核定位信號肽在超聲靶向破壞微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染治療犬心肌梗死中的促進(jìn)作用

崔晶晶 曹省 陳金玲 鄧傾 王益佳 周青 胡波

·實(shí)驗(yàn)研究·

核定位信號肽在超聲靶向破壞微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染治療犬心肌梗死中的促進(jìn)作用

崔晶晶 曹省 陳金玲 鄧傾 王益佳 周青 胡波

目的 探討超聲靶向破壞微泡（UTMD）技術(shù)聯(lián)合核定位信號（NLS）肽增強(qiáng)犬心肌hAng-1基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的可行性及應(yīng)用價(jià)值。方法構(gòu)建犬急性心肌梗死模型并分組進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染治療，每組8只。A組：建模成功后未行治療，即空白對照組；B組：建模成功后超聲介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染；C組：建模成功后超聲介導(dǎo)質(zhì)粒DNA加經(jīng)典NLS肽轉(zhuǎn)染；D組：建模成功后超聲介導(dǎo)質(zhì)粒DNA加突變NLS肽轉(zhuǎn)染；E組：建模成功后超聲介導(dǎo)質(zhì)粒DNA加經(jīng)典NLS肽和入核阻滯劑轉(zhuǎn)染。建模后轉(zhuǎn)染前，HE染色觀察心肌梗死后病理變化情況。轉(zhuǎn)染后3 d，心肌冰凍切片檢測EGFP標(biāo)記的hAng-1基因表達(dá)情況，RT-PCR和Western Blot分別從基因和蛋白水平方面檢測心肌組織hAng-1基因表達(dá)效率。轉(zhuǎn)染后28 d，α-SMA免疫組化定位新生毛細(xì)血管，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)新生微血管密度；Masson染色及心臟大體標(biāo)本評價(jià)心肌梗死區(qū)纖維化程度及面積。建模前、建模后1周基因轉(zhuǎn)染前及基因轉(zhuǎn)染后28 d分別應(yīng)用二維超聲心動圖檢測各組犬射血分?jǐn)?shù)及室壁運(yùn)動情況，比較各組基因治療效果。結(jié)果①A、B、C組心肌組織中綠色熒光蛋白表達(dá)量逐漸增高，C、D、E組逐漸減少，Western Blot和RT-PCR檢測結(jié)果顯示hAng-1蛋白及基因表達(dá)趨勢與綠色熒光蛋白一致，C組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。②免疫組化結(jié)果顯示C組毛細(xì)血管密度最高，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；Masson染色顯示A、B、C組心肌纖維化程度依次減低，C、D、E組依次增高。③建模后1周，5組犬均可見節(jié)段性室壁運(yùn)動減低且射血分?jǐn)?shù)明顯減低，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；蜣D(zhuǎn)染后28 d，A、E組心功能明顯減低，B、D組輕度減低，C組輕度增高，C組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論UTMD聯(lián)合NLS可高效、靶向地介導(dǎo)質(zhì)粒DNA在缺血心肌內(nèi)的表達(dá)，并促進(jìn)血管新生，改善心肌纖維化，這種非侵入性的技術(shù)在心臟基因治療方面將有較好的應(yīng)用前景。

