心梗大鼠持續(xù)和間歇運動干預的心肌血管新生相關miRNAs表征與EGFL7/miR126-PIK3R2 /SPRED1通路激活的心臟保護效應

宋偉，田振軍，Shao-jun Du

心梗大鼠持續(xù)和間歇運動干預的心肌血管新生相關miRNAs表征與EGFL7/miR126-PIK3R2 /SPRED1通路激活的心臟保護效應

宋偉1，田振軍1，Shao-jun Du2

心肌梗死（Myocardial infarction，MI）導致心肌細胞缺血缺氧，發(fā)生替代性纖維化，嚴重損害心功能。常用的治療手段有藥物治療、介入治療和外科手術治療等。但心?；颊叩脑缙陬A防和治療后的康復手段與方法篩選至關重要［10，29］。動物和人體臨床研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)和間歇運動干預在心梗心臟康復中發(fā)揮積極作用［23，24，52］，其機制尚未完全闡明。

Micro RNA（miRNA）是一類在進化上高度保守的單鏈非編碼小RNA，長約18～25個核苷酸，可通過對靶mRNA的降解或抑制翻譯方式負調控靶基因［32］。近年來的表觀遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在缺血心臟保護中發(fā)揮重要作用［39，46］，目前已經(jīng)證實，心梗后有數(shù)條miRNAs表達發(fā)生變化，并通過不同途徑參與心梗心臟功能的調控［6，21，38］。運動可有效改變機體心肌、骨、骨骼肌和血液等多個器官和部位的miRNAs表征［5，16，35］，大鼠10周游泳訓練后心臟的48 條miRNA顯著升高，39條miRNA顯著降低［40］。耐力訓練可降低心肌miR-1和miR-133a的表達，同時激活miR-208a、miR-499下游調節(jié)通路。提示，miRNA表達可能參與了心臟重塑的適應過程［4］，但miRNA在運動保護心梗心臟功能的作用，缺乏文獻報道。

心梗治療與康復的關鍵是血運重建。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可靶向刺激血管內皮生長因子（VEGF）通路的PIK3R2/ SPRED1發(fā)揮血管新生作用［12］，但在運動刺激心梗心臟血管新生中相關的miRNAs是否表達，發(fā)揮心功能保護作用，尚缺乏文獻報道。本研究通過測定持續(xù)和間歇運動后心梗大鼠心肌血管新生顯著相關miRNAs（包括促血管新生的miR-126、miR-130a、miR-17-5p及抗血管新生的miR-15b、miR-16、miR-221、miR-222）和miR-126宿主基因egfl7及其靶蛋白的表達，分析miRNA與血管新生在運動保護心梗心臟功能中的作用，旨在為缺血心臟運動康復機制研究與運動康復手段及方法篩選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

主要儀器：ZH-PT8通道動物跑臺、BX51奧林巴斯光學顯微鏡、SZX16奧林巴斯體視顯微鏡、Powerlab/8ST生物信號采集處理系統(tǒng)、Thermo scientific超低溫冰箱、LEICA RM2126切片機、BMII型病理組織包埋機、Bio Tek epoch超微量微孔板分光光度計、Bio Rad CFX96實時熒光定量PCR儀、DYCZ-24EN水平電泳儀和Bio MP4轉膜儀、Thermo Fisher Fresco21低溫高速離心機、Bio-Rad Chemidoc MP全能型凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 動物分組、心梗模型制備與運動方案

雄性清潔級3月齡SD大鼠（購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格號為SCXK2012-098）40只，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假心梗組（S）、心梗組（MI）、心梗+間歇運動組（MIE）、心梗+持續(xù)運動組（MCE），每組10只。采用左冠狀動脈前降支結扎法制備心肌梗死模型，假手術組僅穿線不結扎，各組大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水。

心梗大鼠模型制備：大鼠稱重，腹腔麻醉（戊巴比妥鈉30 mg/kg），采用人工面罩呼吸，連接呼吸機和心電圖機，心電圖監(jiān)測采用肢體導聯(lián)。開胸，暴露心臟，體視顯微鏡下于左心耳下緣2 mm處結扎左冠狀動脈前降支，進針深度為0.3～0.5 mm。肉眼可見結扎遠端心肌顏色變淺，心電圖ST段弓背向上抬高為結扎成功標志。探查無出血后留管關胸并排氣。

