| 啦啦啦在线免费观看视频4| 一本大道久久a久久精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 一个人免费看片子| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 哪个播放器可以免费观看大片| 高清黄色对白视频在线免费看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 麻豆乱淫一区二区| av不卡在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| bbb黄色大片| 国产一区二区三区综合在线观看| 午夜日韩欧美国产| 亚洲伊人色综图| 国产男人的电影天堂91| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美xxⅹ黑人| 国产在线免费精品| 人妻 亚洲 视频| 欧美97在线视频| 91成人精品电影| 免费看av在线观看网站| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品免费大片| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产xxxxx性猛交| 一区二区三区激情视频| 久久久国产一区二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 香蕉丝袜av| 久久久久精品人妻al黑| 黑丝袜美女国产一区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品无大码| 精品一区二区免费观看| 我的亚洲天堂| 精品午夜福利在线看| 亚洲综合色网址| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美久久黑人一区二区| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲精品日本国产第一区| 一级毛片电影观看| 久久99热这里只频精品6学生| 午夜福利影视在线免费观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩一区二区三区影片| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲一区二区三区欧美精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲成人免费av在线播放| 日本欧美视频一区| 亚洲av电影在线进入| 日韩大码丰满熟妇| 国产男女内射视频| 免费日韩欧美在线观看| 老熟女久久久| 亚洲中文av在线| 欧美日本中文国产一区发布| 深夜精品福利| 亚洲,欧美,日韩| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产欧美亚洲国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 高清不卡的av网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲中文av在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 乱人伦中国视频| 90打野战视频偷拍视频| 少妇的丰满在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美在线一区亚洲| 国产精品一区二区在线不卡| 老汉色∧v一级毛片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产av一区二区精品久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文天堂在线官网| 国产精品无大码| 成人国语在线视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 日韩大片免费观看网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品久久蜜臀av无| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久久久久久久久久大奶| 免费看不卡的av| 亚洲久久久国产精品| 免费高清在线观看日韩| av在线观看视频网站免费| 大码成人一级视频| 在线观看免费高清a一片| 丁香六月欧美| 国产成人欧美| 一区福利在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 极品人妻少妇av视频| 国产精品女同一区二区软件| 国产片特级美女逼逼视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 操美女的视频在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| videosex国产| 又大又爽又粗| av网站在线播放免费| 女人精品久久久久毛片| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久精品国产a三级三级三级| www.av在线官网国产| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 好男人视频免费观看在线| 在线观看www视频免费| 午夜福利乱码中文字幕| 美女大奶头黄色视频| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 日本色播在线视频| 国产男人的电影天堂91| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲av电影在线进入| 久久99精品国语久久久| 国产片内射在线| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品免费大片| 超碰成人久久| www.熟女人妻精品国产| 高清欧美精品videossex| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 中文字幕av电影在线播放| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲国产精品国产精品| 美女高潮到喷水免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲一区二区三区欧美精品| 成人漫画全彩无遮挡| 99久国产av精品国产电影| 高清在线视频一区二区三区| 国产精品久久久久成人av| 男人爽女人下面视频在线观看| 美女福利国产在线| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99久久综合免费| 午夜福利乱码中文字幕| 在线观看免费日韩欧美大片| 观看美女的网站| 免费观看a级毛片全部| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲专区中文字幕在线 | h视频一区二区三区| 少妇精品久久久久久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品三级大全| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 天美传媒精品一区二区| 亚洲四区av| 高清av免费在线| 欧美日韩av久久| 久久ye,这里只有精品| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费看av在线观看网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲精品视频女| 久久久国产精品麻豆| 黄频高清免费视频| 国产男女超爽视频在线观看| 国产在线免费精品| 黑丝袜美女国产一区| 在线看a的网站| 国产成人精品无人区| √禁漫天堂资源中文www| 国产在视频线精品| 中文字幕高清在线视频| 香蕉国产在线看| 青春草国产在线视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产成人欧美在线观看 | 性色av一级| 麻豆av在线久日| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲天堂av无毛| 黄频高清免费视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 老司机在亚洲福利影院| 国产视频首页在线观看| 亚洲三区欧美一区| 丝瓜视频免费看黄片| 两个人免费观看高清视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产在视频线精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲欧美一区二区三区久久| 91老司机精品| 丝袜在线中文字幕| av有码第一页| 最新在线观看一区二区三区 | 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 丁香六月天网| 大香蕉久久成人网| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 人妻一区二区av| 午夜老司机福利片| 青春草国产在线视频| 天堂中文最新版在线下载| 国产av国产精品国产| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲av成人精品一二三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产av码专区亚洲av| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 桃花免费在线播放| 亚洲精品在线美女| 国产av码专区亚洲av| 久久青草综合色| 久久婷婷青草| 国产亚洲欧美精品永久| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 在线观看三级黄色| 新久久久久国产一级毛片| 男人操女人黄网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 满18在线观看网站| 亚洲色图综合在线观看| 考比视频在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品无大码| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人精品久久二区二区91 | 在线精品无人区一区二区三| 欧美少妇被猛烈插入视频| 一级爰片在线观看| 国产成人欧美在线观看 | 九草在线视频观看| 观看美女的网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产日韩欧美在线精品| 狂野欧美激情性xxxx| 男人舔女人的私密视频| 交换朋友夫妻互换小说| 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产1区2区3区精品| 亚洲,欧美精品.