非病毒載體；超聲靶向破壞微泡；核定位信號；基因治療；心肌梗死；犬

自1990年美國國立衛(wèi)生研究院健康臨床中心實(shí)施首例使用逆轉(zhuǎn)錄病毒治療嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病開始［1］，基因治療即成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。其成功的關(guān)鍵在于構(gòu)建高效基因轉(zhuǎn)染體系［2］。基因載體的靶向性、安全性及有效性是基因治療領(lǐng)域需要攻克的難題。新型超聲靶向微泡破壞系統(tǒng)、生物素-親和素系統(tǒng)及抗原-抗體靶向結(jié)合（ultrasound-targeted microbubbles destruction，UTMD）等各種非病毒載體系統(tǒng)均有較好的靶向性和安全性，但在體實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率不理想，主要原因是胞漿-胞核轉(zhuǎn)運(yùn)低效，尤其是細(xì)胞處于有絲分裂后期及靜止期時(shí)。因此，讓更多外源性基因功能片段從胞漿進(jìn)入胞核是提高基因治療效果的關(guān)鍵。研究［3-4］表明，外源性大分子入核需要核定位信號（nuclear localization signal，NLS）的協(xié)助，通過耗能主動轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用UTMD聯(lián)合NLS構(gòu)建親核型基因載體，通過研究該載體在大動物心肌梗死模型中的基因轉(zhuǎn)染效率，觀察NLS在功能正常及突變后的基因轉(zhuǎn)染效應(yīng)，探討該載體能否在應(yīng)用UTMD促進(jìn)基因入胞的同時(shí)借助NLS促進(jìn)基因入核，從而探索改善基因治療效率的方法。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

雄性成年雜種犬48只，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，平均體質(zhì)量（16.3±3.2）kg。

二、實(shí)驗(yàn)試劑及制作方法

1.hANGPT1-EGFP質(zhì)粒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司），大腸桿菌中擴(kuò)增，然后與WizardTM Maxiprep DNA純化系統(tǒng)分離，該質(zhì)粒含有巨細(xì)胞病毒，啟動子調(diào)控的編碼綠色熒光蛋白cDNA序列，其表達(dá)產(chǎn)物可在活細(xì)胞中直接檢測。

2.聲諾維微泡（意大利博萊科公司），59 mg六氟化硫微泡加入0.9%生理鹽水5 ml，充分振蕩形成微泡，平均直徑約2.5 μm，濃度為2×108～5×108個/ml。

3.NLS肽（PKKKRKV，HPLC：98.61%，分子質(zhì)量883.1，上?？齐纳锟萍加邢薰荆?，來源于SV40病毒的大T抗原，避光儲存于-20℃冰箱，使用前室溫放置30min后離心，300r/min，5min，無菌環(huán)境下將1mg粉劑溶于1ml磷酸鹽緩沖液中，避光儲存于-20℃冰箱。

4.明膠海綿顆粒（250 μm，杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司），0.5 ml明膠海綿顆粒與0.5 ml生理鹽水混勻備用。

三、實(shí)驗(yàn)器械

5 F冠狀動脈造影導(dǎo)管，2.8 F微導(dǎo)管，粗導(dǎo)絲，0.014微導(dǎo)絲，6 F動脈鞘管（上海泰爾茂醫(yī)療產(chǎn)品有限公司）；GE Vivid Q便攜式彩色多普勒超聲診斷儀（頻率1.7～3.3 MHz）；Philips FD 20數(shù)字減影血管造影機(jī)，LEAD 7000心電生理監(jiān)測儀（四川錦江電子科技有限公司），IX51激光共聚焦掃描熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

四、模型制作

犬禁食、禁飲8h后，靜脈注射戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，根據(jù)動物反應(yīng)情況每30～60 min靜脈追加戊巴比妥鈉50 mg。氣管插管，機(jī)械通氣，備皮，將犬仰臥固定于數(shù)字減影血管造影機(jī)臺上，心電圖監(jiān)測，保溫。建立靜脈通路，靜滴生理鹽水及利多卡因，術(shù)區(qū)碘伏消毒，鋪無菌被單。觸摸犬右后肢股動脈搏動位置，分離股動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端。穿刺股動脈并植入6F動脈鞘管，注入肝素1000U。經(jīng)動脈鞘管引入5 F導(dǎo)管，透視下將導(dǎo)管頭搭至左冠狀動脈竇口，并行造影確認(rèn)。經(jīng)5 F導(dǎo)管引入微導(dǎo)管，精確導(dǎo)入至左冠狀動脈第二對角支開口，經(jīng)微導(dǎo)管將明膠海綿顆粒（約1.0 mm3）推注到左冠狀動脈第二對角支遠(yuǎn)端，造影確認(rèn)血流阻斷，心電圖ST段出現(xiàn)弓背樣抬高，確認(rèn)為急性左室心肌梗死模型制備成功。