間歇運動方案：參考Kraljevic等［24］心梗4周后的8周間歇運動方案。一般心梗手術后1～4周為血管新生高峰期，故本實驗選擇術后1周開始跑臺適應性訓練（15 m/min，30 min/天×5天）。之后以25 m/min×4min（85%～90%V˙O2max）和15 m/min×3 min（50%～60%V˙O2max）依次交替進行7輪，最后以10 m/min速度運動1 min，運動總距離為1 065m，運動總時間為60 min，5天/周×8周。

持續(xù)運動方案：心梗手術1周后開始進行跑臺適應性訓練（15 m/min，30 min/天×5天）。正式訓練以10 m/min速度（40%～50%V˙O2max）運動5 min，之后以16 m/min（50%～60%V˙O2max）速度持續(xù)運動64 min，最后以10 m/min速度運動1 min，運動總距離與間歇運動相同，總時間為75 min，5 天/周×8周。

1.3 心功能測定

訓練結束后次日，腹腔麻醉，經(jīng)右頸總動脈插管至左心室，以動脈血壓和心室內壓波形變化作為判斷插管成功的標志，之后將導管連同右頸總動脈結扎固定，穩(wěn)定數(shù)分鐘后，采用生物信號采集系統(tǒng)記錄左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室壓力最大上升和最大下降速率（±dp/dt max）等指標。

1.4 取材、樣品處理與組織學實驗

取材與樣品處理：心功能測畢即刻迅速開胸，摘取心臟，4只速入10%中性甲醛固定，剩余6只速入液氮，24 h后移置-80℃冰箱待用。甲醛固定標本進行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度5 μm）。石蠟切片進行常規(guī)Masson染色，每張染色切片測量心肌膠原容積分數(shù)（Collagen Volume Fraction，CVF），CVF=膠原面積/心肌組織總面積×100%。

免疫組織化學實驗：切片經(jīng)3%H2O2滅活內源性酶，微波爐加熱抗原修復。一抗為兔源單克隆抗體CD31（稀釋濃度1:200，SAB）。陰性對照采用PBS替代，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。α-SMA陽性判定采用積分光密度法（Integrated Optical Density，IOD）。CD31陽性判定按Weidner標準進行［50］，即棕黃色單個內皮細胞或者內皮細胞簇均為1個血管計數(shù)，肌層較厚及管腔大于8個紅細胞直徑的血管不計數(shù)?！?0倍鏡下觀察血管高密度區(qū)，×400倍鏡下計數(shù)，每個樣本計數(shù)5張切片，計算微血管平均密度值（microvessel density，MVD）。

1.5 Western Blot實驗

心肌組織50 mg加入預冷蛋白抽提試劑，電動勻漿機勻漿，4℃離心，12000 rpm持續(xù)15 min，取上清，BCA試劑盒蛋白定量。常規(guī)制膠、上樣、電泳、轉膜，3%BSA室溫封閉1 h，孵育一抗PIK3R2（1:500，Signalway Antibody）、SPRED1（1:500，Merck Millipore），VEGF（1:800，SAB）4℃過夜。次日復溫30 min，清一抗，孵育山羊抗兔二抗（1：10000），室溫50 min，洗二抗，ECL發(fā)光，全能型凝膠成像系統(tǒng)成像，內部參照為GAPDH。

1.6 RT-qPCR實驗

常規(guī)Trizol試劑提取MI心臟梗死邊緣區(qū)心肌組織總RNA，登陸www.mirbase.org查閱相關miRNA序列，管家基因以U6作為內參，U6基因上游引物序列為5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3。7條miRNAs引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，其上游引物序列為：rno-miR-15b，TAGCAGCACATCATGGTTTACA；rno-miR-221，AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC；rno-miR-222，TCCTACATCTGGCTACTGGGT；rno-miR-16，TAGCAGCATAGAAATATTGGCG；rnomiR-17-5p，CAAAGTCCTTACAGTGCAGGTAG；rno-miR-130a，GGTCCTGAATGTTAAAAGGGCAT；rno-miR-126，GGCATTACTTTTGGTACGCGAAA。下游引物皆為TAKARA提供的通用引物，退火溫度均為70℃。

