甲狀旁腺激素1-34和雷奈酸鍶聯(lián)合使用對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥影響的研究

朱慶華，陶周善，謝加兵，楊 民，丁國正

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241001)

論 著

甲狀旁腺激素1-34和雷奈酸鍶聯(lián)合使用對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥影響的研究

朱慶華1，陶周善2，謝加兵2，楊 民2，丁國正2

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241001)

目的 研究聯(lián)合使用甲狀旁腺激素1-34 (PTH)和雷奈酸鍶(SR)對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥的影響。方法 50只雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組,n=5)及雙側(cè)去卵巢手術(shù)組(OVX組,n=45),正常情況下飼養(yǎng)12周后，隨機(jī)取5只OVX組大鼠和5只Sham組大鼠處死,取脛骨檢查骨質(zhì)疏松模型的建立情況。隨后剩下的40只OVX組大鼠隨機(jī)平均分成4組(10只/組)：OVX對照組、SR組、PTH組和PTH+SR組；SR組、PTH組和PTH+SR組分別給予SR灌胃(625 mg/kg，每周5次)、PTH皮下注射(20 μg/kg，每天1次)和相同劑量的SR灌胃及PTH皮下注射。藥物治療8周后將所有大鼠處死取脛骨行骨密度及微觀參數(shù)檢測，最大載荷及彈性模量的測定和血清P1NP、CTX-1含量的測定。結(jié)果 骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。與OVX對照組相比，SR組、PTH組和PTH+SR組各組大鼠脛骨骨密度顯著增加，骨小梁數(shù)量增加，差異均有顯著性意義，P<0.05。與OVX對照組比較，SR、PTH及PTH+SR組的Tb.N、Tb.Th、BV/TV及conn.D明顯增加，Tb.Sp明顯降低，差異有顯著性意義，P<0.05。SR組、PTH組和PTH+SR組的脛骨最大載荷及剛度值均高于OVX對照組；與OVX對照組比較，SR、PTH及PTH+SR組大鼠血清中P1NP表達(dá)量增加，而CTX-1表達(dá)降低，差異有顯著性意義，P<0.05。結(jié)論 聯(lián)合使用PTH和SR可以明顯增強(qiáng)去勢大鼠成骨活性，增加其骨密度，增強(qiáng)骨強(qiáng)度，對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療有疊加作用。

去勢大鼠；骨質(zhì)疏松癥；甲狀旁腺激素1-34；雷奈酸鍶

骨質(zhì)疏松癥是以骨密度下降為特征，骨折危險(xiǎn)度增加的全身骨骼疾病。60歲以上老年人患此癥的比例達(dá)60%～80%[1]。目前抗骨質(zhì)疏松藥物主要通過促進(jìn)骨形成和/或抑制骨吸收來防治骨質(zhì)疏松癥，如甲狀旁腺激素1-34(parathyroid hormone, PTH)、雙磷酸鹽類。臨床上主要通過聯(lián)合或序貫使用抗骨質(zhì)疏松藥物，最大限度對骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行干預(yù)。動物和臨床試驗(yàn)證明，PTH可以直接刺激骨形成而增加骨密度，有效降低骨折的發(fā)生率[2]。雷奈酸鍶(strontium ranelate, SR)作為解偶聯(lián)劑，同時(shí)促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收，對骨代謝具有雙向調(diào)節(jié)作用，增加骨密度，減少椎體和非椎體的骨折[3-4]。本實(shí)驗(yàn)將PTH和SR聯(lián)合應(yīng)用治療去勢大鼠，觀察其對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的影響，為臨床聯(lián)合藥物防治骨質(zhì)疏松癥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌性SD大鼠50只，鼠齡12周，體重平均(230±20) g，由上海斯萊克動物公司提供。所有動物均在溫度為(24±0.5) ℃，濕度為45%～50%，通風(fēng)良好的環(huán)境下飼養(yǎng)，每周稱體重 1 次。

1.2 主要材料和儀器

雷奈酸鍶干混懸劑(歐思美)；甲狀旁腺激素(1-34)(Sigma-Aldrich)；骨密度測量儀(Norland, XR36)；微計(jì)算機(jī)斷層掃描儀(Micro-CT)(SkyScan, 1076)；全自動生化分析儀 (Beckman, AU5800)；低速離心機(jī)(Thermo, ST40)；生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)(MTS-858，美國)；1型前膠原氨基末端肽(P1NP)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Sigma)；1型膠原C端肽(CTX-1)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Sigma)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 骨質(zhì)疏松動物模型的建立