五、實(shí)驗(yàn)方法及各參數(shù)檢測

1.實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)轉(zhuǎn)染方式不同將急性心肌梗死犬隨機(jī)分為5組，每組8只。A組：建模成功后未行治療，即空白對照組；B組：建模成功后超聲介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染；C組：建模成功后超聲介導(dǎo)質(zhì)粒DNA加經(jīng)典NLS肽轉(zhuǎn)染；D組：建模成功后超聲介導(dǎo)質(zhì)粒DNA加突變NLS肽轉(zhuǎn)染；E組：建模成功后超聲介導(dǎo)質(zhì)粒DNA加經(jīng)典NLS肽和入核阻滯劑轉(zhuǎn)染。

2.NLS與hANGPT1-EGFP復(fù)合物的制備：按照本課題組前期研究方法［5］，利用高效液相色譜法將NLS肽進(jìn)行純化，然后與hANGPT1-EGFP以最佳摩爾比104∶1混合，室溫下溫孵育30 min。

3.基因轉(zhuǎn)染：動物模型建成后1周，各組分別經(jīng)靜脈注入1 ml治療試劑，B、C、D、E組采用超聲基因轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行心前區(qū)超聲輻照，1 MHz，1.5 W/cm2，輻照10 s，間隔5 s，共5 min［6］。

4.取材：建模后轉(zhuǎn)染前隨機(jī)挑選3只犬，取梗死區(qū)組織以備HE染色。轉(zhuǎn)染3 d后，隨機(jī)挑選3只犬，取梗死周邊區(qū)心肌組織各100 g用于心肌冰凍切片、RT-PCR及Western Blot檢測。轉(zhuǎn)染后28 d，隨機(jī)挑選2只犬，取梗死區(qū)心肌組織100 g用于Masson染色，取梗死周邊區(qū)心肌組織100 g用于免疫組化及免疫熒光檢測；隨機(jī)挑選3只犬，取心臟大體標(biāo)本行HE染色，觀察心肌梗死情況。

5.心肌病理形態(tài)評價(jià)：取心肌組織于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下初步觀察心肌病理組織學(xué)表現(xiàn)。

6.質(zhì)粒表達(dá)情況評價(jià)：①心肌冰凍切片檢測：取液氮凍存的心肌組織做冰凍切片，在激光共聚焦掃描熒光顯微鏡下評估EGFP標(biāo)記的質(zhì)粒表達(dá)情況，488 nm激發(fā)波長，每個樣品重復(fù)測量8～10次；②基因轉(zhuǎn)染效率及蛋白表達(dá)量檢測：分別提取心肌組織總RNA及蛋白，Western Blot和RT-PCR法分別檢測hAng-1基因蛋白表達(dá)效率及轉(zhuǎn)染效率。

7.新生毛細(xì)血管密度評價(jià)：α-SMA免疫組化檢測新生毛細(xì)血管密度，取心肌標(biāo)本，石蠟包埋，脫蠟，H2O2浸泡，清洗，孵一抗，二抗，磷酸鹽緩沖液清洗，加DAB顯色，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)棕黃色顆粒即用清水清洗掉DAB，蘇木素復(fù)染，烘干后用二甲苯透明，樹膠封片顯微鏡（BX52/BX52）下觀察，計(jì)數(shù)毛細(xì)血管數(shù)。

8.心臟功能的評價(jià)：每組各取5只犬于建模前、建模后1周基因轉(zhuǎn)染前、基因轉(zhuǎn)染后28 d應(yīng)用二維超聲心動圖測量左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室短軸縮短率（FS%）及收縮末期容量（ESV）。

9.心肌纖維化程度及梗死面積評價(jià)：Masson染色檢測心肌纖維化程度，正常心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，以此區(qū)分正常心肌和纖維化瘢痕組織；比較各組心肌纖維化程度。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0和Graphpad 6.01統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，所有數(shù)據(jù)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)判斷是否符合正態(tài)分布。多組間參數(shù)比較采用ANOVA分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間非參數(shù)比較行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩組間非參數(shù)比較行Mann-Whitney檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、動物模型制作情況