pik3r2、spred1、egfl7引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，內參基因為gapdh，序列分別為pik3r2，F(xiàn):5-GGCC CTTGGATGGACCTTCT-3，R:5-GCTCAATGGCTTCTATCAGC TTCAC-3，退火溫度58℃；spred1，F(xiàn):5-GGAGCCTCAAGTCCCAAGCTA-3，R:5-TTTCCAC ATGTCCGGATGTC-3，退火溫度55℃；egfl7，F(xiàn)：TGACTAGAGGCCGGACCACA，R:GCCAGTACTAG AAACCACGCTACAA，退火溫度為55℃；gapdh，F(xiàn):5-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3，R: 5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3，退火溫度55℃；分別參見QIAGEN和TAKARA公司試劑盒對miRNA和目標基因進行逆轉錄和實時RT-qPCR擴增反應。

1.7 圖像與數(shù)據(jù)處理

免疫組化切片經(jīng)光鏡觀察、拍照，Image Pro-plus 6.0軟件進行測量分析；Real time RT-PCR數(shù)據(jù)采用2—△△Ct法計算樣品miRNA相對含量；Western Blot實驗結果采用Adobe Photoshop CS6和Image J軟件采集處理。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0 Demo軟件轉換作圖；數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0進行one-way ANOVA和皮爾遜指數(shù)相關分析。所有實驗結果用平均數(shù)±標準差（X±SD）表示。顯著性差異選擇P＜0.05和P＜0.01水平。

2 實驗結果

2.1 心肌血管新生相關miRNAs的RT-qPCR檢測結果

血管新生相關miRNAs表達的RT-qPCR結果顯示，與S組比較，MI組miR-222表達顯著上調（P＜0.05），miR-126表達顯著下調（P＜0.05）；與MI組比較，MIE組miR-17-5p、miR-126表達均顯著上調（P＜0.05，P＜0.01）；與MCE組比較，MIE組miR-126表達顯著上調（P＜0.05），其余各組miR-15b、miR-16、miR-221、miR-130a均無顯著性變化（圖1）。

具有顯著變化的miRNAs表達平均值變化率統(tǒng)計顯示，與S組比較，MI組miR-126表達降低38%，miR-222表達升高30%；與MI組比較，MIE組miR-126表達升高47%，miR-17-5p升高31%；與MCE組比較，MIE組miR-126平均值變化率為22%（圖1）。

表明，心梗后miR-222表達顯著上調，miR-126表達顯著下調；心梗大鼠進行運動干預后miR-126、miR-17-5p的表達均顯著上調，其中，miR-126表達變化最顯著。

圖1 心梗大鼠心肌血管新生相關miRNAs的RT-qPCR檢測結果及平均值變化率Figure 1.Expression of Myocardial miRNAs Related to Angiogenesis（RT-qPCR）and the Change Rate of the Mean Value

2.2 心肌PIK3R2和SPRED1基因和蛋白表達結果

pik3r2 mRNA和spred1 mRNA表達的RT-qPCR結果顯示（圖2），與S組比較，MI組均顯著上調（P＜0.05）；與MI組比較，MCE和MIE組表達均顯著下調（P＜0.05，P＜0.01）；與MCE組比較，MIE組spred1mRNA表達顯著下調（P＜0.05），pik3r2 mRNA表達無顯著變化。

PIK3R2和SPRED1表達的Western Blot結果顯示（圖2），與S組比較，MI組PIK3R2表達顯著上調（P＜0.01），SPRED1表達無顯著變化；與MI組比較，MCE和MIE組均顯著下調（P＜0.01，P＜0.05）；與MCE組比較，MIE組SPRED1表達顯著下調（P＜0.05）。

表明，心梗大鼠進行運動干預可抑制miR-126下游靶基因和蛋白PIK3R2/SPRED1的表達，且間歇運動的抑制效應優(yōu)于持續(xù)運動。

圖2 心梗大鼠心肌PIK3R2和SPRED1 mRNA和蛋白表達結果Figure 2.Gene and Protein Expression of miR-126 Targets