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成2組，Sham組(n=5)和OVX組(n=45)。Sham組接受假手術(shù)，即暴露雙側(cè)卵巢后不切除；OVX組接受去勢手術(shù)，即切除雙側(cè)卵巢。將所有大鼠稱重，按3 mL/kg的劑量向腹腔注射10%的水合氯醛，沿背部縱行切開皮膚后行鈍性分離，于脊柱旁開0.5 cm處鈍性分開肌肉組織，顯露卵巢脂肪包被組織，輕輕提起卵巢，于輸卵管卵巢交界處用絲線結(jié)扎，完整摘除雙側(cè)卵巢后縫合創(chuàng)口。正常環(huán)境下飼養(yǎng)12周后，從OVX組隨機(jī)選取5只大鼠與5只Sham組大鼠處死后取下脛骨，用骨密度測量儀檢測骨密度，以檢查骨質(zhì)疏松模型建立情況。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物的藥物治療

剩下的40只OVX組大鼠隨機(jī)平均分成4組(10只/組)：OVX對照組、SR組、PTH組和PTH+SR組，連續(xù)給予8周的藥物治療，具體方法如下：SR組、PTH組和PTH+SR組分別給予SR灌胃(625 mg/kg，每周5次)、PTH皮下注射(20 μg/kg，每天1次)皮下注射和相同劑量的SR灌胃及PTH皮下注射，OVX對照組給予相同劑量的生理鹽水灌胃和皮下注射。實(shí)驗(yàn)大鼠每周稱重，調(diào)整藥物劑量。

1.3.3 各組大鼠右側(cè)脛骨密度及骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的測定

所有大鼠在藥物治療8周后處死，完整取下右側(cè)脛骨，用骨密度測量儀檢測骨密度，脛骨采用10%的多聚甲醛固定，后用Micro-CT進(jìn)行掃描檢測。具體掃描條件為：圖像矩陣為2048×2048，整合時(shí)間為200 ms，能量/強(qiáng)度為70 kVp、114 μA、8 W，以0°旋轉(zhuǎn)進(jìn)行掃描。掃描完成后，對脛骨干骺端感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)進(jìn)行三維重建，以最低閾值為160提取圖像信息。獲得大鼠脛骨感興趣區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)：骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)及連接密度(connective density，Conn.D)。

檔案管理的信息價(jià)值是不容忽視的，如果在保存檔案是不能保證檔案信息的安全性，那么檔案的保存將會失去意義。目前，在我國檔案的保存并沒有什么相關(guān)的安全制度，檔案的信息也不能得到安全性的保障，所以管理檔案信息的安全對于我們來說是非常關(guān)鍵的。現(xiàn)在我們把檔案管理與物聯(lián)網(wǎng)中，而網(wǎng)絡(luò)終究是虛擬的，沒有安全性可言，并不能是我們的檔案得到安全性的保障，因此網(wǎng)絡(luò)的虛擬性是造成檔案管理缺乏安全的重要原因。

1.3.4 各組大鼠右側(cè)脛骨最大載荷和彈性模量的測定

骨三點(diǎn)彎曲試實(shí)取右側(cè)脛骨，將其置于MTS-858型生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)上，設(shè)置支點(diǎn)跨距17 mm，以中點(diǎn)為加壓點(diǎn)，加載速度2 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，根據(jù)曲線計(jì)算最大載荷和剛度。

1.3.5 各組大鼠血清P1NP、CTX-1含量的測定

大鼠處死前心臟取血2 mL，4 ℃靜置30 min后，以2000 r/min(離心半徑=10 cm)離心10 min，取血清。采用ELISA法于波長450 nm處測定大鼠血清中P1NP、CTX-1的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

骨密度測量儀檢測發(fā)現(xiàn)，Sham組大鼠的脛骨骨密度為(237.56±31.48)mg/cm2，而OVX組大鼠的脛骨骨密度為(170.54±30.44)mg/cm2。相對Sham組，OVX組大鼠的骨密度下降了39.30%(P<0.05)，骨質(zhì)疏松動物模型建立成功。

2.2 各組大鼠藥物治療后脛骨骨密度變化

藥物治療8周后，各組大鼠脛骨骨密度如表1所示。相對于OVX對照組，SR組、PTH組、PTH+SR組各組脛骨骨密度分別增加了20.33%、24.78%、39.68%，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠脛骨干骺端感興趣區(qū)域骨密度及骨微觀參數(shù)情況