48只犬因麻醉意外死亡2只，室顫死亡3只，術(shù)后死亡3只，最終40只出現(xiàn)心電圖ST段抬高及冠狀動脈造影血流阻斷，成功建立心肌梗死模型，見圖1。

圖1 心肌梗死前后DSA圖

二、心肌病理形態(tài)評價(jià)

梗死后心肌組織HE染色可見梗死區(qū)心肌細(xì)胞核溶解消失，空泡樣變及核固縮，代之以瘢痕纖維組織，新生血管少或不明顯。見圖2。

三、質(zhì)粒表達(dá)情況評價(jià)

心肌冰凍切片檢測hAng-1基因的表達(dá)結(jié)果顯示各組均可見綠色熒光蛋白表達(dá)，且A、B、C組綠色熒光蛋白表達(dá)量逐漸增高，C、D、E組逐漸減少。見圖3。

Western Blot及RT-PCR檢測結(jié)果顯示hAng-1蛋白及基因表達(dá)趨勢與綠色熒光蛋白一致，C組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖4～6。

四、新生毛細(xì)血管密度評價(jià)

免疫組化顯示，新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)α-SMA免疫組化染色后呈棕黃色，A、B、C、D、E組新生毛細(xì)血管密度計(jì)數(shù)分別為（4.7±1.6）mm2、（69.8±4.9）mm2、（87.6±4.9）mm2、（67.7±4.2）mm2及（12.3±2.4）mm2，C組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖7。

五、心臟功能評價(jià)

建模前，各組犬室壁運(yùn)動和心功能均正常；建模后1周基因轉(zhuǎn)染前，各組犬左室運(yùn)動幅度及射血分?jǐn)?shù)均明顯減低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；基因治療后28 d，A、E組心功能明顯減低，B、D組輕度減低，C組輕度增高，C組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

六、心肌纖維化程度及梗死面積評價(jià)

Masson染色顯示心肌纖維化程度A、B、C組依次降低，D、E組增高（圖8）。

討論

圖2 心肌梗死區(qū)病理圖（HE染色，×200）

圖3 各組心肌冰凍切片的綠色熒光蛋白表達(dá)圖（×200）

圖4 各組Western-Blot檢測蛋白條帶

圖5 各組hAng-1蛋白相對表達(dá)示意圖

圖6 各組mRNA相對表達(dá)量示意圖

UTMD介導(dǎo)血管新生的基因治療為難治性心肌缺血提供了新策略。但研究［7］表明UTMD僅可以增加基因進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的數(shù)量而不能增加其進(jìn)入細(xì)胞核的數(shù)量，而外源性基因若要進(jìn)行有效表達(dá)需解決以下問題：①影響細(xì)胞膜通透性有效穿過胞膜屏障；②可逆性結(jié)合并濃縮DNA的能力；③借助載體復(fù)合物順利通過細(xì)胞核表面的核孔復(fù)合物（NPCs）穿過核膜屏障進(jìn)入細(xì)胞核的能力。因此探究如何提高基因入核的數(shù)量有望進(jìn)一步改善UTMD介導(dǎo)的非病毒轉(zhuǎn)染體系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，UTMD聯(lián)合NLS肽的心肌轉(zhuǎn)染效率明顯高于單獨(dú)UTMD介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染。

圖7 各組梗死周邊區(qū)新生毛細(xì)血管情況（×200）

圖8 各組心肌梗死區(qū)Masson染色圖（×200）

表1 二維超聲測量基因轉(zhuǎn)染前后各組犬心臟功能情況（±s）

表1 二維超聲測量基因轉(zhuǎn)染前后各組犬心臟功能情況（±s）

與C組比較，※P＜0.05。LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；LVEDD：左室舒張末期內(nèi)徑；LVESD：左室收縮末期內(nèi)徑；FS：左室短軸縮短率。