2.3 心肌egfl7 mRNA表達及其與miR-126表達相關性

心肌egfl7 mRNA的RT-qPCR結果顯示（圖3），與S組比較，MI組表達顯著下調（P＜0.01）；與MI組比較，MIE組表達顯著上調（P＜0.01），MCE組表達無顯著變化。egfl7 mRNA與miR-126的相關性分析結果顯示（圖3），兩者表達呈顯著正相關（R=0.65，P＜0.05）。

表明，心梗大鼠進行持續(xù)和間歇運動干預可激活miR-126宿主基因egfl7的表達，且egfl7 mRNA與miR-126表達變化關系密切。

2.4 心肌血管新生、間質膠原與心功能測定結果

CD31是血管內皮細胞標記物，可反映血管新生狀況。免疫組化結果顯示，CD31蛋白陽性表達為棕色，主要分布于血管內皮細胞膜。與S組比較，MI組表達顯著升高（P＜0.05）；與MI組比較，MIE組表達顯著升高（P＜0.05）；與MCE組比較，MIE組表達顯著升高（P＜0.05）。心肌VEGF的Western Blot結果顯示，與S組比較，MI組、MCE組和MIE組均表達顯著上調（P＜0.05，P＜0.01）；與MI組比較，MIE組表達顯著上調（P＜0.01，圖4）。表明，心梗后梗死邊緣區(qū)發(fā)生代償性血管新生，運動干預可促進梗死邊緣區(qū)的血管新生，且間歇運動更顯著。

圖3 心梗大鼠心肌egfl7 mRNA及其與miR-126表達的相關分析結果Figure 3.Expression of egfl7 mRNA and The Correlation Analysis between miR-126 and egfl7 mRNA

α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）是肌動蛋白的亞型之一，特異性表達于血管平滑肌細胞（VSMC）胞漿中，是收縮型VSMC的標志蛋白。免疫組化結果顯示（圖5），與S組比較，MCE組表達顯著升高（P＜0.05）；與MI組比較，MIE組表達顯著升高（P＜0.05）。表明，間歇運動干預可使梗死邊緣區(qū)VSMC發(fā)生表型逆轉，由合成型轉化為收縮型。

心肌Masson染色結果顯示，心肌膠原纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色，細胞核呈藍紫色。心肌CVF統(tǒng)計結果顯示（圖6），與S組比較，MI組顯著升高（P＜0.01）；與MI組比較，MIE組顯著降低（P＜0.01），MCE組無顯著性變化；與MCE組比較，MIE組顯著降低（P＜0.05）。表明，間歇運動干預可抑制心梗邊緣區(qū)膠原纖維過度增生，且效果優(yōu)于持續(xù)運動。

反映心功能的血流動力學指標顯示（表1），與S組比較，MI組大鼠LVSP和±dp/dtmax均顯著降低（P＜0.01），LVEDP顯著升高（P＜0.01）；與MI組比較，MIE組和MCE 組LVSP均顯著升高（P＜0.05），LVEDP均顯著降低（P＜0.05），MIE組+dp/dtmax顯著升高（P＜0.05）；與MCE組比較，MIE組LVSP、LVEDP均顯著升高（P＜0.05）。表明，心梗心臟心功能受損，運動顯著改善心梗心功能，且間歇運動更顯著。

圖4 心梗大鼠心肌CD31表達的免疫組化觀察分析及心肌VEGF蛋白表達結果（×400）Figure 4.Expression of CD31 and VEGF Protein in Rat Hearts

圖5 心梗大鼠心肌α-SMA表達的免疫組化觀察分析（×200）Figure 5.Expression of α-SMA

圖6 心梗大鼠心肌Masson染色結果（×200）Figure 6.Masson Staining of Cardiac Muscle（×200）

表1 心梗大鼠血流動力學指標變化Table 1.The Variation of Different Hemodynamic Index in Rat Hearts