1)與OVX對照組比較,P<0.05; 2)與SR組比較，P<0.05; 3)與PTH組比較,P<0.05

2.3 Micro-CT評估結(jié)果

Micro- CT對各組大鼠脛骨干骺端感興趣區(qū)域進(jìn)行掃描的結(jié)果如圖1所示，SR組、PTH組、PTH+SR組骨小梁的數(shù)量明顯多于OVX對照組，而且骨小梁聯(lián)系緊密，骨小梁更粗。與OVX對照組比較，SR、PTH及PTH+SR組的Tb.N、Tb.Th、BV/TV及Conn.D明顯增加，且PTH+SR組最高，Tb.Sp明顯降低，PTH+SR組最低，差異均有顯著性意義，P<0.05。見表1。

圖1 各組大鼠脛骨干骺端感興趣區(qū)域Micro-CT掃描結(jié)果Fig 1 Micro-CT scan results of the interested area in tibia epiphysis

2.4 骨生物力學(xué)結(jié)果

在脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)中，SR組、PTH組和PTH+SR組的最大載荷及剛度值均高于OVX對照組，PTH+SR組最高，且各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)的結(jié)果

Tab 2 Three point bending test parameters of rats tibia

組別最大載荷(N)剛度(N/mm)OVX對照組97.9±13.5188.6±17.4SR組171.3±29.21)274.4±27.71)PTH組 176.8±33.21)2)285.9±30.21)2)PTH+SR組198.7±35.81)2)3)337.6±34.41)2)3)

1)與OVX對照組比較,P<0.05; 2)與SR組比較，P<0.05; 3)與PTH組比較,P<0.05

2.5 血清P1NP和CTX-1含量檢測

各組大鼠在藥物治療8周后，血清P1NP、CTX-1含量檢測結(jié)果如表3所示。與OVX對照組比較，SR、PTH及PTH+SR組大鼠血清P1NP含量降低，且PTH+SR組最高，差異均有顯著性意義(P<0.05)；與OVX對照組比較，SR、PTH及PTH+SR組大鼠血清CTX-1含量升高(P<0.05);SR、PTH及PTH+SR三組間比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清P1NP和CTX-1含量

1)與OVX對照組比較,P<0.05; 2)與SR組比較，P<0.05; 3)與PTH組比較,P<0.05

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥的病因復(fù)雜，是一種長期的慢性疾病[5]。臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的藥物種類繁多，主要分為基礎(chǔ)藥物、骨轉(zhuǎn)換抑制劑、骨形成促進(jìn)劑和鍶鹽類的解偶聯(lián)劑。對于骨質(zhì)疏松癥的治療，本實(shí)驗(yàn)擬通過聯(lián)合使用藥物，通過藥物間的相互作用，相互取長補(bǔ)短達(dá)到最大程度的療效。雌性大鼠的骨代謝過程相對穩(wěn)定，特別是切除卵巢后的激素改變和骨骼變化與人類相似[6]。本研究采用雌性大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，切除卵巢的雌性大鼠在飼養(yǎng)12周后骨密度相對于Sham組大鼠下降39.30%(P<0.05)，表明我們的骨質(zhì)疏松動物模型的建立是可行的。

在機(jī)體內(nèi)，PTH參與鈣和磷的代謝過程[7]，主要通過激活環(huán)腺苷酸/蛋白激酶A (cAMP/PKA)、磷脂酶C/蛋白激酶C (PLC/PKC)等第二信使系統(tǒng)誘導(dǎo)成骨或破骨作用[8]。動物研究已經(jīng)證明，小劑量間歇性的給予PTH有促骨生成作用[9]。由于PTH半衰期短，本實(shí)驗(yàn)采用20 μg/kg和每天1次的皮下注射，實(shí)際就是一種小劑量間歇的給藥方式。藥物治療8周后，PTH組去勢大鼠骨密度和骨微結(jié)構(gòu)較OVX對照組改善，證明了PTH小劑量間歇性給藥的促成骨作用。鍶鹽類藥物在促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收方面可同時(shí)作用，具有雙向調(diào)控機(jī)制[10-11]。促進(jìn)骨形成的調(diào)控，SR通過增加膠原蛋白與非膠原蛋白的合成，同時(shí)提高細(xì)胞堿性磷酸酶、Ⅰ型骨膠原水平，增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖及分化，增加成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成。抑制骨吸收的調(diào)控，SR能劑量依賴地下調(diào)成骨細(xì)胞內(nèi)白介素(IL)-6水平從而抑制破骨細(xì)胞的增殖及分化，抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，SR組去勢大鼠在接受藥物8周后，骨密度明顯提高，脛骨干骺端的骨量也明顯增加。