建模后1周基因轉(zhuǎn)染前組別基因轉(zhuǎn)染后28 d LVEF（%）LVEDD（mm）LVESD（mm）FS（%）LVEF（%）LVEDD（mm）LVESD（mm）FS（%）A組37.2±2.630.0±2.7※29.9±2.331.7±1.524.9±1.926.0±4.217.0±0.813.7±1.4※B組36.6±2.541.4±2.4※28.4±2.131.4±1.823.6±2.125.3±1.816.9±1.319.4±1.1※C組37.7±2.740.1±3.128.3±2.229.2±2.423.6±1.723.7±2.017.0±1.218.7±1.9 D組37.9±2.628.6±2.4※25.7±2.528.4±2.121.6±1.924.7±1.817.0±1.412.7±1.4※E組37.9±2.628.6±2.4※25.7±2.528.4±2.121.6±1.924.7±1.9※17.0±1.412.7±1.4※

NLS肽是一段富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸的短肽，是介導(dǎo)外源性基因入核的一段必要信號片段，且NLS肽具有抵抗酶降解的能力，從而提高了外源性DNA的穩(wěn)定性［8］。此外，NLS肽對外源性基因還具有壓縮和保護(hù)功能［9］。Jeon等［10］將NLS肽與PLGA納米微粒-質(zhì)粒DNA復(fù)合物相結(jié)合，可增強(qiáng)該基因載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化效率，無NLS肽組納米微粒轉(zhuǎn)化釋放可持續(xù)9d，但NLS肽結(jié)合組轉(zhuǎn)染時(shí)間增長，可持續(xù)轉(zhuǎn)染13d以上。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了UTMD聯(lián)合NLS肽的親核型基因轉(zhuǎn)導(dǎo)體系，在利用UTMD提高細(xì)胞膜通透性促進(jìn)外源性DNA進(jìn)入細(xì)胞漿的基礎(chǔ)上，再利用NLS肽促使外源性DNA進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)為了進(jìn)一步驗(yàn)證該親核型轉(zhuǎn)基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率及NLS肽在親核型轉(zhuǎn)基因復(fù)合物中的作用，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了NLS肽氨基酸突變組和核受體阻滯劑組。氨基酸突變可使NLS肽功能喪失，同時(shí)核受體阻滯劑可使攜帶hAng-1質(zhì)粒的NLS肽無法與核輸入受體相結(jié)合，因此無法通過核孔復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核。本實(shí)驗(yàn)中NLS肽與質(zhì)粒以最佳摩爾比104∶1混合后，由于NLS肽富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸，因此在中性環(huán)境中帶正電荷，能與帶負(fù)電荷的NLS通過靜電吸附非共價(jià)結(jié)合方式相偶聯(lián)，且靜電結(jié)合簡單方便，可維護(hù)NLS肽和DNA骨架的完整性［11］。同時(shí)NLS肽還可與帶負(fù)電荷的聲諾維微泡相結(jié)合，使更多目的基因在微泡破裂時(shí)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。由于超聲輻照是一個釋放能量的過程，超聲輻照下微泡的塌陷和破裂產(chǎn)生的射流能升高組織局部溫度，有助于NLS肽進(jìn)一步聯(lián)合超聲輻照幫助外源性基因趨向核膜并突破核膜，增加基因的入核效率。同時(shí)，基因入胞后NLS肽能減少DNA在胞漿中的降解，從而保護(hù)治療基因。

本實(shí)驗(yàn)基于以上理論，通過制備高效親核型轉(zhuǎn)基因復(fù)合物對心肌梗死后的大型動物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，親核型載體所載的hAng-1基因在犬缺血心肌內(nèi)得到良好表達(dá)，與其他組比較，hAng-1基因轉(zhuǎn)染及蛋白表達(dá)效率得到明顯提高，從而驗(yàn)證了UTMD與NLS肽構(gòu)建的親核型雙靶向載體可有效提高轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中C組新生毛細(xì)血管密度增多，心肌瘢痕組織面積和纖維化程度明顯降低，有效改善了心功能，為缺血性心臟病的基因治療提供一種新的基因轉(zhuǎn)移途徑。