3 分析討論

3.1 運動干預大鼠心梗心肌血管新生相關miRNAs表征分析

血管新生是在現(xiàn)有血管上形成新的血管并以血管內皮細胞增殖及遷移為主要表現(xiàn)的病理生理過程，在胚胎發(fā)育、組織再生、腫瘤生長及心梗心臟的康復過程中發(fā)揮作用。血管新生是一個受到多種信號通路和分子精確調控的復雜過程［51，53］，miRNA是其中一類重要的調控因子。miRNA是一類在進化上高度保守的單鏈非編碼小RNA，長18～25個核苷酸，它可以通過mRNA剪切和抑制蛋白質翻譯的方式負調控靶基因。miRNA是血管功能的關鍵調控者，參與了包括細胞分化、收縮、遷移、增殖、凋亡等多個過程。已經(jīng)證實有多個miRNA參與了血管新生的過程，如miR-16、miR-15b、miR-92、miR-296、miR-130a、miR-378、miR-210、miR-214、miR-221、miR-222、miR-424、miR-126和let-7 familiy等［34，42，43］。由于miRNA與血管新生之間的關系是雙向的，所以有學者把內皮細胞miRNA劃分為兩種：miRNA靶基因參與血管新生和促血管新生（pro-angiogenic）或抗血管新生（anti-angiogenic）刺激調控的miRNA。

有學者提出，運動的適應性與基因表達相一致，而基因之間交互作用的復雜性又限制了個別基因的識別［41，45］。運動可以導致不同信號級聯(lián)的激活，依次通過基因表達的變化來影響相關蛋白的合成［15，19，28，48］，而這些基因表達的變化很可能是伴隨著miRNA水平的變化而出現(xiàn)的。研究表明，運動可以導致多個細胞類型的miRNA水平出現(xiàn)改變［8，13］。趙永才［4］探討了不同運動（一次性力竭、有氧耐力）對小鼠心臟miRNA的影響，結果發(fā)現(xiàn)，耐力訓練可以降低心肌miR-1、miR-133a表達，同時提高了miR-208a及miR-499的調節(jié)通路，有利于心肌肥大的形成。賈明學等［2］對有氧運動訓練前、后正常小鼠心臟中miRNA做了基因芯片掃描，結果發(fā)現(xiàn)，多個miRNAs在運動前后發(fā)生了顯著性變化。本研究結果發(fā)現(xiàn)，持續(xù)和間歇運動可以不同程度改變血管新生相關的miRNAs的表達，促血管新生miRNAs增加趨勢明顯，抗血管新生miRNAs減少趨勢明顯，其中，miR-126在心梗及心梗持續(xù)和間歇運動干預后變化顯著，且變化率最大。提示，持續(xù)和間歇運動很可能通過血管新生相關miRNAs來促進心梗心肌血管新生，改善微循環(huán)，進而提升心功能。

3.2持續(xù)和間歇運動激活EGFL7/miR126-PIK3R2/SPRED1通路刺激心梗心臟血管新生

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，心梗后心肌miR-126表達顯著降低，間歇運動可顯著提高miR-126的表達，且效果優(yōu)于持續(xù)運動。miR-126是內皮細胞特異性miRNA，在內皮細胞中的含量非常豐富，可以促進血管新生及控制血管的完整性。EGFL7又稱表皮生長因子樣結構域7，是內皮細胞特異性表達因子，egfl7基因包含11個外顯子和一個miR-126，在機體血管及管腔形成過程中發(fā)揮重要作用［33］。miR-126基因定位于egfl7基因第7和第8號外顯子之間的內含子區(qū)［54］，miR-126不是由其本身的啟動子啟動轉錄，而是作為egfl7基因轉錄本的一部分被轉錄［25］，且兩者之間具有相同的轉錄調控機制。egfl7啟動子甲基化修飾可以使得miR-126的轉錄失活，導致表達下降甚至缺失，egfl7可通過誘導內皮細胞遷移提高miR-126的表達［37］。但是，有報道也得出相反的結論。Yang等［54］發(fā)現(xiàn)，在OSCC-15細胞系中過表達miR-126可以明顯降低EGFL7的蛋白水平，轉染miR-126的抑制劑又可以明顯上調EGFL7的蛋白水平，表明在OSCC-15細胞系中miR-126與EGFL7是負相關關系。本研究RT-qPCR結果顯示，egfl7 mRNA變化與miR-126趨勢一致，且miR-126與egfl7 mRNA的表達高度正相關（R=0.65，P＜0.05），分析原因認為，miR-126在不同的生理和病理情況下可能存在截然不同的調控機理。