| 国产精品 欧美亚洲| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲天堂av无毛| 青春草国产在线视频| 国产精品 国内视频| 国产精品熟女久久久久浪| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲成色77777| 久久久久久久精品精品| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 老熟女久久久| 精品久久久久久电影网| 亚洲美女搞黄在线观看| bbb黄色大片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 成人手机av| 久久人人爽人人片av| 成人毛片60女人毛片免费| 老司机深夜福利视频在线观看 | 美女高潮到喷水免费观看| 综合色丁香网| 丁香六月天网| av在线观看视频网站免费| 两个人看的免费小视频| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲色图综合在线观看| 97在线人人人人妻| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲成国产人片在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 午夜日本视频在线| 午夜久久久在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 午夜激情久久久久久久| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 免费在线观看完整版高清| 午夜老司机福利片| 少妇 在线观看| 九草在线视频观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品久久久久久久久免| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av天堂久久9| 自线自在国产av| 国产成人精品久久二区二区91 | 国产在线一区二区三区精| 国产av精品麻豆| 国产精品免费大片| 欧美 日韩 精品 国产| 香蕉丝袜av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 一区在线观看完整版| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久性视频一级片| 成年人午夜在线观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲av电影在线进入| netflix在线观看网站| 国产毛片在线视频| 黄色怎么调成土黄色| 国产xxxxx性猛交| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久97久久精品| 国产精品.久久久| 国产99久久九九免费精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 我的亚洲天堂| 女人久久www免费人成看片| 毛片一级片免费看久久久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩欧美精品免费久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品久久久久成人av| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 久热这里只有精品99| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 男女无遮挡免费网站观看| 夫妻午夜视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 丁香六月欧美| 香蕉丝袜av| 在现免费观看毛片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美日韩视频精品一区| 999久久久国产精品视频| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲伊人色综图| 性少妇av在线| 亚洲专区中文字幕在线 | 婷婷色av中文字幕| 日本色播在线视频| 伊人久久国产一区二区| xxx大片免费视频| av在线老鸭窝| 亚洲av福利一区| 中文字幕制服av| 最新的欧美精品一区二区| 国产亚洲av高清不卡| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产免费现黄频在线看| 日韩免费高清中文字幕av| 男女之事视频高清在线观看 | 国产 精品1| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品久久久久久精品古装| 日本av免费视频播放| 国产一级毛片在线| 极品人妻少妇av视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品国产av在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 精品人妻熟女毛片av久久网站| av在线播放精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩一本色道免费dvd| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久性视频一级片| 国产深夜福利视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲成人免费av在线播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产精品国产三级专区第一集| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲专区中文字幕在线 | 亚洲精品国产av蜜桃| kizo精华| 五月天丁香电影| 欧美激情极品国产一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99热国产这里只有精品6| 久久久久精品性色| 捣出白浆h1v1| 欧美日韩成人在线一区二区| 中文字幕av电影在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品av久久久久免费| av天堂久久9| 日本欧美视频一区| 精品福利永久在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 欧美日韩av久久| 国产精品二区激情视频| 高清av免费在线| 精品视频人人做人人爽| 一区二区av电影网| 亚洲av综合色区一区| 大香蕉久久网| 一本色道久久久久久精品综合| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲第一青青草原| 美女主播在线视频| 黄色怎么调成土黄色| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品一区二区在线观看99| 久久这里只有精品19| 久久久久网色| 99re6热这里在线精品视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 97精品久久久久久久久久精品| 国产欧美亚洲国产| 在线观看三级黄色| 丝袜在线中文字幕| 欧美xxⅹ黑人| 我的亚洲天堂| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久久久久久久久久久大奶| 丁香六月欧美| 午夜福利一区二区在线看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲视频免费观看视频| 精品一区二区免费观看| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 最黄视频免费看| 丝袜在线中文字幕| 欧美黑人精品巨大| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲一区中文字幕在线| 中文天堂在线官网| 久久久久网色| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品久久久久成人av| 免费高清在线观看日韩| 亚洲国产最新在线播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 热re99久久国产66热| 看十八女毛片水多多多| 综合色丁香网| 久久天堂一区二区三区四区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 啦啦啦 在线观看视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 尾随美女入室| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲精品一二三| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲,欧美精品.| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲在久久综合| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产欧美亚洲国产| 午夜日韩欧美国产| av.在线天堂| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美人与善性xxx| 午夜免费鲁丝| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲情色 制服丝袜| 日本黄色日本黄色录像| 观看美女的网站| 黄色一级大片看看| 亚洲国产欧美网| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲精品日本国产第一区| 高清黄色对白视频在线免费看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 美女大奶头黄色视频| 青春草国产在线视频| 香蕉国产在线看| 三上悠亚av全集在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲美女黄色视频免费看| 如何舔出高潮| 永久免费av网站大全| 一级黄片播放器| 老司机影院毛片| 9191精品国产免费久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲四区av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一级黄片播放器| 婷婷色综合大香蕉| 热re99久久精品国产66热6| 欧美日韩视频精品一区| 韩国精品一区二区三区| 成人国产av品久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 乱人伦中国视频| 免费不卡黄色视频| 丝袜喷水一区| 最黄视频免费看| 99久久人妻综合| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产男人的电影天堂91| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 日韩一区二区视频免费看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产一区有黄有色的免费视频| 中文字幕色久视频| avwww免费| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲,欧美精品.| 黄色毛片三级朝国网站| av.在线天堂| 99热全是精品| 熟女av电影| 啦啦啦在线免费观看视频4| 尾随美女入室| 妹子高潮喷水视频| 男女免费视频国产| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美日韩视频精品一区| 晚上一个人看的免费电影| 国产 一区精品| 18禁观看日本| 视频区图区小说| 97在线人人人人妻| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品亚洲成a人片在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品人妻一区二区三区麻豆| 性少妇av在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品久久午夜乱码| av有码第一页| 老司机深夜福利视频在线观看 | 99久国产av精品国产电影|