雖然本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NLS肽在超聲靶向破壞微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染治療犬心肌梗死中可有效增加目的基因的傳遞，提高目的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)的效率，但是仍存在一些不足：①盡管NLS肽在分子生物學(xué)領(lǐng)域已被廣泛研究，但其介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的核輸入機(jī)制仍不夠明確；②本實(shí)驗(yàn)所選用的超聲參數(shù)參考了課題組前期研究成果及國外相關(guān)文獻(xiàn)，今后的研究仍需要對這種親核型非病毒載體復(fù)合物所用參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，為深入研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，UTMD聯(lián)合NLS肽可高效、靶向地促進(jìn)心肌基因轉(zhuǎn)染，這種非侵入性技術(shù)在心臟基因治療上很有前景，將在心血管疾病的治療中發(fā)揮重要作用。

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The enhanced effect of nuclear localization signal petide on treating canine myocardial infarction with ultrasound targeted microbubbles destruction mediated gene transfection

CUI Jingjing，CAO Sheng，CHEN Jinling，DENG Qing，WANG Yijia，ZHOU Qing，HU Bo
Department of Ultrasound，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Cardiovascular Disease，Wuhan 430060，China

ObjectiveTo explore the feasibility and application value on enhancing gene transfection by ultrasound targeted microbubbles destruction（UTMD）combined with nuclear localization signal（NLS）petide in treating canine myocardial infarction.MethodsForty canines were randomly divided into 5 groups after the models of myocardial infarction prepared.Group A：blank control group（n=8），group B：UTMD+pDNA（n=8），group C：UTMD+pDNA+cNLS（n=8），group D：UTMD+pDNA+mNLS（n=8），group E：UTMD+pDNA+cNLS+WGA（n=8）.Before transfection，HE staining was used to observe the pathological changes after myocardial infarction.3 d after gene transfection，the hAng-1 gene expression was detected in the frozen sections of the myocardium，RT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of hAng-1 from the gene and protein level.28 d after gene transfection，α-SMA immunohistochemistry was used to detect capillary density of peri-infarct area and microvessel density（MVD）was detected.Masson’s trichromatic staining and gross specimen were used to evaluate the degree and the area of myocardial fibrosis.Echocardiography was used before myocardial infarction，one week after myocardial infarction and 28 d after gene transfection，the left ventricular ejection fraction（LVEF）and the left ventricular wall motion were detected.The gene transfection efficiency of each group were evaluated and compared.Results①The expression of green fluorescence gradually increased from group A to group C，gradually decreased from group C to group E.Western Blot and RT-PCR showed that the hAng-1 protein expression trends and the gene expression trends in 5 groups was consistent with the expression of green fluorescence.②Immunohistochemical showed the capillary density of group C was the highest，the differences of group C was statistically significant compared with other groups（all P＜0.05）.Masson’s trichromatic staining and cardiac gross specimen showed that the degree and area of myocardial fibrosis were reduced in an order of group A，B，C and increased in an order of group C，D，E.③One week after myocardial infarction，the left ventricular walls motion and LVEF in 5 groups were significantly decreased，there was no significant difference among the groups；28 d after gene transfection，the LVEF of group A and group E were significantly reduced，the group B and group D were slightly reduced，the group C was slightly increased.The differences of group C was statistically significant compared with other groups（all P＜0.05）.ConclusionUTMD combined with NLS can be used to deliver plasmid DNA to the myocardium selectively and effectively，and it can promote neovascularization and improve myocardial fibrosis.This noninvasive technique is a promising method for cardiac gene therapy.

Nonviral vector；Ultrasound-targeted microbubbles destruction；Nuclear localization signal；Gene therapy；Myocardium；Canine

R542.2；R540.45

A

2016-10-23）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81471674）；國家青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81501495）

430060武漢市，武漢大學(xué)人民醫(yī)院超聲影像科心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

胡波，Email：115834683@qq.com