通過PCR或基因芯片的方法可以對人類臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的miRNA的表達譜進行測試，結果發(fā)現(xiàn)高表達的miRNAs有miR-221/222、miR-2、let-7家族成員、miR-17-92簇、miR-23-24簇和miR-126，以上成員中，miR-126目前被認為是內皮細胞系和造血祖細胞中特異性表達［22］；采用高通量測序方法對HUVECs在標準條件和缺氧條件下的miRNA進行了篩選后發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-126占到了總量的40%［47］；敲除miR-126后，導致斑馬魚血管完整性受損出血［17］；敲除內皮細胞特異性miR-126后，小鼠出現(xiàn)肢體嚴重水腫、出血及血管破裂，存活的突變體小鼠視網(wǎng)膜血管化表現(xiàn)異常，提示，miR-126在血管新生中發(fā)揮重要作用［49］；miR-126敲除的小鼠胚胎表現(xiàn)為血管新生出芽滯后，胚胎大面積出血及部分胚胎致死［49，25］，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是血管新生生長因子信號降低，導致內皮細胞生長、出芽及粘附能力下降。研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可以通過轉錄后水平抑制spred1、pik3r2、vcam1等多個靶點來發(fā)揮作用［20］。本研究通過Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)，心梗后伴隨著心肌miR-126表達的下調，其調控靶點pik3r2（又稱p85-?）表達顯著升高，運動干預后心梗心臟PIK3R2、SPRED1表達顯著降低，與MCE組相比，MIE組SPRED1降低更加顯著。PIK3R2是PI3K調節(jié)亞基p85之一，能夠產(chǎn)生3-多磷酸肌醇，是PI3K/AKT信號通路的負性調控因子；Sprouty是一類廣泛表達于全身組織器官的軟脂酰化磷蛋白家族，對生長因子信號呈負調控［27］，特別是SPRED1可作為Ras/ MAP激酶信號通路的細胞內抑制劑，抑制細胞的增殖和遷移功能。由此證實，間歇運動可能通過上調心梗心臟心肌miR-126表達，靶向pik3r2、spred1信號通路，促進心肌血管新生，進而提升了心功能。

20世紀初，心梗病人的標準治療方案是臥床休息至少6周，指導策略是梗死組織需要充分休息，過早的工作可能會造成未愈合的左心室瘢痕破裂。后來發(fā)現(xiàn)，長時間臥床休息并不是治療心臟病的最好干預方法，相反，會導致肌肉營養(yǎng)不良、骨質丟失、心血管功能下降等“去適應”癥狀［14，26，44］；Morris等［31］通過研究發(fā)現(xiàn)，售票員患心臟疾病的危險性要比公交司機低得多（1：2.2）；20世紀60年代后，大量的動物和人體實驗研究已經(jīng)證明，運動是心臟病人康復的最重要手段之一。但是，目前對于運動的方法和強度水平的選擇仍然存在爭議［11，18］。?ivind Rognmo等［36］通過對4 846個臨床冠心病患者研究發(fā)現(xiàn)，無論是高強度還是中等強度運動對患者心血管系統(tǒng)所造成的風險都很低，且高強度運動可帶來更顯著的效益；運動量相同的情況下，4周持續(xù)和間歇運動干預后，心梗心臟心功能出現(xiàn)顯著提高，但是，兩種運動方式之間沒有顯著性差異［30］；總運動時間相同的情況下，8周運動干預后，心梗大鼠心功能檢測結果顯示，間歇運動效果要優(yōu)于持續(xù)運動［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，心梗后心室收縮能力降低，心功能下降；總運動量相同情況下，8周持續(xù)和間歇運動都可以有效提升心梗心臟的心功能，且間歇運動效果更明顯。分析可能機制：持續(xù)和間歇運動干預使存活心肌細胞發(fā)生肥大，刺激梗死部位和周邊區(qū)血管增生，側支循環(huán)增多，存活心肌血供得到改善，使缺血或供血不足的心肌細胞比例有所下降，心肌膠原纖維發(fā)生降解，抑制了心梗面積的持續(xù)擴大，刺激心肌細胞增殖［7］，相對無任何干預的對照組，可有效減小心梗面積，改善心功能。間歇運動干預可使心梗心臟在短暫高強度運動后獲得一定休息時間，高強度運動對機體V˙O2max的提高、心臟泵血功能的改善效果更加明顯［3］；間歇運動也有利于心臟低氧誘導因子1（HIF-1）的活化，HIF-1表達上調能增強心肌細胞對急性缺血性損傷的耐受，在缺血性心臟病中具有重要保護意義［1］，這或許是間歇運動優(yōu)于持續(xù)運動的原因。