PTH聯(lián)合二膦酸鹽類對骨質(zhì)疏松的治療并沒有明顯的疊加作用，不管是在動物體內(nèi)，還是臨床上[13-14]，甚至二膦酸鹽類會影響到骨小梁的質(zhì)量。原因可能是由于PTH成骨作用有自己的時(shí)段性，二磷酸鹽類抑制破骨細(xì)胞活性，同時(shí)會干擾骨吸收和骨形成的偶聯(lián)關(guān)系，因此二磷酸鹽類使用并不能很好的和PTH所產(chǎn)生的促進(jìn)成骨作用相疊加。在增加皮質(zhì)骨厚度和松質(zhì)骨骨小梁體積密度方面，雷奈酸鍶比其他二磷酸類藥物的作用更明顯[15-16]。本實(shí)驗(yàn)對去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型聯(lián)合使用PTH和SR治療，實(shí)驗(yàn)中使用的SR是每周5次，所以可以很好地和PTH作用療效疊加，同時(shí)SR也有部分成骨效果，血液中P1NP及CTX-1濃度的改變進(jìn)一步的證實(shí)這點(diǎn)。在藥物治療8周后分析Micro-CT掃描結(jié)果，從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)相對于單獨(dú)使用PTH或SR，聯(lián)合使用兩種藥物對去卵巢大鼠脛骨骨密度提高更明顯，明顯增加脛骨干骺端的骨量。各組大鼠脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)也表明PTH+SR組有著最高的最大載荷及剛度值。

在本實(shí)驗(yàn)中樣本數(shù)量有限，藥物治療時(shí)間為8周，時(shí)間相對較短。就目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以表明，聯(lián)合使用PTH和SR對于去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療可以明顯增強(qiáng)成骨活性，增加其骨密度，增強(qiáng)骨強(qiáng)度，且效果較單獨(dú)使用任何一種藥物要明顯，兩種藥物有協(xié)同作用。我們認(rèn)為SR是比較適合和PTH聯(lián)合使用的抗骨質(zhì)疏松藥物，聯(lián)合使用PTH和SR對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療有疊加作用。具體兩種藥物聯(lián)合使用的合適劑量和聯(lián)合藥物增加的不良反應(yīng)有待下一步研究闡明。

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Effect of combined use of parathyroid hormone 1-34 and strontium ranelate on osteoporosis in ovariectomized rats

ZHU Qinghua1, TAO Zhoushan2, XIE Jiabing2, YANG Min2, DING Guozheng2

(1.GraduateSchool,WannanMedicalCollege,Wuhu241001,China; 2.DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofWannanMedicalCollege,Wuhu241001,China)

Objective To investigate the effect of combined use of parathyroid hormone 1-34 (PTH) and strontium ranelate (SR) on osteoporosis in ovariectomized rats. Methods Fifty female SD rats were sham operated (Sham,n=5) and ovariectomized (OVX,n=45). After 12 weeks, five rats of each group were randomly selected to test the establishment of osteoporosis model. Then all rats in OVX group were randomly divided into 4 groups(10 rats /group): OVX control group, SR group, PTH group and PTH+SR group. The rats were given 625 mg/kg SR, 5 times a week by intragastric administration in SR group, 20 g/kg PTH once a day by subcutaneous injection in PTH group, and the combined use of SR and PTH in PTH+SR group. After 8 weeks of drug treatment, all rats were executed to examine the tibial bone mineral density and bone histomorphometry parameters, maximum load and elastic modulus, and test serum P1NP and CTX-1 levels. Results Osteoporosis rat model was established successfully. And compared with the OVX control group, bone mineral density increased and bone histomorphometry parameters improved in SR group, PTH group and SR+PTH group. Compared with the OVX control group, Tb.N, Tb.Th, BV/TV, Conn.D improved and Tb. Sp reduced evidently in SR group, PTH group and SR+PTH group, and the difference was statistically significant(P<0.05). The maximum load and stiffness of tibia in SR group, PTH group and SR+PTH group were higher than OVX group; compared with the OVX control group, the P1NP parameter of rats serum improved and the CTX-1 parameter of rats serum reduced in SR group, PTH group and SR+PTH group, and the difference was statistically significant(P<0.05). Conclusion PTH and SR can significantly enhance the osteogenic activity, increase the bone mineral density, and enhance the strength of the bone, and they have a superposition effect on osteoporosis in ovariectomized rats.

ovariectomized rats; osteoporosis; parathyroid hormone 1-34; strontium ranelate

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81341054)

朱慶華(1992-)，男，碩士研究生。E-mail：zhuqinghuawnmc@163.com

丁國正，主任醫(yī)師。E-mail：dingguozheng@medmail.com.cn

10.11724/jdmu.2017.01.02

R737. 33

A

1671-7295(2017)01-0008-05

朱慶華，陶周善，謝加兵，等.甲狀旁腺激素1-34和雷奈酸鍶聯(lián)合使用對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥影響的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(1)：8-12.

2016-11-26；

2016-12-29)