多方面因素造成了運動維系心血管系統(tǒng)健康的有益效應，并延緩了心臟疾病的進展［9］。血管新生就是一個重要的原因。哺乳動物心梗后梗塞區(qū)心肌細胞由于缺血缺氧而引起壞死、凋亡，造成心肌數(shù)目減少，嚴重損害心功能。心梗心臟的康復過程血管新生非常關鍵，心梗心臟的血管新生是通過刺激心肌缺血區(qū)小血管生長，實現(xiàn)心肌缺血區(qū)的自我搭橋，從而建立缺血心肌的側枝循環(huán)，改善心肌缺血區(qū)的血流狀況。本研究發(fā)現(xiàn)，心梗運動組心肌組織中CD31蛋白陽性顆粒表達顯著高于心梗組（P＜0.01）；間歇運動組心肌組織中CD31蛋白陽性顆粒表達顯著高于持續(xù)運動組（P＜0.05）。提示，間歇運動可誘導梗死邊緣區(qū)心肌血管新生，改善血流狀況和內皮細胞功能，且效果優(yōu)于持續(xù)運動。VSMC作為一種非終末分化細胞，具有兩種表型特征，收縮表型和合成表型。收縮表型VSMC細胞核較小，胞漿收縮蛋白含量豐富，收縮能力較強；合成表型VSMC細胞核體積較大，收縮能力減弱，分泌胞外基質能力顯著增強。本研究發(fā)現(xiàn)，間歇運動干預可使心梗心臟梗死邊緣區(qū)VSMC發(fā)生表型逆轉，由合成型轉化為收縮型。分析可能原因為，8周的間歇運動干預使新生毛細血管逐漸發(fā)育生成具有VSMC的微、小動脈，進一步提高梗死邊緣區(qū)血液的輸送能力，從而改善心功能。

4 結論

持續(xù)和間歇運動顯著上調大鼠心梗心臟miR-126和miR-17-5p表達，且miR-126表達的變化率更大；持續(xù)和間歇運動顯著激活心梗心臟EGFL7/miR126-PIK3R2/SPRED1通路，抑制其下游靶蛋白PIK3R2/SPRED1表達，促進心臟梗死邊緣區(qū)血管新生，產(chǎn)生心臟保護效應，且間歇運動的保護效應優(yōu)于持續(xù)運動。

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Continuous and Interval Exercise Intervention on the Expression of Myocardial miRNAs Related to Angiogenesis and Activitation of EGFL7/miR126-PIK3R2 /SPRED1 on Protecting the Hearts of MI Rats

SONG Wei1，TIAN Zhen-jun1，Shao-jun Du2

目的：探討持續(xù)和間歇運動對心梗大鼠心臟血管新生相關miRNAs表征及可能的效應機制。方法：3月齡雄性SD大鼠，隨機分為假心梗組（S）、心梗組（MI）、心梗持續(xù)運動組（MCE）、心梗間歇運動組（MIE），每組10只。采用左脈前降支結扎制備心梗模型。MCE和MIE組術后1周進行跑臺適應性訓練（15 m/min，30 min/天×5天），之后MCE組以16 m/min （50%～60%V˙O2max）速度持續(xù)運動64 min/天，5天/周×8周；MIE組以25 m/min×4 min（85%～90%V˙O2max）和15 m/min×3 min（50%～60%V˙O2max）速度依次交替運動49 min/天，5天/周×8周，訓練結束后次日測定心功能。Masson染色觀察分析心肌膠原容積分數(shù)（CFV），免疫組化觀察心肌CD31和α-SMA表達，RT-qPCR檢測心肌血管新生相關miRNAs、egfl7、pik3r2和spred1表達，Western Blotting檢測心肌PIK3R2、SPRED1和VEGF表達。結果：與S組比較，MI組心肌miR-222表達顯著上調，miR-126表達顯著下調，心肌CFV顯著增加，心功能下降；與MI組比較，MIE組心肌miR-17-5p、miR-126表達均顯著上調，MCE和MIE組CD31、α-SMA陽性顆粒顯著增加，VEGF和egfl7 mRNA表達顯著上調，且egfl7 mRNA與miR-126表達呈高度正相關，PIK3R2、SPRED1蛋白及其mRNA表達均顯著下調，心功能顯著提升，且間歇運動優(yōu)于持續(xù)運動。結論：間歇運動可顯著上調心梗心臟miR-126和miR-17-5p表達，且miR-126表達的變化率更大；持續(xù)和間歇運動顯著激活心梗心臟EGFL7/miR126-PIK3R2/SPRED1通路，抑制其下游靶蛋白PIK3R2/SPRED1表達，促進心臟梗死邊緣區(qū)血管新生，產(chǎn)生心臟保護效應，且間歇運動的保護效應優(yōu)于持續(xù)運動。

心肌梗死；持續(xù)運動；間歇運動；miR-126；PIK3R2/SPRED1；心肌血管新生

Objectives:This study was carried out to investigate the continuous and interval exercise intervention on the expression of myocardial miRNAs related to angiogenesis and possible mechanism.Methods:40 three-month-old male SD rats were randomly divided into four groups: sham-operated group（S），myocardial infarction group（MI），MI with continuous exercise group （MCE）and MI with interval exercise group（MIE）.MI model was induced by ligation of the left anterior descending（LAD）coronary artery.After five days'adaptive training（15m/min，30min/d× 5d），rats in MCE group performed continuous exercise for 64min/d，5d/wk×8wk at the speed of 16m/min（50%～60%V˙O2max），and MIE intervals alternated between 4min at 25m/min（85%～90%V˙O2max）and 3min at 15m/min（50%～60%V˙O2max）for 49min/d，5d/wk×8wk.Cardiac function was measured the next day after 8wk training.CFV was analyzed through Masson'trichrome staining;CD31 and α-SMA were evaluated by immunohistochemistry.The expression of miRNAs related to angiogenesis，egfl7、pik3r2，spred1 were determined by RT-qPCR，while PIK3R2，SPRED1，VEGF were measured by Western Blotting.Results:Compared with S group，cardic function in MI was impaired with miR-222’upregulation and miR-126’downregulation;Compared with MI group，levels of miR-17-5p and miR-126 increased in MIE;meanwhile，in either MIE or MCE，positive granules of CD31 and α-SMA，VEGF，egfl7 mRNA were elevated and miR-126 was found to have a highly positive correlation with egfl7 mRNA.in addition，the protein levels of PIK3R2、SPRED1 and their mRNA decreased，and rats in MIE group shows better performance than their counterparts in MCE group.Conclusions:Interval exercise training promotes an increase in the expression of miR-126 and miR-17-5p，and an even bigger change rate in miR-126.Continuous and interval exercise could suppress the protein expression of PIK3R2/SPRED1 through the activation of EGFL7/miR126-PIK3R2/SPRED1，promote angiogenesis in peri-infarct zone，all of which result in the protection of the MI hearts in the end.The protective effect of interval exercise was better than continuous exercise.

myocardial infarction；continuous exercise；interval exercise；miR-126；PIK3R2/ SPRED1；myocardial angiogenesis

G804.7

：A

1000-677X（2017）02-0057-09

10.16469/j.css.20170200

2016-08-15；

：2016-12-05

國家自然科學基金資助項目（31371199）；陜西師范大學中央高?；緲I(yè)務費專項資金項目（GK201504001）。

宋偉，男，講師，在讀博士研究生，主要研究方向為運動心血管生物學，E-mail：tianzhj2012@hotmail.com；田振軍，男，教授，博士研究生導師，主要研究方向為運動心血管生物學，E-mail：tianzj611@hotmail.com；Shao-jun Du，男，教授，博士研究生導師，主要研究方向為骨骼肌和心肌分子遺傳學。

1.陜西師范大學體育學院暨運動生物學研究所，陜西西安710119；2.馬里蘭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，美國巴爾的摩21202。1.Institute of Sports and Exercise Biology，Shaanxi Normal University，Xi’an，Shaanxi 710119，China.2.University of Maryland，Baltimore，21202 USA.